Isolamento de CA1 Nucleares frações enriquecidas de fatias do hipocampo para o Estudo de dependentes de Atividade Nuclear Importação de Mensageiro Proteínas Synapto nucleares

Synaptic N-metil-D-aspartato-receptores (NMDAR) desempenham um papel crucial na plasticidade sináptica e a sobrevivência das células de sinalização enquanto a activação de NMDAR extrasynaptic pode provocar neurodegeneração e morte celular. Essas mudanças dependem de expressão rigidamente controlado gene dependente / atividade regulamentada e, portanto, requerem uma comunicação constante entre sinapses ativadas ou dendritos e do núcleo ^7. O MAP-quinases ERK1 / 2 são efectores a jusante de sinalização de NMDAR sinápticas e são envolvidos na expressão de genes induzidos por NMDAR-activação, enquanto que a sinalização através de NMDAR extrasynaptic não tem ou tem um efeito inibidor sobre a ERK1 / 2 atividade ^8,11.

Há um número de proteínas que têm sido mostrados para transporte entre dendritos distais e do núcleo. Muitas destas proteínas conter um sinal de localização nuclear e são activamente transportados ao longo de microtúbulos em uma maneira dependente da dineína e-importin ^6,9 para o núcleo. Interestingly, alguns destes mensageiros trânsito apenas para o núcleo, em resposta a estímulos específicos sinápticos. Por exemplo, o transporte retrógrado de elemento de resposta cíclica AMP ligação às proteínas 2 (CREB2) é induzida por LTD química, mas não LTP ^12. Localizada estimulação sináptica dependente de NMDAR impulsiona coactivador de transcrição regulada de CREB (CRTC1) para o núcleo, um processo de translocação, que está envolvida na plasticidade do hipocampo a longo prazo ^4. Foi demonstrado recentemente que o mensageiro proteína Jacob transloca para o núcleo após tanto, a activação sináptica e extrasynaptic NMDAR e regula CREB gene dependente de transcrição ^5. A origem sináptica ou extrasynaptic do sinal é codificado em uma modificação pós-tradução de Jacob. Actividade sináptica induz ERK1 / 2 dependente da fosforilação de serina-Jacob numa cruciais na posição 180 (pJacobS 180), que é um requisito necessário para a subsequente translocação para o núcleo, em cultura primária do hipocampo. Além disso, in neurônios CA1 de fatias de hipocampo agudas pJacobS 180 transloca para o núcleo após Schaffer garantia LTP mas não LTD ^1,10. PS180 Jacob leva a um aumento da expressão de genes relacionados com a plasticidade e a expressão do gene realimenta a função sináptica. Em nítido contraste, Jacob que transloca para o núcleo após a ativação NMDAR extrasynaptic não é fosforilada na Ser180 e pode estar associada a diferentes complexos proteína no núcleo causando 'CREB desligado' e uma retração de contatos sinápticos ^10.

A maioria dos estudos publicados sobre a importação nuclear de synapto-nuclear mensageiro proteína ter sido feito em culturas primárias de neurônios dissociados. Por isso, seria interessante ver se esses resultados podem ser reproduzidos em fisiologicamente mais relevante condições usando fatias de hipocampo onde a conectividade e função neuronal são muito mais bem preservado. Aqui apresentamos um protocolo otimizado para avaliação LTP-dependent translocação nuclear de mensageiros proteicos por imunotransferência. Este método também é adequado para a análise da actividade de fosforilação de proteínas dependentes de uma fracção nuclear em bruto. Especificamente, o protocolo atual envolve a preparação de fatias aguda CA1 do hipocampo, indução e gravação de LTP. Em seguida, a região CA1 é microscopicamente dissecados para isolar a região estimulada. Nós combinamos e modificou o protocolo para o isolamento nuclear fornecido pela CellLytic nuclear Extraction Kit com alterações introduzidas pela Zhao e seus colegas ^17. O procedimento optimizado inclui a lise das regiões CA1 dissecados em tampão hipotónico permitindo inchaço celular e a libertação de núcleos. A lise celular e morfologia de núcleos pode ser determinado por exame microscópico. Enriquecimento nuclear é conseguida por um passo de centrifugação curta. Immunoblotting análise com anticorpos contra NeuN e NSE2, marcadores específicos de fracções nucleares ou citosólicas, indica que esta abordagem pode ser usada como um rápidoe protocolo reprodutível para isolar essas frações subcelulares e estudar modificações pós-tradução muito instáveis, como a fosforilação de proteínas. Além disso, este método é vantajoso para pequenas amostras de tecido derivadas de regiões CA1 dissecados de fatias do hipocampo e pode ser usado em combinação com imuno-histoquímica de fatias do hipocampo.

1 Preparação de Agudo fatias do hipocampo de ratos adultos Cérebro

1. Anestesiar ratos com isoflurano. ATENÇÃO: Execute o procedimento usando um exsicador fechado, não inalar o isoflurano. Certifique-se de que o animal está completamente anestesiado.
2. Decapitar os ratos, isolar rapidamente o cérebro, e mergulhá-lo num precarbonated (95% _{de O2} / 5% ₂ mistura de gás de CO) gelada solução de Gey (composição em mM: 130 de NaCl, 4,9 de KCl, 1,5 de CaCl ₂ 2H ₂ O , 0,3 MgSO ₄ 2H ₂ O, 11 de _MgCl2 · 6H ₂ O, 0,23 KH ₂ PO _4, 0,8 de Na ₂ HPO ₄ · 7H ₂ O, 5 de _glucose-H2O, 25 HEPES, 22 de _NaHCO3, pH 7,32) durante 30 min ^1,2,10,16.
3. Remover o cerebelo e parte do córtex entorrinal. Separe os hemisférios corticais com um corte médio-sagital, em seguida, coloque cada hemisfério para baixo em sua superfície medial. A partir de então fazerum corte de 50-70 ° (50-70 ° transversal) ao longo da superfície dorsal de cada hemisfério ^13,14.
4. Cole cada hemisfério com a superfície recém-cortada na plataforma de corte do sistema de corte. A plataforma deve ser coberto por solução precarbogenated de Gey gelada.
5. Cortar 350um 50-70 ° fatias transversais de anterior para posterior lateral usando um vibratome ajustado para minimizar a oscilação do eixo z. A formação do hipocampo, córtex entorrinal e subicular, bem como os córtices que estão localizados no hipocampo dorsolateral fará parte das fatias utilizados para experiências ^13,14.
6. Transferir as fatias de hipocampo de uma forma de U e submerso tipo incubadora e incubar durante pelo menos 2 horas a 32 ° C com carbogenated fluido cerebroespinal artificial (ACSF contendo em mM: 110 de NaCl, 2,5 de KCl, 2,5 de _CaCl2 2H ₂ O, 1,5 MgSO ₄ 2H ₂ O, 1,24 KH ₂ PO _4, 10 Glicose · H ₂S, 27,4 _NaHCO3, pH 7,3) ^1,2,10,16.

2. posicionamento dos eletrodos, Base de gravação, e indução de LTP

1. Transferir a fatia de hipocampo de uma câmara de registo tipo submerso montado sob um microscópio. Perfundir (6-7 ml / min) com ACSF carbogenated durante pelo menos 30 min a 32 ° C.
2. Prepare microeletrodos capilares de vidro cheios de ACSF (resistência de ponta é de 3-5 mohms).
3. Coloque um microeléctrodos de vidro cheios com ACSF nas fibras Schaffer-CA1 colaterais para a estimulação e na radiatum CA1 estrato fEPSP gravação ^1,2,10 (Figura 2). A distância entre os eléctrodos deve ser de cerca de 300 um.
4. Potenciais campo excitatórios pós-sinápticos (fEPSPs) evocar por estimulação das fibras Schaffer-colaterais com impulsos de corrente bifásica rectangulares (200 ms / polaridade) em uma gama de 3-4 V.
5. Realizar o teste máximo de estimulação através da medição do INPrelação ut-saída e definir a força de estimulação, como 40% dos valores máximos fEPSP-inclinação obtidos e mantê-la constante durante todo o experimento.
6. Comece a gravação da linha de base durante pelo menos 15 minutos após o teste de estimulação máxima. Medem-se as respostas a estímulos testar cada minuto durante todo o experimento. Realize gravações iniciais com estimulação de baixa freqüência.
7. Gravar a linha de base durante pelo menos 30 min.
8. Para indução Late-LTP aplicar de alta freqüência de 100 Hz tetanização que consiste em três trens de estímulo 1 seg a 100 Hz com um intervalo de 5 min intertrain. Para aumentar o campo de estimulação dentro região CA1 5 uM bicuculina pode ser lavada em 2 min antes de tetanização e deve ser lavada imediatamente após a última tetanização.

3 Coleção de fatias após a indução da LTP e snap Congelamento

1. Parar LTP gravação 2 min ou 30 min depois de três trens de estimulação tetânica induzindo Late-LTP.
2. Recolhe cada fatia num tubo de 1,5 ml e armazenar a -80 ° C.

4 Isolamento de fracções nucleares enriquecidos a partir da região CA1 do hipocampo

1. Tome 1,5 ml Eppendorf tubos com as fatias congeladas entre -80 ° C e mantê-los no gelo.
2. Adicionar 0,5 ml de tampão contendo a protease fresca fria TBS (PI) e inibidores de fosfatase (PS), para dentro do tubo. Incubar por 2-3 min e transferir para um microscópio estereoscópico. CUIDADO: Use luvas de proteção e um jaleco, enquanto trabalhava com PI e PS.
3. Dissecar região pyramidale CA1 do hipocampo estrato usando duas agulhas. Use uma agulha para a realização da fatia, ao microscópio estereoscópico ea segunda agulha para cortar a área de CA1.
4. Recolher o CA dissecadaUma região de 5 fatias (para cada grupo) para um novo tubo de 1,5 ml contendo 50 ul de tampão de lise (1x tampão de lise hipotónico contendo em mM: 10 HEPES, 1,5 de _MgCl2, 10 KCl, pH 7,9, com IP e PS). Note-se que esta quantidade de material vai ser suficiente para executar 2-3 immunoblots.
5. Homogeneizar o tecido coletado por pipetagem up cuidadoso e para baixo. Usar uma pipeta de 200 uL. Incubar o ligado em gelo durante 5-7 minutos para permitir que as células inchar.
6. Tome 2 mL do lisado, cair sobre uma lâmina de microscópio, e visualizar o inchaço das células em um microscópio de campo claro. Com inchaço adequada das células dos núcleos aparecem como rodada estruturas intactas.
7. Recolha 20 ul de amostra para um novo tubo de 1,5 mL como "fracção de homogenato. Adicionar 8 mL de tampão de desnaturação da amostra 4x SDS.
8. Centrifugar os lisados ​​restantes em 11.000 rpm durante 1 min.
9. Recolher cuidadosamente o sobrenadante a partir do topo ('fracção citosólica'), transfer para um novo tubo e adicionar 20 ul de tampão de amostra 4x.
10. Ressuspender o sedimento em 60 mL de tampão hipotónico e adicionar 20 ul de tampão de amostra 4x. Esta fracção é referido como uma "fracção enriquecida nuclear".
11. Homogeneizado, citosólica, e fracções enriquecidas nucleares podem ser armazenadas a -20 ° C ou -80 ° C para posterior immunoblotting.

5. Immunoblotting semiquantitativa de proteínas nucleares Synapto

1. Descongelar as amostras e ferve-las durante 5 min a 95 ° C.
2. Tirar 5 ul de cada fracção e determinar a concentração de proteína pelo teste de amido preto ou o teste de BCA.
3. Carga igual quantidade de amostras de proteína a partir de homogeneizado, fracções enriquecidas citoplasmáticos e nucleares em SDS-PAGE. As amostras de controle e fatias LTP deve ser colocado no mesmo gel para comparação direta.
4. Executar um procedimento de western-blot padrão (transferência molhado é recomendado).
5. Sondar as membranas com tque o anticorpo de escolha. Posteriormente as mesmas manchas (ou mesmas amostras são executados em paralelo) pode ser sondado com uma citoplasmática marcador - enolase2 neurônio específico (NSE2) e marcador nuclear - NeuN e um anticorpo actina como controle de carga.

Análise de Dados 6.

1. A eficiência de indução da LTP pode ser analisada pelo software Clampfit. A inclinação média de gravações de base foi comparado com as pistas após tetanização usando two-way ANOVA, p <0,05 foi considerado significativamente diferente. Os valores de declive fEPSP foram representados em diagramas como a média ± SEM
2. Para a quantificação de immunoblots, digitalizar o filme de auto-radiografia e analisar a densidade integrada de bandas de proteínas por ImageJ ou bandas de fluorescência com um sistema de Licor. Valores de bandas imunorreactivas deve ser normalizada para o controle de carregamento e absorvente. Para a comparação dos grupos controle e LTP um nonparametrical Mann-Whitney U-teste pode ser usado.

Tabela 1 Os tampões.

Nós já anteriormente demonstrado que a proteína mensageira synapto nuclear Jacob acumula no núcleo após a indução da LTP, mas não LTD 1. Além disso, a translocação de Jacob após estimulação sináptica requer a activação de MAPK ERK1 / 2 e a fosforilação de Jacob em Ser180 (Figura 1). Fosforilada Jacob transloca para o núcleo de uma forma dependente da importin e o estado fosforilado pode ser conservada durante períodos de tempo prolongados, por associação com o filamento intermediário αinternexin 15 (Figura 1). O estado de fosfo-de Jacob é importante para a expressão de genes dependentes da actividade e sobrevivência celular. Curiosamente, a activação de NMDAR extrasynaptic também impulsiona Jacob para o núcleo, mas, neste caso, Jacob não é fosforilada em Ser180 e a sua acumulação nuclear induz CREB 'desligado' 5,10. Os resultados descritos acima foram obtidos por Protocols estabelecidos no nosso estudo recente (ver Karpova et al. 10 para uma descrição detalhada do modelo).

Para provar que Jacob transloca para o núcleo, após a indução da LTP, que induzida e medida da indução de Schaffer colateral fEPSP potenciação em fatias de hipocampo agudas e subsequentemente isolado a partir de núcleos neuronais neurónios CA1 (Figuras 2 e 3). Foram comparados dois pontos de tempo diferentes após a aplicação de estimulação de alta frequência (2 min e 30 min) e registada a indução da LTP para cada fatia que foi processada posteriormente para isolamento nuclear e de Western Blot (figuras 2 e 3). Enriquecimento do marcador nuclear NeuN neuronal pode ser visto na fracção enriquecida nucleares preparados a partir da região CA1 dissecados, enquanto enolase2 específico citosólica marcador de neurónios (NSE) é na sua maioria presentes na fracção do sobrenadante obtido após a centrifugação da c lisadasells (Figura 4A). A especificidade do anticorpo PS180 Jacob tem sido caracterizada anteriormente (ver pormenores Karpova et al. 10). níveis PS180 Jacob permaneceu inalterado no total de homogeneizados de proteína CA1 e no nuclear enriquecido fração 2 min depois tetanização (Figura 4B), mas encontramos um aumento significativo na pJacobS 180 imunorreatividade 30 min após a indução da LTP (Figura 4C), confirmando que Jacob translocação para o núcleo, neste modelo de plasticidade celular é fosforilada em Ser180.

Figura 1 Jacó fosforilada no S180 codifica a origem sináptica dos sinais NMDAR. Estimulação Tetânica do hipocampo Schaffer fibras colaterais resulta em ativação de NMDAR sinápticas e consequente ativação de MAPKERK1 / 2 cascata de sinalização. Activado ERK1 / 2 e liga-se a fosforila Jacob na serina 180 e complexo de Jacob-ERK1 / 2, transloca-se para o núcleo e isto correlaciona-se com a actividade aumentada de CREB e activação da expressão do gene relacionado com a plasticidade.

Figura 2 Equipamentos e ferramentas utilizados para a indução da LTP e dissecando região CA1 de fatias de hipocampo. A) Vibratome utilizado para a preparação de fatias de hipocampo agudas (1 - Vibratome) B1-2) Eletrofisiologia e configuração de imagem (2 - Microscópio; 3 - Micromanipulator e sistema de perfusão; 4 - Recodificação eletrodo; 5 - eletrodo de estimulação; 6 - Água objectiva de ; 7 - titular fatia com fatia hipocampal) C) Os equipamentos utilizados para a dissecção da região CA1 de fatias de hipocampo (8 Stereomicroscope; 9 - seringa de insulina com agulhas; 10 - Pequenas tesoura cirúrgica; 11 - bisturi; 12 - Plastic pipeta Pasteur, 13 - espátula fina; 14-100 mm placa de cultura de plástico cheio de água gelada, e 40 milímetros cultura plástico prato usado para dissecção de fatias.

Demonstrando Figura 3 dos desenhos animados do procedimento experimental. Números indicam passos no protocolo. 2,1-2,8) Uma fatia do hipocampo aguda na câmara submersa com eletrodos de vidro colocados no estrato radiante para potenciação de Schaffer garantia-CA1 sinapses. A inserção representa os traços analógicos amostra fEPSP, a barra horizontal indica 5 ms ea barra vertical indica 0,5 mV. 3.3) Os cortes foram recolhidos em tubos de 1,5 ml depoisGravação LTP e congeladas rapidamente. 4.3) A dissecção da região CA1 de fatias do hipocampo de ratos adultos. 4,4-4,5) regiões CA1 homogeneizado em tampão de lise hipotónico, o que faz com que o inchaço osmótico das células e libertação de núcleos. 4.8) A centrifugação dos lisados ​​a 11000 rpm durante 1 min. 4.10) A recolha das fracções enriquecidas citoplasmáticos e nucleares para immunoblotting. 5.3) O carregamento de frações enriquecidas citoplasmáticos e nucleares em SDS-PAGE e posterior padrão western-blotting.

Figura 4 Indução de CA1 LTP leva à acumulação de pJacS180 no núcleo. A) para Immunoblot homogeneizado, citosólica e fracções enriquecidas nucleares de CA1 lisado sondado com citosólica e marcadores nucleares. B) Análise de imunotransferência de nível pJac-S180 em homogeneizado de 2 min e 30 min após a inducção de tetanização. C) Análise de Imunoblot de nível pJacS180 em nuclear enriquecido fração 2 min e min após tetanização. Estes resultados fazem parte do gráfico de quantificação publicada em 10 Karpova et al. Estes imunotransfer�cias representativos não estão incluídos no à publicação original.

Os autores não têm nada a divulgar.