Uma rápida e específica de microplaca de ensaio para a determinação de ascorbato intra-e extracelular em células cultivadas

Resumo

Ascorbato desempenha várias funções importantes no metabolismo celular, muitos dos quais só vieram à luz nos últimos anos. Descrevemos aqui um meio-débito, ensaio de microplacas específico e de baixo custo para a determinação de ambos ascorbato intra e extracelular em culturas de células.

Resumo

A vitamina C (ácido ascórbico) desempenha várias funções importantes no metabolismo celular, muitos dos quais só vieram à luz nos últimos anos. Por exemplo, dentro do cérebro, o ácido ascórbico atua de forma neuroprotetor e neuromodulador que envolve ciclismo ascorbato entre astrócitos e neurônios vicinais - um relacionamento que parece ser crucial para ascorbato cérebro homeostase. Além disso, novas evidências sugerem fortemente que o ácido ascórbico tem um papel muito expandida na regulação do metabolismo do ferro celular e sistêmica do que é classicamente reconhecida. O crescente reconhecimento do papel fundamental do ascorbato na fisiologia celular e do organismo normal e desregulamentado exige uma gama de médio rendimento e de alta sensibilidade técnicas analíticas que podem ser executados sem a necessidade de equipamentos especializados altamente caro. Aqui nós fornecemos instruções explícitas para um meio-rendimento, ensaio de microplacas específico e relativamente barato para a determinação de boascorbato intra e extracelular th em cultura de células.

Introdução

A descoberta da natureza química do ácido ascórbico (vitamina C), e sua identificação como o "fator anti-escorbuto" há muito procurado, por Albert Szent-Györgyi e outros artigos publicados em 1928-1934 ¹ foram acontecimentos marcantes na história de bioquímica. De fato, essas descobertas contribuíram para Szent-Györgyi sendo agraciado com o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 1937. A suíte cada vez maior de papéis para ascorbato em fisiologia animal e vegetal, bem como a saúde humana, continuam a ser os temas de científico ativo investigação e controvérsia.

L-ascorbato é um redutor fisiológi....

Protocolo

1. Determinar ascorbato intracelular em células cultivadas

1. Cultura de células e colheita
   1. Grow suspensão (por exemplo, eritroleucemia humana, K562) ou células aderentes (por exemplo, astrócitos primários) usando procedimentos padrão de cultura ^19-21,32,38. Nota: para garantir células contêm ascorbato, carregar células cultivadas com ascorbato quer como ascorbato ou DHA ^33,39.
2. Criar um extrato celular contendo ascorbato
   1. Incubar de um número adequado de solução salina tamponada com fosfato de suspensão (PBS), lavou-se as células aderentes ou com 450....

Resultados

Determinação de ascorbato intracelular em células cultivadas de suspensão

No primeiro ensaio (Figura 1), o ácido ascórbico intracelular é determinada, na sequência específicas de ascorbato (isto é, AO-sensível) redução de ferricianeto de ferrocianeto, utilizando a determinação altamente sensível do ferrocianeto de um processo publicado previamente ^37. A detecção de ascorbato é baseado na quelação colorimétrico de ferro ferroso que é gerado pela redução depen.......

Discussão

Neste artigo, apresentamos dois ensaios de microplacas colorimétricos rápidos, específicos e relativamente sensíveis para a determinação de ácido ascórbico derivado dos compartimentos intra e extracelulares em células em cultura. Os ensaios podem ser concluída com acesso a equipamento de laboratório e reagentes. O reagente apenas moderadamente dispendioso necessário para o ensaio é de AO, que é essencial, uma vez que confere um elevado grau de especificidade para o analito L-ascorbato. Os .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de fundo plano Nunc de 96 poços	Thermo	269620	Qualquer placa de fundo plano de 96 poços pode ser usada
Microcentrífuga de bancada refrigerada	Eppendorf	5415D	Uma microcentrífuga não refrigerada que foi equilibrada à temperatura em uma câmara fria também pode ser usada
Centrífuga de bancada refrigerada	Eppendorf	5810R	Balde
oscilanteBio-Rad Benchmark Plus Espectrofotômetro de microplacas	Bio-Rad		Qualquer espectrofotômetro de microplacas capaz de ler a 593 nm pode ser usado e é recomendado. Se um leitor de placas baseado em filtro for usado, escolha o comprimento de onda mais próximo possível e use o método de curva padrão.
Ependorf MixMate (misturador orbital de microplacas)	Eppendorf		Este é um misturador de microplacas muito versátil e confiável e funciona muito bem para esses ensaios
Tampões
Solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4
Solução salina tamponada com MOPS (MBS); 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7,3
MBS + 5 mM de D-glicose (MBS/D)
solução salina tamponada com HEPES + 5 mM de D-glicose (HBS/D); 137 mM de NaCl, 5,2 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2• 2 H2O, 0,8 mM MgSO4• 7 H2O, 5 mM de D-glicose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7,3)
Tampão de permeabilização celular (CEC; 0,1% de saponina em PBS)
Produtos químicos
Ácido L-ascórbico ou L-ascorbato de sódio	Sigma-Aldrich		Preparações de maior pureza devem ser obtidas
Dímero de ácido desidro-L-ascórbico (DHA)	Sigma-Aldrich	30790	As soluções aquosas teoricamente produzem 2 moles de monômero de DHA por mol de dímero de DHA
Citocalasina B	Sigma-Aldrich	C6762	Soluções de estoque preparadas em DMSO ou etanol
Ascorbato oxidase (AO)	Sigma-Aldrich	A0157	As soluções de estoque (120 U/ml) podem ser preparadas em PBS ou MBS e depois congeladas em alíquotas
Ferricianeto de potássio (FIC)	Sigma-Aldrich	455989	Trihidrato
Fereno-S (3-(2-piridil)-5,6-di(2-furil)-1,2,4-triazina-5′,5′ ′-sal dissódico de ácido dissulfônico)	Sigma-Aldrich	92940
L-glutamato de sódio	Sigma-Aldrich
L-glutamina	Sigma-Aldrich
Saponina	Sigma-Aldrich	47036	Preparar uma solução-mãe a 0,1%
de estoque para ensaio
3 M acetato de sódio (pH 6,0)
Ácido
0,2 M ácido
3,3 mM FeCl3 em 0,1 M ácido
30 mM fereno-S
50% (v/v) ácido acético + 30% (p/v) ácido tricloroacético (TCA)
Soluções de reserva para ensaio
AO (120 U/ml)
2,4 mM fereno-S
0,12 mM FeCl3 em citrato

de uso geralgerais Soluções de determinação de ascorbato intracelularacético glacialcítricoacéticode efluxo de ascorbato de sódio 0,6 mM