Artigo de método

Demonstrando um multi-resistente Mycobacterium tuberculosis Ampliação Microarray

DOI:

10.3791/51256

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25 de abril de 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Akonni Biosystems, Inc.

Neste artigo

Resumo

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Um microarray amplificação combina assimétrica PCR amplificação e hibridização microarray em uma única câmara, que simplifica significativamente o fluxo de trabalho microarray para o usuário final. Simplificar o fluxo de trabalho microarray é um primeiro passo necessário para a criação de diagnósticos à base de microarray que podem ser rotineiramente usados ​​em ambientes com recursos mais baixos.

Resumo

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Simplificar o fluxo de trabalho microarray é um primeiro passo necessário para a criação de MDR-TB diagnósticos baseados em microarray que podem ser rotineiramente usados ​​em ambientes com recursos mais baixos. Um microarray amplificação combina amplificação PCR assimétrico, a seleção tamanho do alvo, rotulagem alvo, e hibridização microarray dentro de uma única solução e em uma única câmara microfluídicos. Um método de processamento em lote é demonstrada com uma mistura mestre assimétrica 9-plex e baixa densidade elemento gel microarray para a genotipagem da multi-droga resistente Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). O protocolo aqui descrito pode ser concluída em 6 horas e fornecer genotipagem correcta com, pelo menos, 1.000 equivalentes de células de ADN genómico. A incorporação no chip passos de lavagem é possível, o que irá resultar num método amplicão totalmente fechada e sistema. O grau de multiplexagem, com um microarray de amplificação é relacionada ao número de pares de iniciadores que podem ser combinados num único mestre mix e ainda atingir a sensibilidade desejada e as métricas de desempenho especificidade, em vez do número de sondas que são imobilizados na matriz. Do mesmo modo, o tempo total de análise pode ser reduzido ou aumentado, dependendo do uso específico a que se destinam, questão de pesquisa, e limites desejados de detecção. No entanto, a abordagem geral agiliza significativamente o fluxo de trabalho microarray para o usuário final, reduzindo o número de etapas de processamento manualmente intensivos e demorados, e fornece um caminho bioquímico e microfluídicos simplificado para traduzir diagnósticos baseados em microarrays para a prática clínica de rotina.

Introdução

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Detecção precoce de casos e tratamento rápido são consideradas as estratégias de controle mais eficazes para reduzir o Mycobacterium tuberculosis (MTB) Transmissão 1, e agora há um amplo consenso na comunidade TB que um ponto de atendimento (POC) ou próximo teste POC para diagnosticar simultaneamente TB e resistência a drogas (DR) é necessária. Tecnologias como GeneXpert de Cepheid e outros testes de amplificação de ácidos nucleicos reduzir o tempo de diagnóstico para muitos pacientes com TB, e proporcionar uma leitura rápida, indicando resistência à rifampicina ou mutações que conferem resistência selecionados para outros de primeira ou segunda linha de medicamentos 2. Embora ensaios de amplificação em tempo real e de ácidos nucleicos isotérmica são concebidos para identificar as mutações de resistência a drogas que levam a MDR-TB, o espectro de mutações que detectam é muitas vezes inadequada para conceber um regime de droga individualizada correspondente ao perfil de resistência a drogas do paciente, e as restrições técnicas relacionadasde cross-talk óptico ou a complexidade da amplificação e relatórios químicos 03-07 maio limitar o número de loci ou mutações que são detectados. Assim, tecnologias de detecção com maior capacidade de multiplexação são necessárias para suprir as lacunas conhecidas em diagnósticos POC MDR-TB.

Microarrays e Hain ensaios sonda linha OMS endossadas pode resolver o "gene múltiplo, mutações" desafio de diagnosticar MDR-TB 8-29. Infelizmente, estes, plataformas de detecção multiplexados baseada hibridização usar várias etapas, complicado, e protocolos de amplicon aberto que exigem treinamento e proficiência significativo em técnicas moleculares. O microarray amplificação 30 foi projetado para atender algumas dessas preocupações operacionais microarray work-flow e. Os princípios fluídicos simplificadoras são para amplificar, hibridizar e detectar alvos de ácido nucléico em uma única câmara microfluídicos. O usuário introduz os ácidos nucléicos e amplificação master misturar em uma câmara de fluidos, com uma pipeta e inicia o protocolo de ciclos térmicos. Para o método de processamento do lote mostrado aqui, microarrays são subsequentemente lavadas em solução a granel, seca e fotografada. Este estudo demonstra a funcionalidade de um microarray de amplificação, utilizando um teste de MDR-TB microarray para rpoB (30 mutações), KatG (2 mutações), inhA (4 mutações), rpsL (2 mutações), embB (1 mutação), IS1245, IS6110 , e uma amplificação interna e controlo de hibridação. Pelo menos um par correspondente de sondas de microarray (de tipo selvagem (WT) e mutantes de um único nucleótido (MU)) é incluído para cada mutação de interesse. Ácidos nucleicos purificados de M. multirresistente tuberculose são do Strain TDR Tuberculose Banco 31. Microarrays elemento Gel são fabricados em substratos de vidro por copolimerização essencialmente como descrito em outra parte 32, só que usamos 4% e 0,05 mM monômero cada sonda no polymerizmistura ção. As matrizes são rodeados por uma junta de 50 ml, antes da utilização. Depois de ciclos térmicos, hibridação, lavagem e passos, microarrays de amplificação são gravadas em um analisador portátil Akonni. Correção de fundo, intensidades de sinal integrados são obtidos a partir da matéria. Imagens tif usando um algoritmo círculo fixo. Ruído para cada elemento de gel é calculado como três vezes o desvio padrão da mancha de fundo locais. Genes alvos são normalmente considerados detectável por sinal-ruído (SNR) de valores ≥ 3. A fim de determinar a presença ou ausência de uma mutação específica no gene ou cada codão, um rácio discriminante é calculado a partir dos valores de SNR como (WT-MU) / (TP + MU). Rácios discriminantes <0 são indicativos de uma mutação de resistência a drogas no local, enquanto que os rácios> 0 são indicativos da sequência de tipo selvagem.

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Protocolo

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Para laboratórios que seguem as precauções universais de PCR, é operacionalmente mais eficiente para incluir várias microarrays de amplificação e juntas por substrato e lavar todos os microarrays de amplificação simultaneamente em um recipiente a granel, como descrito aqui. Formatos de consumo estão disponíveis para a realização de pós-amplificação etapas de lavagem microarray em um totalmente selado, teste amplicon fechado, como relatado em outros lugares 30,33.

1. Setup

  1. Extrair e purificar ácidos nucléicos a partir da amostra em condições de biossegurança adequadas, com método de escolha. O requisito é que os ácidos nucleicos de ser de pureza suficiente para assimétrica, amplificação por PCR multiplex.
  2. Prepare espaço de trabalho, limpando superfícies e equipamentos com soluções de descontaminação.
  3. Coloque reagentes de amplificação no gelo ou bloco frio.
  4. Rotular um 1,5 ml tubo de microcentrífuga estéril para o master mix de amplificação, e rotular um estéril 0,2 ml de microcentrífuga tuser, para cada amostra.
  5. Após os reagentes são descongeladas, brevemente vórtex e recolher o conteúdo para o fundo do tubo com um impulso por rotação num mini-centrifugador. Não vortex Taq polimerase. Agite suavemente o tubo para misturar e seguir com um pulso-spin em mini-centrífuga.
  6. Prepare uma mistura de mestre amplificação usando os volumes de reação por amostra mostrados na Tabela 1. Para dar conta possíveis imprecisões pipetas, prepare-se, pelo menos, mais um volume de reação do que o número total de amostras a ser processados. Note que o master mix contém polimerase Taq adicional, para além daquilo que é fornecido com o tampão de PCR muliplex. Só adicionar o controle de amplificação / inibição à mistura mestre depois de todos os outros reagentes são combinados, e os tubos de reagente estoque voltou ao armazenamento.
Reagente Volume por amostra (mL) final []
Mulitplex PCR buffer com HotStar Taq Mais 25 1x
Albumina de soro bovino (BSA) 0,55 0,6 mg / mL
Formamide 3.8 7,6%
Polimerase Taq Adicionais 0,8 unidades / mL (4 unidades total)
MDR-TB mistura de iniciadores 15.75 -
Livre de RNase H 2 O 2.1 -
Amplification / Controle de Inibição 1 5,0 fg / ul
Total 49

MDR-TB amplificação microarray composição master mix Tabela 1..

  1. Vortex a mistura principal e recolher o conteúdo para o fundo do tubo com um impulso por rotação num mini-centrifugador.
  2. Combine 49 mL de mistura principal e 1 ml de M. tuberculosis DNA para cada um dos tubos de amostra do passo 1.4, acima. Para uma externa, sem controle modelo (NTC), use 1 ml de água grau biologia molecular no lugar do M. amostra de DNA tuberculose. Vortex e pulso spin-tubo (s) quando terminar.

2. Carregue amplificação Microarrays

  1. Adicionar 48 mL de cada mestre mix / amostra para o centro de seus respectivos microarrays, tomando cuidado para não tocar a própria microarray.
  2. Coloque uma lamela em cima da junta de microarray e selo, tomando cuidado para não prender as bolhas de ar na câmara de microarray. As bolhas de ar podem afetar negativamente a eficiência de amplificaçãoe pode criar artefatos ou ruído na imagem microarray subseqüente.

3. Ciclismo térmica

  1. Uma vez que todos os microarrays são carregados com amostra, lugar substratos no termociclador bloco plano. Certifique-se de que a opção tampa aquecida está ligado "Off". Equipamento obtido a partir Akonni Biosystems já estará pré-qualificados para o uso. Caso contrário, é muito importante verificar se o termociclador bloco plano (s) fornecer (s) uniforme, aquecimento consistente em todos os substratos de microarray.
  2. Abra o software termociclador, selecione o programa apropriado, digite "50 ul" para o volume de reação, e iniciar a corrida. O protocolo de ciclos térmicos aqui descrito consiste em:
    Térmicas Ciclismo Passos
    1 88 ° C 5 min
    2 88 ° C 30 seg
    3 55 ° C 1 min
    4 65 ° C 30 seg
    5 Repita os passos (2-4) por 50 ciclos
    6 65 ° C 3 min
    7 55 ° C 3 hr
  3. O número total de ciclos térmicos e 55 ° C pós-amplificação tempo de espera são variáveis ​​independentes que o usuário pode modificar, se necessário ou apropriado para o experimento específico. Porque a mistura de base de MDR-TB cria assimétricos amplicons (predominantemente de cadeia simples), é geralmente útil para incluir ciclos térmicos mais do que de outro modo poderiam ser utilizados para uma amplificação exponencial protocolo convencional de PCR.
  4. Quando o programa de ciclismo e hibridização térmica é completa, terminar o programa, retire os microarrays de amplificação, feche o software e desligue o termociclador (s).

4. Lavar e secar

  1. Para a lavagem até 24 substratos simultaneamente, preparar, pelo menos, 250 ml de 1x SSPE - 0,1% de Triton X-tampão de lavagem 100, e dois recipientes com, pelo menos, 250 ml de água desionizada ou água Milli-Q grau de água cada. O tampão de lavagem pode ser preparado antecipadamente.
  2. Remova cuidadosamente a lamela e junta de cada câmara microarray amplificação usando uma pinça de ponta plana. Esta etapa é o ponto em que há o maior risco de danos físicos matrizes elemento gel. Use os controles de contaminação PCR adequados para evitar a propagação de ácidos nucleicos amplificados dentro do ambiente de trabalho.
  3. Coloque substratos microarray em um suporte de histologia slide, e coloque todos os slides para o caixote de lavagem contendo o tampão de lavagem. Cobrir o recipiente com uma tampa.
  4. Lavar microarrays durante 10 min à temperatura ambiente com agitação suave.
  5. Mergulhe os microarrays três vezes cada em duas lavagens sucessivas de deionizada ouA água de grau Milli-Q, e o ar seco.

5. Imagem

A mistura de iniciadores MDR-TB assimétrica gera amplicons Cy3 marcado. Microarrays elemento Gel pode ser trabalhada com qualquer imager microarray padrão capaz de Cy3 imagem. O procedimento de imagem seguinte é específica para a mistura de MDR-TB mestre, campo Dx2100 imager portátil, e software de análise automatizado fornecida por Akonni.

  1. Verifique se o cabo ethernet do imager é conectado ao computador.
  2. Ligue o gerador de imagens. O interruptor de alimentação está localizado no painel traseiro do instrumento. LEDs azuis na frente do sensor de imagem acende quando imager é ligado.
  3. Ligue o computador.
  4. Na área de trabalho do computador, clique duas vezes no ícone do software para o lançamento do software automatizado de análise de imagem.
  5. Aguarde até que o software para estabelecer uma conexão com a câmera imager. Uma vez que a conexão é estabelecida, o botão Analisar se torna disponível, eomensagem "Conexão bem sucedida" aparecerá no canto inferior esquerdo da tela.
  6. Insira o microarray amplificação seco com o microarray de costas para o usuário, e para a lente objetiva. Se o microarray é impropriamente orientadas em relação à lente e da câmara, o software de análise automatizado falhará para colocar uma grade sobre a imagem de fluorescência.
  7. Feche a porta de acesso. Uma imagem de visualização estará disponível na tela do computador.
  8. Selecione o script análise MDR-TB a partir do menu drop-down e digite o tempo de exposição desejado (em milisegundos). Um ponto de partida típico para elementos gel microarrays de amplificação é 100-500 ms.
  9. Pixels saturados será exibido na Imagem em vermelho. Ajustar o tempo de exposição para minimizar o número de pixels saturados dentro pontos individuais.
  10. Clique em Analisar para adquirir e analisar a imagem de fluorescência. O software irá automaticamente colocar umGrade específica do ensaio MDR-TB na imagem, extraia intensidade integrada e valores de fundo, e relatar os resultados de resistência a medicamentos e genotipagem. A análise automatizada normalmente demorar alguns segundos. Para imagens desafiadoras que contêm arranhões, poeira, artefatos fluorescentes ou dano físico às características de microarray, o software pode precisar de até 1 min para completar a análise.
  11. Quando a análise estiver concluída, clique em Salvar, selecione a pasta de destino, digite um nome de arquivo e clique em OK. Dados de microarrays subjacentes são salvos como um arquivo xls. E podem ser exportados para o off-line analisa, se desejar.
  12. Quando a análise estiver concluída, remova o microarray amplificação do sensor, e clique em Novo para iniciar a próxima análise.
  13. Quando terminar a coleta de dados, feche o software, desligar o computador e desligue o gerador de imagens.

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Resultados

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Análise de imagem qualitativa pode fornecer informações sobre as fontes de ruído experimental ou variabilidade que são difíceis de identificar em tabelas de dados gerados pelo software automatizado de análise de imagem. Assim, ele pode ser útil para determinar visualmente que 1) todos os elementos de gel estão intactos e não danificado, 2) o fundo global é livre de artefactos fluorescentes que podem afectar o sinal individual de valores de ruído (SNR), 3), não há evidência de formação de bolhas ou não uniforme amplifica...

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Discussão

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O grau de multiplexagem, com um microarray de amplificação é, em última análise ditada pela eficácia do multiplex PCR assimétrica, não o microarray. Em nossa experiência, 10-12 pares de primers exclusivos podem ser facilmente multiplexados em um formato amplificação microarray. Critérios de primers e sonda de design convencionais, portanto, aplicar-se a novos testes, a não ser que a pessoa também precisa considerar possíveis interações entre os ácidos nucléicos em fase de solução e sondas de microarranjo imobilizados, a...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (NIH), sob concessão RC3 AI089106.

MDR-TB ácidos nucléicos foram fornecidos por / Programa das Nações Unidas Programa Fundo / United Nations Development do Banco Mundial / Organização Mundial da Saúde Especial para Pesquisa e Treinamento em Doenças Tropicais (TDR), Genebra, Suíça.

Agradecemos ao Dr. Tom Shinnick dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças para orientação sobre os genes e mutações específicas para incluir no ensaio do protótipo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microarrays de amplificação MDR-TB, com junta aplicada e lamínulas pré-cortadasAkonni BiosystemsInquire
, contendo tampão de PCR 2X com HotStar Taq maisQiagen#206143
Taq polimeraseQiagen#201207
água livre de RNAseQiagen#206143 
FormamidaThermo Fisher Scientific, Inc.#BP227-500
20 mg mL-1 albumina de soro bovino não acetalisada (BSA)Sigma-Aldrich#3B6917
5X mistura de primer concentrado MDR-TBAkonni BiosystemsInquire
500 fg uL-1 amplificação e controle de inibiçãoAkonni BiosystemsInquire
20X SSPEThermo Fisher Scientific, Inc. #BP1328-4
Triton X-100Thermo Fisher Scientific, Inc.#BP151-500
Spray Desinfetante Tecnologias Atuais, Inc.
Álcool isopropílico 70%Decon Labs, Inc.#8416
Gerador de imagens de microarray, com software automatizado de análise de imagem e dadosAkonni Biosystems100-20011
Termociclador com inserção de bloco planoAkonni Biosystems100-10021
Estação de lavagem de alto rendimento e suporte de lâminaArrayItHTW
Pinça de dissecaçãoThermo Fisher Scientific, Inc.#10-300
Mini VortexerVWR#3365040
Mini-centrífugaVWR#93000-196
Kit Compressor de AerógrafoCentral Pneumática#95630
Kit de PCR multiplex #BRSPRAY128

Referências

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