Diagnóstico Ecografia de função de mouse Diafragma

Resumo

Imagiologia de ultra-sons de diagnóstico tem provado ser eficaz para o diagnóstico de várias doenças respiratórias, em seres humanos e animais. Nós demonstramos um protocolo ultra-som abrangente utilizado pelo laboratório do Dr. Zuo para analisar a cinética de diafragma especificamente em modelos do rato. Esta é também uma técnica de pesquisa não-invasivo, que pode fornecer informações quantitativas sobre a função de mouse da musculatura respiratória.

Resumo

A análise funcional dos músculos esqueléticos respiratórias de roedores, em particular o diafragma, é geralmente realizada através do isolamento de tiras de músculo usando procedimentos cirúrgicos invasivos. Embora este seja um método eficaz de avaliação da atividade do diafragma vitro, envolve cirurgia não-sobrevivência. A aplicação de ultra-som não-invasivo, como um processo in vivo, é benéfico, uma vez que não só reduz o número de animais sacrificados, mas é também adequado para a monitorização da progressão da doença em ratinhos vivos. Assim, o nosso método de imagem de ultra-som pode provavelmente auxiliar no desenvolvimento de novas terapias que aliviam a lesão muscular induzida por várias doenças respiratórias. Particularmente, em diagnósticos clínicos de doenças pulmonares obstrutivas, imagiologia de ultra-som tem o potencial para ser usado em conjunto com outros testes padrão para detectar o aparecimento precoce de fadiga muscular diafragma. No protocolo atual, nós descrevemos como avaliar com precisão diafragma contratilidadelidade em um modelo de camundongo usando uma técnica de imagem de ultra-som diagnóstico.

Introdução

Recentemente, técnicas de imagem de ultra-som de diagnóstico foram aplicados a modelos de ratos com hipertensão renovascular e ^1,2 câncer no pâncreas. No entanto, estas técnicas não têm sido amplamente utilizados no ensaio de função da musculatura respiratória roedor. Por isso, desenvolvemos um método de imagem de ultra-som diagnóstico como uma ferramenta valiosa para a avaliação in vivo longitudinais da mobilidade diafragmática em camundongos.

Existem várias vantagens para ultra-sonografia diagnóstica. Por exemplo, é não-invasivo, seguro, portátil, e permite medições em tempo real a um custo relativamente baixo ^3. Particularmente, certos dispositivos de ultra-som de baixa freqüência foram capazes de detectar o aprisionamento de ar, uma característica clínica da doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) com leve a grave limitação do fluxo aéreo ^4. Assim, a ultra-sonografia de diagnóstico pode servir como um método de triagem de fácil acesso e reprodutível para monitoramento em tempo real de doenças respiratórias.

Técnicas de imagem de ultra-som diagnóstico são freqüentemente aplicada aos animais maiores ou seres humanos. No entanto, tem havido um número limitado de estudos de imagem de ultra-som em modelos de ratos, o que é provável, devido aos desafios da realização de ultra-som sobre assuntos de pequena escala. O protocolo atual delineia um novo procedimento para medir a função do diafragma no mouse. Além disso, embora tenha havido vários estudos com roedores para a função de diafragma, a maior parte dos resultados foram obtidos por isolamento a partir de tiras de músculo directamente o animal sacrificado ^5-7. Em contraste, utilizando um método in vivo de imagens de ultra-sons de diagnóstico para analisar a actividade do diafragma iria reduzir o número de animais sacrificados para a experimentação. Além disso, os tratamentos de longo prazo com foco em melhorar a contratilidade do diafragma pode ser avaliada com precisão através de ultra-som em modelos de roedores sem sacrificar animais.

ntent "> No nosso laboratório, foi desenvolvido um método eficaz para a visualização, bem como analisando a actividade diafragma rato utilizando uma máquina de ultra-sons, o que ajuda a compreender o funcionamento do diafragma in vivo, evita métodos invasivos para animais, e auxilia no desenvolvimento de terapêuticas tratamentos para a disfunção respiratória.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem seres animais foram aprovados e concluídos de acordo eo cumprimento do Institutional Animal Care e Use Committee Ohio State University (IACUC) regulamentos e diretrizes.

1. Rato Anestesia

1. Alterar uma tabela de procedimento de limpeza com um bloco isotérmico aquecido envolto em uma toalha cirúrgica. A almofada de aquecimento deve ser mantida entre 30 ° C e 34 ° C, para estabilizar a temperatura do núcleo do animal ao mesmo tempo reduzir o estresse potencial para o animal.
2. Posicione o mouse em uma câmara de indução anestésica com os seguintes parâmetros: taxa de fluxo de oxigênio definido para 1,5 L / min e vaporizador isoflurano definido para 3,5%. Sedação completa deve ocorrer dentro de 1-2 min. Se uma câmara de indução não está disponível, uma campânula de vidro pode ser usado com uma rede de arame posicionado na parte inferior para evitar o contacto directo com os animais do isoflurano.
3. Remover imediatamente o rato da câmara de indução, uma vez queestá completamente anestesiado (conseguido quando o mouse perde a função motora voluntária). Aplicar um nariz-cone para o animal para a manutenção da anestesia. A taxa de fluxo de oxigénio deve ser reduzida para aproximadamente 0,5 L / min e o vaporizador isoflurano deve ser mantida no intervalo de 1,5 a 2,5%.
   1. Aplique uma pequena quantidade de pomada oftálmica diretamente para as córneas para reduzir a secura dos olhos ^8. Além disso, durante a anestesia, o mouse deve manter uma ausência do reflexo interdigital, as mucosas deve permanecer uma cor-de-rosa, ea respiração deve aparecer constante.

2. Preparação para o diagnóstico Ecografia Procedimento

1. Contenha cada perna do mouse sobre a tabela de procedimento aquecida com um adesivo removível, como esparadrapo.
2. Usando um barbeador elétrico, retire o cabelo na superfície ventral do corpo entre o modo como abdômen e meia até a cavidade torácica. Aplicar creme de depilação para mais remover o restante do cabelo, que não é cortada pela navalha. Limpe o creme com uma gaze úmida após 2-3 min.
3. Retire o excesso de pêlos com uma gaze umedecida almofada de água e limpe a região depilada com álcool 70% ou equivalente anti-séptico. A sonda de ultra-sons irá ser aplicada a esta área para visualizar a função de diafragma. Um analgésico tópico pode ser fornecido aos animais experimentam irritação de pele menor, devido à remoção de pêlos.

3. Diagnóstico Ecografia Protocolo

1. Ligue o aparelho de ultra-som e ajustar a potência de saída (se necessário) sobre o aparelho por porcentagem para obter uma melhor resolução.
2. Configure o aparelho de ultra-som, quer B (brilho)-mode, M (movimento)-mode, ou ambos antes de imagem, que permite a visualização adequada da contração do diafragma do rato.
3. Aplique uma pequena quantidade de gel de ultra-som na parte superior do abdómen do rato e massagear o gel para a cavidade torácica.
4. Colocar os ultrasoar transdutor nesta área e ângulo-a para cima em direção ao coração. Ajustar a sonda até uma resolução optimizada da imagem é obtida. Nota: para este protocolo, uma matriz de micro-convexa ou transdutor linear em fases é uma sonda ideal para usar devido ao tamanho reduzido e excelente resolução axial ^9; a frequência precisa de ser ajustada através da largura de banda e para estas experiências pode ser utilizada uma gama de 6,5-12 MHz.
5. Pressione o botão de congelação para guardar temporariamente as imagens do diafragma e visualizar as contrações selecionados.
6. Salve a gravação como um cine loop, o que permite medições posteriores de excursão diafragmática, bem como a taxa de respiração. Nota: quadros de imagens podem ser salvas na memória do computador ou em um disco rígido externo para análise futura ^9.
   1. Precisamente medir a profundidade do movimento do diafragma de relaxamento para contração usando as pinças de eletrônicos que fazem parte do software de ultra-som.
   2. Converter aarquivo cine loop para um ficheiro MPEG e determinar a taxa de respiração através da contagem do número de contracções do diafragma durante o período de gravação. Alternativamente, o número de contracções por minuto (taxa de respiração) podem ser contadas a partir da imagem do modo-M.

4. Pós-anestésica de recuperação de animais

1. O mouse deve se recuperar completamente da anestesia dentro de 1 hora. Não deixe o animal sozinho até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal.

Resultados

Uma imagem típica de uma membrana de ultra-sons do rato é mostrada na Figura 1A. O diafragma do rato deslocamento vertical máxima foi registrada. Esta distância foi calculada medindo com precisão a profundidade do movimento do diafragma de relaxamento para contração usando as pinças de eletrônicos que fazem parte do software de ultra-som. Tabela 1 apresenta essas medidas de distância de contrações do diafragma de três ratos diferentes. Depois de converter o ficheiro de cine loop para um...

Discussão

O protocolo experimental atual desenvolve técnicas de imagem de ultra-som de diagnóstico específicos para a atividade do diafragma em um modelo do rato através de uma abordagem in vivo não-invasivo,. As configurações de aparelhos de anestesia são valores aproximados, que podem ser ajustadas ligeiramente para cada animal, desde ratos indivíduo pode responder de forma diferente a anestesia. Para evitar a administração de anestesia inadequada, é importante monitorar regularmente os sinais vitais do rato, incluindo...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistema de diagnóstico por imagem ultrassônico digital veterinário	Edan	DUS 3 VET	Os parâmetros de ultrassom incluem: frequência de 6,5 MHz, profundidade de 29 mm. Nota: Uma máquina de ultrassom equivalente pode ser usada para este protocolo
Transdutor de matriz microconvexa	Edan	C611	Ou unidade
de transporte manual (HCU) GE Logiq i equivalente	GE Healthcare	GE Logiq i unidade de transporte manual (HCU)	Ou sonda
de matriz linear GE 12 MHz	GE Healthcare	12L-RS	Ou equivalente
Vaporizador de anestésico veterinário	Webster Veterinary	Serial #: W422021	O isoflurano foi usado exclusivamente com este vaporizador (ou equivalente). Uma câmara de indução personalizada para anestesia foi montada para anestesia inicial. A anestesia de manutenção foi realizada usando um cone nasal
Isothesia (Isoflurano, USP)	Butler Schein	29405 250ML PVL	Ou equivalente
Enviro-pure anestesia absorvente canister	Surgivet Smiths Medical PM, Inc.	Parte #: 32373B10	Ou
equivalente Gel de transmissão de ultrassom	HM Sonic	N/A	Ou equivalente
Pomada veterinária Puralube	Puralube	NDC 17033-211-38	Ou
equivalente Almofada isotérmica Deltaphase	Braintree Scientific Inc.	39DP	Ou equivalente
Removedor de pêlos	Nair	N/A	Ou equivalente
Barbeador elétrico	Remington	HC-5015	Ou equivalente
Fita cirúrgica	3M Micropore	1530-1	Ou equivalente
Esponjas de gaze	Dynarex	3262	Ou equivalente

equivalente