Nanopodia - finas, Projeções frágil membrana com papéis em Movimento Celular e intercelulares Interações

Resumo

Nanopodia são canais de membrana fina, mas frágeis, que se estendem até 100 mm de líder frente ou à direita traseira de um celular e sentir o ambiente celular. Fixação directa a 37 ° C, lavagem suave, e evitar os solventes orgânicos como o etanol, metanol, ou de acetona e de Triton X-100 a concentrações mais elevadas são necessárias para observar estas estruturas celulares.

Resumo

As células aderentes em cultura manter um estado polarizado para apoiar o movimento e interações intercelulares. Nanopodia são finas, alongadas, em grande parte de actina F-negativo-projeções de membrana em células endoteliais e de câncer que podem ser visualizadas através de TM4SF1 (Transmembrane-4-L-seis-família-1) técnica de imunofluorescência. Cachos TM4SF1 em 100-300 diâmetro mM TMED (TM 4SF1 e nriched micro d omains) contendo 3 a até 14 individuais TM4SF1 moléculas. TMED estão dispostas de forma intermitente ao longo nanopodia com um espaçamento regular de 1 a 3 TMED por μ m e ancorar firmemente nanopodia a matriz. Isso permite nanopodia estender mais de 100 μ m do líder frente ou à direita traseira de células endoteliais ou tumorais polarizadas, e faz com que os resíduos de membrana para ser deixado para trás em matrix quando a célula move-se para longe. TMED e nanopodia ter sido ignorado por causa de sua extrema fragilidade e sensibilidade à temperatura. Lavagem de rotina e fixação romper a estrutura. Nanopodia são preservadas por meio da fixação directa de paraformaldeído (PFA) a 37 ° C, seguida por uma breve exposição a 0,01% de Triton X-100 antes da coloração. Nanopodia abrir novas perspectivas na biologia de células: eles prometem para reformular a nossa compreensão de como as células perceber seu ambiente, detectar e identificar outras células à distância, iniciar interações intercelulares em contacto estreito, e dos mecanismos de sinalização envolvidos no movimento, proliferação e celular -celulares comunicações. Os métodos que são desenvolvidos para estudar nanopodia TM4SF1 derivados podem ser úteis para estudos de nanopodia que se formam em outros tipos de células através da agência de tetraspanins clássicos, nomeadamente a CD9 onipresente expressa, CD81 e CD151.

Introdução

Durante a polarização para o movimento, as células animais estender uma variedade de dinâmicas, saliências da membrana de suas superfícies, incluindo filopodia, lamellipodia, fibras de retração, e babados ^1. Recentemente adicionado a esta lista foram nanopodia, um tipo recém-reconhecido de fina (100-300 m de diâmetro), a projeção da membrana alongada (até 50-100 mM de comprimento) que oferecem canais de membrana para a extensão das estruturas de F-actina como filopodia e fibra de retracção, e que coraram positivamente com TM4SF1 (Transmembrana-4-L e seis-família-1) em células endoteliais e de tumor de células cultivadas ^2,3.

Protocolo

1. Cultura de Células em colágeno revestido Disk Vidro

1. Coloque os discos de vidro (12 mm de diâmetro) em uma jarra de vidro (4 oz) e autoclave para esterilizar os discos.
2. Colocar 25 ml de etanol a 70% em um tubo Falcon de 50 ml e coloca-se numa capa de cultura de células. Esta solução pode ser reutilizada várias vezes até que o nível da solução baixa para 20 ml.
3. Coloque uma pinça afiada com um ponto extra fino no etanol 70% por 5 minutos antes de usá-lo para lidar com o disco de vidro.
4. Cuidadosamente remover a pinça para fora do tubo e fechar a tampa, em seguida, colocar gentilmente a pinça de etanol tratada na parte superior ....

Resultados

Para o Passo 1:

Se as células (como HUVEC e PC3 utilizado neste estudo) são capazes de crescer normalmente, as células irá anexar o disco revestido de colágeno dentro de 30 minutos depois que eles são semeadas, polarizar e tornar-se móvel logo depois, e estender nanopodia à frente do seu caminho de movimento. Figuras 1A e 1B mostram, respectivamente, um polarizado e em proliferação de HUVEC. Figura 2A mostra células PC3 polarizado num estado mó.......

Discussão

Nanopodia são finos canais de membrana celular que ligam firmemente à matriz através TMED e pode se estender mais do que 100 mm a partir de uma célula móvel polarizada para sentir o ambiente e mediar interações intercelulares ^2,3. Nanopodia aderir à matriz tão firmemente que os resíduos são deixados para trás, como os movimentos de células de distância (Figuras 1 e 2). Nanopodia assim nos permitem estudar como as células sentir seu ambiente e determinar o caminho do movimento.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Discos de vidro	Fisher Scientific	12-545-82	12 mm de diâmetro
	Fisher Scientific	02-912-310	Frascos de vidro reto de vidro transparente limpo certificado, lâmina de vidro de 4 oz
Lâminas	microscópio de vidro liso premium Fisher	Scientific	12-544-1
50 ml Tubo Falcon	BD Falcon	352070	Tubo de centrífuga cônico de polipropileno de alta clareza de 50 ml, classificação de 16.000 rcf. Estéril.
Tubo Falcon de 15 ml com suporte de isopor	Corning	430790	Corning 15 ml PP Tubos de centrífuga
Pinça afiada	Fisher Scientific	13-812-42	Pinça de lascas pontiagudas extra finas dissecante
Placa de cultura de células de 24 poços	BD Bioscience	353047	Placa de cultura de células de 24 poços
Placa de cultura de células de 150 mm	BD Bioscience	353025	Placa de cultura de células de 150 mm
19 G 1 ½ Agulha de seringa	BD Bioscience	309635	19 G 1 ½
Etanol	Decon Laboratories, Inc.	2701	Solução de colágeno puro de etanol 200 provas da
	Decon BD Bioscience	354249	Collagen I, alta concentração, cauda de rato, 100 mg
de tripsina/EDTA	Cellgro	25-053-CI	0,25% de tripsina-EDTA 1x
DMEM	Life Technologies	11965-092	DMEM glicose alta (1x), líquido, com L-glutamina, sem piruvato de sódio
10x PBS	Affymetrix	75889 5 LT	PBS, 10x Solução, pH 7,4
PFA (paraformaldeído)	Affymetrix	19943 1 LT	4% em PBS
FBS	Sigma-Aldrich	F4135-500ML	Soro Fetal
Bovino EGM2-MV	Lonza	CC-3162	EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml e EGM-2 SingleQuot Kit Suplemento & Fatores
de crescimento Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002-25G	Solubilizado em água. Solução estoque a 4% e concentração de trabalho é de 0,4%.
Anticorpo anti-humano TM4SF1 de camundongo	de MAB3127	Millipore	está localizado no domínio extracelular
Anticorpo anti-CD9 humano de camundongo	BD Bioscience	555370	Epítopo está localizado no domínio extracelular
Alexa Fluor 488 Anti-rato de burro 2º anticorpo	Life Technologies	A-21202	Alexa Fluor 488 Anti-rato de burro IgG (H+L)
Faloidina	Chemicon	90324	Faloidina conjugada com rodamina
Mídia de montagem anti-desbotamento	Life Technologies	P-36931	ProLong Gold Antifade Reagent com DAPI
70% Etanol			17,5 ml de etanol (200 provas) 7,5 ml de água duplamente deionizada
10x PBS (fazer 200 ml)			20 ml de 10x PBS 180 ml de água duplamente deionizada
20% Triton X-100 (fazer 20 ml)			4 ml de Triton X-100 16 ml de água duplamente deionizada
4% NaN3 (perfazer 25 ml)			1 g de NaN3 25 ml de água duplamente deionizada
50 ng/ml Solução de colágeno bovino em PBS (fazer 5 ml)			Solução-estoque de 50 μ g/ml (50 ml) 830 μ l de Colágeno I (3 mg) 50 ml
Tampão de Bloqueio PBS ICC (50 ml)			49 ml PBS 2% FBS (adicionar 1 ml) 0,04% NaN3 (adicionar 100 μ l de 4% NaN3)
Tampão de Bloqueio ICC/0,01% Triton X-100 (faça 50 ml)			50 ml de Tampão de Bloqueio ICC 25 μ l de 20% Triton X-100
HUVEC	Lonza	C2517A	www.lonza.com
PC3	ATCC	CRL-1435	www.atcc.org
Capuz de cultura de células	NuAIRE	Nu-425-600	NU-425 (Série 60) Gabinete de Segurança Biológica
37 &graus; C, 5% CO2 Incubadora de cultura de células	CellStar	QWJ300DABA	Cellstar CO2 Almofada de aquecimento para incubadora com camisa de água
	K & H Fabricação	1020	K & H Lectro Kennel Almofada Aquecida com Capa de Lã Livre (www.amazon.com)
Centrífuga	Sorvall	T6000B	Sorvall T6000 (B) Centrífuga de Bancada
Hemocitômetro	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line

Jarra de vidro de de FisherfinestO epítopo de