Artigo de método

Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos

DOI:

10.3791/51306

⸱

3 de novembro de 2014

 ,  , 
1Integrated Department of Immunology and Integrated Center for Genes, Environment, and Health, National Jewish Health and University of Colorado School of Medicine

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste protocolo, descrevemos métodos para transfectar eficientemente linhagens celulares de macrófagos murinos com siRNAs usando o Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, estimular os macrófagos com lipopolissacarídeo e monitorar os efeitos na produção de citocinas inflamatórias.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os macrófagos são células-chave do sistema imunológico inato fagocítico. Quando os macrófagos encontram um patógeno, eles produzem proteínas e compostos antimicrobianos para matar o patógeno, produzem várias citocinas e quimiocinas para recrutar e estimular outras células imunes e apresentam antígenos para estimular a resposta imune adaptativa. Assim, ser capaz de manipular macrófagos com eficiência com técnicas como RNA-interferência (RNAi) é fundamental para nossa capacidade de investigar essa importante célula imune inata. No entanto, os macrófagos podem ser tecnicamente desafiadores para transfectar e podem exibir knockdown de genes induzido por RNAi ineficiente. Neste protocolo, descrevemos métodos para transfectar eficientemente duas linhagens celulares de macrófagos de camundongo (RAW264.7 e J774A.1) com siRNA usando o Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System e descrevemos procedimentos para maximizar o efeito do siRNA no knockdown do gene. Além disso, os métodos descritos são adaptados para trabalhar no formato de 96 poços, permitindo estudos de médio e alto rendimento. Para demonstrar a utilidade dessa abordagem, descrevemos experimentos que utilizam RNAi para inibir genes que regulam a produção de citocinas induzida por lipopolissacarídeo (LPS).

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste protocolo, descrevemos métodos eficientes para inibir genes em linhagens de células de rato macrófagos utilizando siRNAs e monitorar os efeitos desses tratamentos sobre a resposta imune inata. Estes procedimentos são realizados no formato de 96 poços, permitindo para telas de ARNi em forma de médio ou alto rendimento.

Em resposta a infecção, os humanos montar uma resposta imune inata imediata e uma resposta imune adaptativa mais lento, mas mais específico. Esta resposta imune inata rápida envolve o recrutamento e activação de células imunitárias inatas fagocíticas incluindo macrófagos 1. Classicamente macrófagos activados são envolvidos em respostas inflamatórias agudas e produzem proteínas antimicrobianas e compostos, citocinas e quimiocinas, e apresentam antígenos 2,3. Alternativamente macrófagos activados desempenham um papel na regulação da imunidade, manutenção da tolerância, a reparação de tecidos, a cicatrização de feridas e 4-8. Devido à sua ampla gama de funções, Os macrófagos podem desempenhar um papel em numerosas doenças, incluindo a aterosclerose, artrite, cancro e 9. Assim, o estudo dos macrófagos tem sido uma importante área de pesquisa por algum tempo em uma grande variedade de campos de doença.

Apesar da sua importância na resposta imune inata, os macrófagos podem ser um desafio células para trabalhar. Em particular, é difícil a obtenção de transfecção eficiente, utilizando reagentes de lípidos nos macrófagos sem toxicidade associada 10,11. Além disso, mesmo quando siRNA é eficientemente entregues aos macrófagos, a robustez do gene induzida por ARNi knockdown pode muitas vezes ser bastante moderado e pode variar de gene para gene.

Para superar estes desafios técnicos, nós otimizamos transfecção e técnicas knockdown 16/12 em duas linhas de células de rato macrófagos, RAW264.7 17 e 18 J774A.1. Esta abordagem utiliza o Sistema de Transporte de 96 poços Amaxa Nucleofector para transfecção; este sistemautiliza uma combinação de reagentes e electroporação para transfectar células especializadas em formato de 96 poços 19. Após transfecção, descrevemos métodos para maximizar a recuperação e viabilidade celular e para maximizar subseqüente knockdown gene induzida por siRNA. Para ilustrar a utilidade desta abordagem, os autores descrevem um protocolo para a entrega de siRNA para estas linhas celulares de macrófagos, estimular essas células com lipopolissacarídeo (LPS), e monitorizar a resposta imune inata no nível de produção de várias citocinas pró-inflamatórias. Nós fornecemos os dados da amostra em que têm como alvo a família de receptores Toll-like (TLR), cujos membros sentem LPS e outros padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), para regular a imunidade inata.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. A manutenção de linhas celulares de macrófagos

  1. Cresça RAW264.7 e linhas de células J774A.1 em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) a 37 ºC na presença de 5% de CO 2. Para ajudar a manter a esterilidade, adicione 1% de penicilina / estreptomicina (pen / strep) para a mídia (embora este não é estritamente necessário).
  2. Passo crítico: Certifique-se que os macrófagos estão crescendo em um estado saudável para transfecção eficiente e knockdown gene induzida por siRNA. Use células entre as passagens 3 e 10 após o descongelamento fresco, uma vez que estas linhas de macrófagos apresentam a melhor eficiência de transfecção e manter robusta sobrevivência pós-transfecção nesta fase; não use um número de passagens maior (> 20), como a eficiência de transfecção e gene knockdown tanto diminuir significativamente.
  3. Para a transfecção siRNA optimizado, células da placa em 20% de confluência e crescer um ou dois dias até as células atingirem confluência não superior a 80%. As células crescidas não irá transfectar efficiently.

2. Sistema de Programação do vaivém 96 poços para a transfecção

  1. Inicie o software de transporte de 96 poços no computador conectado à nave. Selecione o novo arquivo de parâmetro a partir do topo do menu arquivo esquerda.
  2. Realce os poços que vai ser exibido transfectadas na placa de 96 poços esquemática. A caixa verde indicará que os poços são selecionados.
  3. Seleccionar o programa que corresponde à linha celular de macrófagos sendo usado (DS-136 para RAW264.7 ou DS-130 para J774A.1) e seleccionar aplicar, localizado abaixo da diagramado placa de 96 poços. Note-se que depois de seleccionar um programa, os poços na placa esquemática será de cor azul escura. Círculos vazios indicam poços que não foram atribuídos um programa e não vai ficar chocado.

3. Preparação dos reagentes para transfecção

  1. Preparar a solução de trabalho Nucleofector ™ misturando SF linha celular de 96 bem-solução Nucleofector ™com a totalidade do conteúdo do tubo de suplemento fechado. Permitir que os reagentes misturados a equilibrar à temperatura ambiente antes de usar. Armazenar o excesso de solução Nucleofector ™ completa a 4 ºC por até 3 meses para uso futuro.
  2. Pré-aquecer a solução salina DMEM, RPMI-1640, 0,25% de tripsina / EDTA, e fosfato tamponada (PBS) a 37 ºC antes de preparar os macrófagos para a transfecção.
  3. Prepare o siRNA para a transfecção por degelo em gelo. A fim de minimizar o número de degelos congelamento do siRNA, congelar novos siRNAs em alíquotas a primeira vez que eles são usados.
  4. Em experiências iniciais, utilizar siRNA a uma dose relativamente elevada de 2 uM (diluído 1:10 a partir de 20? M stocks). Posteriormente titular siRNAs que induzem gene robusto knockdown para baixo para doses mais baixas, embora sejam necessárias doses normalmente mais elevados para knockdown gene eficiente em macrófagos em comparação com outros tipos de células.
    NOTA: Os siRNAs estão disponíveis a partir de muitas fontes; knockdown bastante robusta gene pode ser obtidousando SMARTPOOLs siGenome, que são grupos de quatro siRNAs segmentação cada gene. Como controle negativo, use qualquer um dos vários conjuntos não-alvo siRNA ou siRNAs.
  5. Para controlar a eficiência da transfecção, transfectar ou o plasmídeo controlo pmaxGFP (fornecida nos kits Amaxa) ou siRNAs fluorescentemente marcadas em paralelo com os siRNAs experimentais. Esperar 30-50% de transfecção do plasmídeo GFP (ensaiado por microscopia ou por citometria de fluxo no dia após a transfecção) e> 99% de transfecção fluorescentemente marcado siRNA (ensaiada por citometria de fluxo imediatamente após a transfecção e recuperação).

4. Preparando os macrófagos para transfecção

  1. Separar macrófagos aderentes provenientes das placas de cultura de células por tripsinização. Aspirar a mídia e lave as células duas vezes com 10 ml de PBS. Após a remoção do PBS, incubar as células com pré-aquecida até 0,25% de tripsina / EDTA (1 ml / placa de 10 cm) durante 1-2 min até que as células comecem a separar. Bata suavemente na placa e mover a solução durante a incubação para maximizar a tripsinização.
  2. Após a incubação, adicionar 9 ml de meio DMEM + FBS, misture suavemente para cima e para baixo, e recolher as células por pipetagem em um tubo estéril.
  3. Contar o número de macrófagos isolados, utilizando um hemocitómetro. Espere cerca de 10 milhões de macrófagos por placa de 10 cm. Calcule o número total de macrófagos necessários; cada poço na 96 poços vaivém requer 200.000 células. Lembre-se de adicionar valor de alguns poços adicionais de células para permitir perdas de pipetagem.
  4. Pipetar o número calculado de células para um tubo de centrífuga. Centrifuga-se as células durante 10 min a 150 xg à temperatura ambiente. Não centrifugar muito rapidamente, pois isso vai diminuir saúde macrófagos e eficiência de transfecção.

5. Nucleofection de macrófagos com siRNA

  1. Usando uma placa de 96 poços de fundo redondo estéril (o que facilita a mistura, enquanto minimiza a perda de reagentes), adicionar 2 mL de cada siRNA para cada poço a ser transfected.
    Nota: Dependendo do número de siRNAs, isto pode ser realizado durante o passo de centrifugação de macrófagos.
  2. Aspirar a mídia a partir de células centrifugadas. Delicadamente ressuspender as células em solução Nucleofector ™ SF (contendo a solução suplemento), utilizando-se 20 ul por 200.000 células peletizadas. Uma vez ressuspensa, utilizar as células imediatamente para a transfecção óptima.
  3. Transferir as células ressuspensas para uma calha estéril; utilizando uma pipeta de canais múltiplos, a transferência de 20 mL da mistura de células ressuspenso em cada poço da placa de 96 poços contendo o siRNAs. Misture delicadamente por pipetagem cima e para baixo.
  4. Transferir 20 uL da mistura de célula / siRNA para a placa com 96 poços Nucleocuvette ™ passo crítico:. Evitar a geração de bolhas durante o passo de transferência como este pode induzir erros durante Nucleofection.
  5. Depois de colocar todas as amostras experimentais na placa de transfecção, cobrir a placa de 96 poços, com a tampa fornecida e seey bater suavemente sobre uma superfície dura para remover quaisquer bolhas a partir das amostras.
  6. Coloque placa de 96 poços com tampa para o de 96 poços de transporte Nucleofector e selecione "carregar e iniciar 'no canto inferior direito da tela do programa. Antes Nucleofection, siga o prompt programa para salvar os resultados.
    Nota: Durante o processo de Nucleofection, poços transfectadas com sucesso será representado no 96 poços esquemática na tela por um círculo verde com um sinal de mais. Um círculo vermelho com sinais de menos indica um erro, provavelmente devido a bolhas ou mis-pipetagem do volume correto de reagentes.

6. Recuperação e chapeamento de macrófagos

  1. Imediatamente após Nucleofection, utilizando uma pipeta multicanal, adicionar 80 ul de pré-aquecido (37 ºC) RMP1-1640 meios de comunicação a cada poço. Adicionar os meios de comunicação para o lado de cada poço, permitindo que os meios de comunicação para misturar lentamente com as células transfectadas, as quais são muito delicado nesta fase. Não adicione a mídia muito rápido, pois isso irádiminuir consideravelmente a viabilidade.
  2. Colocar as placas de 96 poços com amostras transfectadas e meio RPMI-1640 numa incubadora de 37 ºC, com 5% de CO 2 durante 2 min; esta é crítica para permitir que as células para recuperar antes da manipulação posterior.
  3. Remova a placa de 96 poços da incubadora e transferir cuidadosamente a mistura de cada poço para uma placa de 96 poços de cultura de tecidos utilizando uma pipeta multicanal.
  4. Usando uma pipeta de canais múltiplos, adicionar 100 ul de pré-aquecido (37 ºC) DMEM + FBS a cada poço.
  5. Incubar a placa de cultura de tecidos de 96 poços com amostras em uma incubadora de 37 ºC, com 5% de CO 2 durante 24-36 hr (optimizar o momento exacto para siRNAs individuais, embora este intervalo de tempo, geralmente funciona bem).

7. Estimulação de macrófagos com LPS

  1. Após a 24-36 horas pós-Nucleofection incubação, preparar LPS (ou outro PAMPs) em meio fresco. Prepare meio fresco o suficiente para todos os poços (200 mL mEDIA / poço da placa de 96 poços e um pouco mais para a pipetagem). Dilui-se LPS para uma concentração final de 20 ng / mL em DMEM + FBS.
  2. Media cuidadosamente aspirado a partir da placa de 96 poços e adicionar o meio fresco contendo os LPS às células.
  3. Monitorar a resposta ao LPS ou outros MMAPs em vários momentos após a estimulação. 6 horas é suficiente para gerar uma resposta de citocinas inflamatórias robusto para citocinas tais como IL-6 ou TNFa.

8. Acompanhamento da Induzida imunitário inatas Response, Gene Knockdown e Viabilidade de macrófagos

  1. Para monitorizar a produção de citocinas induzida por LPS, pipeta-se o sobrenadante das células para uma placa de armazenamento de 96 poços. A produção de citocinas pode ser então medido por ELISA.
  2. Uma vez que o sobrenadante é removido, monitorar a viabilidade celular utilizando diacetato de fluoresceína (quando clivada por esterases celulares em células vivas, este composto se torna fluorescente). Identificar os siRNAs que têm como alvo os genes que controlam a viabilidade celular usando tsua abordagem. Nota: o processo de transfecção em si deve ter pouco efeito sobre a viabilidade se for realizada correctamente.
    1. Adicionar diacetato de fluoresceína (5 mg estoque / mL em acetona) a cada poço (1: 100 de diluição final em PBS).
    2. Incubar à temperatura ambiente durante 1-5 min e, em seguida, monitorar fluorescência nas células, utilizando um leitor de placas (460 nm de excitação, 515 nm de emissão).
    3. Opcional: Para assegurar que a fluorescência nos poços é uniforme, lisar as células, utilizando tampões tais como RIPA; isto proporciona um sinal fluorescente uniforme no poço, como alguns leitores de placas estão configurados para monitorar apenas uma pequena porção do poço; se as células não são colocadas de maneira uniforme, o diacetato de fluoresceína pode dar uma leitura imprecisa.
  3. Como uma alternativa para monitorar a viabilidade celular, monitorar gene induzida por siARN knockdown por qPCR utilizando ARN derivado a partir das células aderentes.
    1. Após o sobrenadante é removido a partir das células (passo 8.1), o anúnciod tampão RLT (que é usado para a lise e preservação de ARN) directamente para as células aderentes para lisar-los.
    2. Isolar ARN utilizando um kit de preparação de RNA tais como o mini-kit RNeasy, e usar qPCR com iniciadores específicos do gene para monitorar gene relativa knockdown para controlar o tratamento de siRNA. Use Βactin ou iniciadores para GAPDH para normalização.
  4. Como uma outra alternativa para controlar outros aspectos da resposta imune inata, monitorar a capacidade fagocitica dos macrófagos adicionando marcado com FITC E. coli partículas directamente sobre as células aderentes utilizando um kit. Seguindo o protocolo do fabricante, o que leva apenas algumas horas, monitorizar a absorção fagocítica utilizando um leitor de placas ou microscopia.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para demonstrar a eficiência de transfecção usando esta abordagem, foi monitorada a absorção de siARN marcado com FITC utilizando um citómetro de fluxo (Figura 1).

Para ilustrar a utilidade da nossa abordagem para o controlo da resposta imune inata, que transfectadas siRNAs dirigidos conhecidos genes reguladores da imunidade inata para a linha celular RAW264.7 de macrófagos, as células estimuladas com LPS, em seguida, monitorizada a produção de citocinas pró-inflamatórias IL...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Numerosos estudos têm sido publicados em que genes individuais têm sido alvo de siRNA em macrófagos murinos. Enquanto a transfecção mediada por lípidos foi usado para entregar siRNA para linhas celulares de macrófagos, numa base individual, estes métodos sofrem de efeitos potenciais sobre a viabilidade, knockdown gene limitada, e variabilidade de gene para gene. Para desenvolver ensaios mais robustos que poderiam ser usados ​​para direcionar genes na forma de médio ou de alto rendimento, nós otimizamos técnicas que util...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. Este artigo foi patrocinado pela Lonza, Inc.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecimentos a Brad Lackford pela ajuda na otimização de algumas das técnicas descritas neste manuscrito.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sistema de transporte de 96 poços de nucleofector AmaxaLonzaAAM-1001S
LonzaV4SC-2096
RAW264.7 linha celular de macrófagos de camundongoATCCTIB-71
J774A.1 linha celular de macrófagos de camundongoATCCTIB-67
siGenome smartpool siRNADharmaconvaria dependendo no gene
Pool de siRNA de controle não direcionadoDharmaconD-001206-13-20
Oligo fluorescente Block-iT para eletroporaçãoInvitrogen13750062
Ultrapure E. coli O111:B4 LPSLista Laboratórios Biológicos421
DMEM, glicose altaInvitrogen11995-065
RPMI-1640Invitrogen11875-093
Solução de penicilina-estreptomicina (Pen/Strep)FisherSV30010
0,25% Tripsina-EDTAInvitrogen25200072
placas de cultura de tecidos de 96 poçosFisher07-200-89  
Placas estéreis de fundo redondo de 96 poços (não revestidas)Fisher07-200-745
Mouse IL-6 Duoset ELISA kitR& D BiosystemsDY406
Mouse TNFα Kit ELISA DuosetR& D BiosystemsDY410
Diacetato de fluoresceínaSigma-AldrichF7378
Tampão RLTQiagen79216
RNeasy mini kitQiagen74134
Vybrant Kit de ensaio de fagocitoseInvitrogenV-6694
Linha celular Amaxa SF Kit de nucleofector de 96 poços

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. The innate immune response to infection. , ASM Press. (2004).
  2. Adams, D. O., Hamilton, T. A. The cell biology of macrophage activation. Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).
  3. Fujiwara, N., Kobayashi, K. Macrophages in inflammation. Current drug targets. Inflammation and allergy. 4, 281-286 (2005).
  4. Gordon, S., Martinez, F. O. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions. Immunity. 32, 593-604 (2010).
  5. Martinez, F. O., Helming, L., Gordon, S. Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective. Annual review of immunology. 27, 451-483 (2009).
  6. Fairweather, D., Cihakova, D. Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity. Journal of autoimmunity. 33, 222-230 (2009).
  7. Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. Journal of immunology. 181, 3733-3739 (2008).
  8. Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. Macrophage polarization comes of age. Immunity. 23, 344-346 (2005).
  9. Burke, B., Lewis, C. E. The macrophage. , 2nd edn, Oxford University Press. (2002).
  10. Lee, G., Santat, L. A., Chang, M. S., Choi, S. RNAi methodologies for the functional study of signaling molecules. PloS one. 4, (2009).
  11. Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. Journal of biomolecular screening. 14, 151-160 (2009).
  12. Alper, S., et al. Identification of innate immunity genes and pathways using a comparative genomics approach. ProcNatl Acad Sci USA. 105, 7016-7021 (2008).
  13. De Arras, L., et al. An evolutionarily conserved innate immunity protein interaction network. J. Bio. Chem. , 1967-1978 (2013).
  14. Yang, I. V., et al. Novel regulators of the systemic response to lipopolysaccharide. Am J Respir Cell Mol Biol. 45, 393-402 (2011).
  15. Yang, I. V., et al. Identification of novel innate immune genes by transcriptional profiling of macrophages stimulated with TLR ligands. Molecular immunology. 48, 1886-1895 (2011).
  16. Yang, I. V., et al. Identification of novel genes that mediate innate immunity using inbred mice. Genetics. 183, 1535-1544 (2009).
  17. Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
  18. Ralph, P., Moore, M. A., Nilsson, K. Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines. The Journal of experimental medicine. , 1528-1533 (1976).
  19. Zumbansen, M., et al. First siRNA library screening in hard-to-transfect HUVEC cells. Journal of RNAi and gene silencing. 6, 354-360 (2010).
  20. Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
  21. Aliprantis, A. O., et al. Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2. Science. 285, 736-739 (1999).
  22. Alexopoulou, L., Holt, A. C., Medzhitov, R., Flavell, R. A. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature. 413, 732(2001).
  23. Conforti, R., et al. Opposing effects of toll-like receptor (TLR3) signaling in tumors can be therapeutically uncoupled to optimize the anticancer efficacy of TLR3 ligands. Cancer Res. 70, 490-500 (2010).
  24. Fernandez-Botran, R., Větvička, V. Methods in Cellular Immunology. 8, CRC Press. 8(2001).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Amaxa NucleofectorTransfec o de siRNAEstimula o com LPSProdu o de CitocinasCitometria de FluxoEnsaio ELISAKnockdown G nico

Artigos relacionados