Uma rápida e específica de microplaca de ensaio para a determinação de ascorbato intra-e extracelular em células cultivadas

Resumo

Ascorbato desempenha várias funções importantes no metabolismo celular, muitos dos quais só vieram à luz nos últimos anos. Descrevemos aqui um meio-débito, ensaio de microplacas específico e de baixo custo para a determinação de ambos ascorbato intra e extracelular em culturas de células.

Resumo

A vitamina C (ácido ascórbico) desempenha várias funções importantes no metabolismo celular, muitos dos quais só vieram à luz nos últimos anos. Por exemplo, dentro do cérebro, o ácido ascórbico atua de forma neuroprotetor e neuromodulador que envolve ciclismo ascorbato entre astrócitos e neurônios vicinais - um relacionamento que parece ser crucial para ascorbato cérebro homeostase. Além disso, novas evidências sugerem fortemente que o ácido ascórbico tem um papel muito expandida na regulação do metabolismo do ferro celular e sistêmica do que é classicamente reconhecida. O crescente reconhecimento do papel fundamental do ascorbato na fisiologia celular e do organismo normal e desregulamentado exige uma gama de médio rendimento e de alta sensibilidade técnicas analíticas que podem ser executados sem a necessidade de equipamentos especializados altamente caro. Aqui nós fornecemos instruções explícitas para um meio-rendimento, ensaio de microplacas específico e relativamente barato para a determinação de boascorbato intra e extracelular th em cultura de células.

Introdução

A descoberta da natureza química do ácido ascórbico (vitamina C), e sua identificação como o "fator anti-escorbuto" há muito procurado, por Albert Szent-Györgyi e outros artigos publicados em 1928-1934 ¹ foram acontecimentos marcantes na história de bioquímica. De fato, essas descobertas contribuíram para Szent-Györgyi sendo agraciado com o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 1937. A suíte cada vez maior de papéis para ascorbato em fisiologia animal e vegetal, bem como a saúde humana, continuam a ser os temas de científico ativo investigação e controvérsia.

L-ascorbato é um redutor fisiológico e abundante da enzima do cofactor em sistemas de mamíferos, e contribui para numerosas reacções enzimáticas bem definida envolvendo a hidroxilação do colagénio, carnitina e norepinefrina biossíntese, o metabolismo da tirosina e hormona peptídica amidação ^2. Curiosamente, evide montagemdno sugere que o ácido ascórbico desempenha um papel na estimulação de outras dioxigenases dependentes de ferro, tais como os de prolilo e asparaginilo hidroxilases envolvidos na hidroxilação e direccionamento dos factores de hipoxia-inducible (HIFs) 1α e 2α ^3. Um relatório recente sugere que o ácido ascórbico desempenha um papel na maturação de células T através da cromatina que afecta a sua actividade através de desmetilação para estimular as hidroxilases nucleares, proteínas de domínio (JmjC) Jumonji C; o último dos quais parecem exigir ascorbato para a atividade completa ^4. Com efeito, a estimulação de tais enzimas por ascorbato parece ocorrer através de um mecanismo semelhante ao da estimulação por ascorbato de HIF e colagénio hidroxilases. Entre outros efeitos clássicos, ascorbato contribui significativamente para antioxidação celular como uma quebra de cadeia de captador de radicais solúveis em água e ⁵ para a reciclagem de membrana plasmática α-tocoferol (vitamina E), através da redução da α-tocopheroxyl radical ^6, which é importante na proteção contra a peroxidação lipídica da membrana ^7. É importante notar, embora a maioria dos mamíferos é capaz de síntese hepática de novo de ascorbato de D-glicose, primatas superiores, cobaias e alguns morcegos dependem de fontes dietéticas de vitamina ^8. Isto é devido à inactivação do gene GULO, os ortólogos de que em mamíferos não afectadas codificam a enzima, γ-gulono-lactona oxidase ^9-13. Esta enzima é necessária para a reacção final na biossíntese de ascorbato de glicose ^13.

Após a absorção mediada por transportador a partir do lúmen intestinal em seres humanos, o ácido ascórbico é distribuída por todo o corpo, o sistema circulatório. A vitamina é normalmente encontrado em sua forma reduzida em milimolares concentrações intracelular (com a notável exceção dos eritrócitos em que as concentrações são normalmente semelhantes aos da concentração plasmática vigente), e em conc micromolarentrations (por exemplo, 50-200 uM), na maioria dos fluidos extracelulares ^14,15.

Em condições fisiológicas, ascorbato normalmente sofre uma oxidação reversível de um elétron para o radical livre ascorbil (AFR, também conhecido como monodehydroascorbate ou semidehydroascorbate). Enquanto o AFR é relativamente estável radical ^16, na ausência da sua rápida redução enzimática de um electrão de volta para o ácido ascórbico, dois AFRs pode promover dismutar para um ascorbato e um desidroascorbato (DHA) ^9,13,17. Dentro do interior da célula, o produto de oxidação de dois electrões do ascorbato, DHA, pode ser rapidamente reduzida para trás pela glutationa-ascorbato e NAD (P) H-enzimática dependente e as reacções não-enzimáticas ^13.

Enquanto ele é classicamente aceito que apenas papel significativo do ascorbato no metabolismo do ferro é estimular a absorção dietética de ferro não-heme ^18, nós e outros forneceram evidências strongly sugerindo que o ácido ascórbico desempenha um papel muito expandida no metabolismo deste metal. Em primeiro lugar, o ácido ascórbico que é liberado por células-ascorbato repleto parece desempenhar um papel importante na modulação da absorção de ferro não ligado à transferrina por células ^19,20, e evidência muito recente indica que o ácido ascórbico também modula a absorção de ferro ligado à transferrina por células ^21, o último dos quais corresponde a um grande fisiológico rota ferro-uptake ^22.

Ascorbato é essencial para a função normal do sistema nervoso central em mamíferos ^23,24. Juntamente com o córtex supra-renal, glândula pituitária, do timo, da retina e do corpo lúteo, o cérebro contém altas concentrações de ascorbato em relação a outros tecidos do corpo ^23,25-27. Além disso, a exposição de ambos os astrócitos ^28,29 e células neuronais semelhante ³⁰ ao glutamato é conhecido por provocar a libertação de ascorbato no espaço extracelular, onde a ascorbate é pensado para ajudar a proteger os neurônios contra a disfunção neuronal induzida pelo glutamato ^31. Embora o mecanismo exato de glutamato induzida por liberação ascorbato de astrócitos é desconhecida, que recentemente forneceu evidências indicando o envolvimento de células inchaço causado pela captação de glutamato pela glutamato astrócitos e transportador de aspartato (GLAST, também conhecido transportador isoforma aminoácido excitatório 1 [EAAT1 ] em humanos) e conseqüente ativação de osmólito e ânions canais sensíveis ao volume (VSOACs) que são permeáveis ​​a pequenos ânions orgânicos, tais como ácido ascórbico ^32. As identidades moleculares das condutas de membrana plasmática envolvidas na formação VSOAC continuam a ser identificadas ^33,34.

Embora muitos ensaios foram desenvolvidos para a determinação de ácido ascórbico em amostras biológicas, que incluem espectrofotométricos, fluorométricos e ensaios cromatográficos ^35,36, existe uma grande variabilidade em especificidade, sensibilidade, interference por contaminantes químicos, faixa linear eficaz e estabilidade do analito endpoint. Além disso, outros factores importantes que influenciam a escolha do ensaio são a rapidez, a facilidade de utilização e acesso a equipamento relativamente especializadas tais como a cromatografia líquida de alto desempenho aparelho (HPLC).

Aqui apresenta-se um ensaio de microplaca colorimétrico simples e altamente específico para a determinação de ácido ascórbico intracelular em células de cultura, assim como um ensaio separado para a determinação de ascorbato-efluxo a partir de células cultivadas. O último ensaio visa contornar o problema da subestimação da liberação ascorbato a partir de células devido ao rápido recaptação de ascorbato liberado pelos transportadores dependentes de ascorbato de sódio (SVCTs). Embora ambos os métodos têm aparecido em algumas de nossas publicações anteriores ^{19,20,32,37,38,} este manuscrito fornece um conjunto explícito de instruções e orientações para a sua execução eficaz.

Protocolo

1. Determinar ascorbato intracelular em células cultivadas

1. Cultura de células e colheita
   1. Grow suspensão (por exemplo, eritroleucemia humana, K562) ou células aderentes (por exemplo, astrócitos primários) usando procedimentos padrão de cultura ^19-21,32,38. Nota: para garantir células contêm ascorbato, carregar células cultivadas com ascorbato quer como ascorbato ou DHA ^33,39.
2. Criar um extrato celular contendo ascorbato
   1. Incubar de um número adequado de solução salina tamponada com fosfato de suspensão (PBS), lavou-se as células aderentes ou com 450 ul de células gelada permeabilização buffer [CEC; 0,1% (w / v) de saponina em PBS; 4 ° C]. Nota: determinar o número de células necessárias para se obter um valor de absorção dentro do intervalo linear do ensaio (ver abaixo) empiricamente pelo utilizador final. Nota: extratos de tecidos também pode ser usada (veja a discussão para mais detalhes).
   2. Agitate células em gelo durante 10 minutos para garantir lise celular completa.
   3. Criar um extracto intracelular contendo ascorbato clarificados removendo os restos celulares por centrifugação do ligado em bruto a 16000 × g durante 5 minutos numa microcentrífuga refrigerado (4 ° C).
   4. Cuidadosamente remover 4 x alíquotas de 100 ul de cada amostra e adicionar a uma sequência horizontal de poços numa placa de 96 poços de fundo plano que contém ou 25 ul / poço de PBS ("-AO") ou apenas 25 ul / poço de 45,5 L / ml de solução de L-ascorbato-oxidase (AO) em PBS ("+ AO"). Nota: este deve ser feita em paralelo com a preparação dos padrões (ver abaixo).
3. Ascorbato padrão da curva de construção (deve ser construído de novo para cada ensaio)
   1. Prepara-se uma solução estoque de ácido ascórbico a 10 mM em PBS gelado. Nota: Verifique se a concentração de ácido ascórbico por espectrofotometria usando uma cuvete de quartzo com um 1cm de percurso a 265 nm (coeficiente de extinção = 14,5 mM ^-1 cm ^{-1) 40.}
   2. Preparar-se cuidadosamente uma série de padrões de ascorbato entre 0 e 20 uM.
   3. Em paralelo com a etapa 1.2.4, remover cuidadosamente 4 × alíquotas de 100 ul de cada padrão e adicionar a uma sequência horizontal de poços numa placa de 96 poços de fundo plano, que contém 25 ul / poço de PBS ("-AO") ou um 45,5 solução estoque U / ml de AO em PBS ("+ AO"). Nota: 100 ul dos padrões de ascorbato irão conter 0-2 nmol de ascorbato. Por favor, note que o propósito do AO é para controlar a contribuição de redutores não-ascorbato de ferricianeto de redução.
4. Determine ascorbato intracelular - Etapa 1: remover seletivamente ascorbato e quantitativamente oxidar ascorbato com ferricianeto
   1. Orbitalmente misturar a placa de 96 poços a 550 rpm à temperatura ambiente durante 5 min no escuro, cobrindo a placa em folha de alumínio. Nota: Tseu passo deve oxidar todos ascorbato no "+ AO" poços DHA. Os poços "-ão" não devem ser afetados.
   2. Adicionar 50 mL de ferricianeto de potássio 3,5 mM (aqui referidos como "ferricianeto") em PBS em todos os poços. O final [ferricianeto] = 1 mM. Nota: Utilize um multipipettor.
   3. Orbitalmente misturar a placa a 550 rpm à temperatura ambiente durante mais 5 min no escuro. Nota: Esta etapa deve resultar na redução de ferricianeto de ferrocianeto de ascorbato numa razão estequiométrica de 2 moléculas de ferricianeto reduzidas por uma molécula de ácido ascórbico oxidado.
   4. Imediatamente adicionar 25 ul de uma solução recentemente construído contendo 50% (v / v) de ácido acético e 30% (w / v) de ácido tricloroacético (TCA). Nota: Utilize um multipipettor.
5. Determinar ascorbato intracelular - Passo 2: quantificar a quantidade de ferrocianeto formado ³⁷
   1. Adicione 100 ml de solução de ferrocianeto de ³⁷ a determinação each bem. Nota: A solução de trabalho deve ser feita imediatamente antes da utilização: 2 ml de 3 M de Na-acetato (pH 6,0); 0,5 ml de ácido acético glacial (~ 17,4 M de ácido acético); 2 ml de ácido cítrico 0,2 M; 2 ml de 3,3 mM de _FeCl3 em ácido acético 0,1 M; 1 ml de 30 mM Ferene-S. O volume final da solução de trabalho deve ser de 7,5 ml.
   2. Orbitalmente misturar a placa no escuro a 550 rpm durante 30 min à temperatura ambiente.
   3. Ler os valores de absorvância dos poços a 593 nm (isto é, o máximo de absorção do Fe (II) (Ferene-S) ₃ complexo).
   4. Calcule a quantidade de ácido ascórbico intracelular como nmoles ascorbato por milhão de células, inicialmente subtraindo os valores A _{593 nm} para poços a '+ AO' dos correspondentes - poços 'AO' para cada amostra e, em seguida, interpolação na curva padrão ascorbato (veja o passo 1.3 ). Ao construir a curva padrão, traçar essa "diferença de valor" para cada padrão contra a quantidade de ascorbcomeu por poço.

2. Determinação do ascorbato-efluxo de células cultivadas

1. Cultura de células e colheita
   1. Crescer suspensão ou células aderentes como acima (veja o passo 1.1). Nota: realizar o ensaio a seguir em um formato de plataforma 24 poços com uma suspensão de células aderentes e para obter os melhores resultados.
   2. Ressuspender as células em suspensão, as células aderentes ou de sobreposição, com 400 ul de solução salina tamponada com HEPES pré-aquecido, com ou sem cálcio e magnésio, e que contém 5 mM de D-glicose (HBS / D, pH 7,3, 37 ° C) nos poços de uma placa de 24 poços. Adicionar o mesmo volume de HBS / D para poços sem células especificadas em cada placa de 24 poços, para ser examinado. Nota: este último irá servir como controlos isentos de células para a reacção de referência (ver abaixo).

3. Determinar a quantidade de ácido ascórbico Lançamentos

1. As seguintes soluções de deve ser preparado com antecedência: 120U / ml AO em HBS / D (preparar fresco); 2,4 mM Ferene-S em HBS / D; 120 pM _FeCl3 e 600 uM de Na-citrato em HBS / D (preparar imediatamente soluções de estoque mais concentrados).
2. Para iniciar a reação ferrireduction (volume final por poço deve ser de 600 mL), adicionar os seguintes volumes de reagentes aos poços individuais já contendo 400 mL de HBS / D:
   1. Adicionar 50 ul de AO (120 U / ml) ou HBS / D para emparelhado poços em triplicado. A concentração final AO deve ser de 10 U / ml. Nota: Etiqueta emparelhado poços como "- AO" e "+ AO".
   2. Misturar as placas com mistura suave orbital durante 5 min a 37 ° C.
   3. Adicionar 50 ul de 2,4 mM Ferene-S para todos os poços. A concentração final Ferene-S deve ser de 200 uM. Misturar as placas como acima durante 5 min a 37 ° C.
   4. Adicionar 50 ul de 120 uM recentemente preparada de citrato férrico. A concentração de citrato de ferro final e deve ser de 10 uM de ferro e citrato a 50 uM. Misture bem.
3. Em três poços de controlo triplicadas, aspirar o meio sobrejacente e adicionar 600 mL HBS / D contendo 0,1% de saponina. Nota: Estes irão servir como "100% de células-lise" controlos de lactato desidrogenase (LDH), ensaio de libertação para ser conduzido em paralelo (ver abaixo).
4. Incubar durante 60 min no escuro a 37 ° C.
5. No final do ensaio de ascorbato-efluxo, aspirar-se rapidamente 500 mL de cada poço e adiciona ao apropriadamente marcada poços de uma placa de 24 poços. Nota: para as células em suspensão, inicialmente remover as células por centrifugação a 4 ° C.
6. Adicionar 300 mL alíquotas do sobrenadante para uma placa de 96 poços e, em seguida, ler a 593 nm.

4. Determinação de ascorbato Extracelular

1. Leia os valores de absorbância dos poços a 593 nm.
2. Calcula-se a quantidade de ácido ascórbico extracelular como nmoles de ascorbato por mg de proteína (ou por milhão de células) tal como descrito para a determinação de ácido ascórbico intracelularno Passo 1.5.4. Nota: o utilizador final deve optimizar as condições de forma que a libertação de ascorbato não é limitada por ascorbato intracelular.

5. Determinação da LDH Lançamento

1. Com os restantes 200 mL de solução extracelular a partir de cada amostra de realizar um ensaio de libertação de LDH ^32,41 para determinar a extensão da lise celular. Nota: calcular como% da LDH releasable total. Determinar LDH libertável a partir das amostras que foram tratadas com 0,1% de saponina.

Resultados

Determinação de ascorbato intracelular em células cultivadas de suspensão

No primeiro ensaio (Figura 1), o ácido ascórbico intracelular é determinada, na sequência específicas de ascorbato (isto é, AO-sensível) redução de ferricianeto de ferrocianeto, utilizando a determinação altamente sensível do ferrocianeto de um processo publicado previamente ^37. A detecção de ascorbato é baseado na quelação colorimétrico de ferro ferroso que é gerado pela redução depen...

Discussão

Neste artigo, apresentamos dois ensaios de microplacas colorimétricos rápidos, específicos e relativamente sensíveis para a determinação de ácido ascórbico derivado dos compartimentos intra e extracelulares em células em cultura. Os ensaios podem ser concluída com acesso a equipamento de laboratório e reagentes. O reagente apenas moderadamente dispendioso necessário para o ensaio é de AO, que é essencial, uma vez que confere um elevado grau de especificidade para o analito L-ascorbato. Os ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de fundo plano Nunc de 96 poços	Thermo	269620	Qualquer placa de fundo plano de 96 poços pode ser usada
Microcentrífuga de bancada refrigerada	Eppendorf	5415D	Uma microcentrífuga não refrigerada que foi equilibrada à temperatura em uma câmara fria também pode ser usada
Centrífuga de bancada refrigerada	Eppendorf	5810R	Balde
oscilanteBio-Rad Benchmark Plus Espectrofotômetro de microplacas	Bio-Rad		Qualquer espectrofotômetro de microplacas capaz de ler a 593 nm pode ser usado e é recomendado. Se um leitor de placas baseado em filtro for usado, escolha o comprimento de onda mais próximo possível e use o método de curva padrão.
Ependorf MixMate (misturador orbital de microplacas)	Eppendorf		Este é um misturador de microplacas muito versátil e confiável e funciona muito bem para esses ensaios
Tampões
Solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4
Solução salina tamponada com MOPS (MBS); 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7,3
MBS + 5 mM de D-glicose (MBS/D)
solução salina tamponada com HEPES + 5 mM de D-glicose (HBS/D); 137 mM de NaCl, 5,2 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2• 2 H2O, 0,8 mM MgSO4• 7 H2O, 5 mM de D-glicose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7,3)
Tampão de permeabilização celular (CEC; 0,1% de saponina em PBS)
Produtos químicos
Ácido L-ascórbico ou L-ascorbato de sódio	Sigma-Aldrich		Preparações de maior pureza devem ser obtidas
Dímero de ácido desidro-L-ascórbico (DHA)	Sigma-Aldrich	30790	As soluções aquosas teoricamente produzem 2 moles de monômero de DHA por mol de dímero de DHA
Citocalasina B	Sigma-Aldrich	C6762	Soluções de estoque preparadas em DMSO ou etanol
Ascorbato oxidase (AO)	Sigma-Aldrich	A0157	As soluções de estoque (120 U/ml) podem ser preparadas em PBS ou MBS e depois congeladas em alíquotas
Ferricianeto de potássio (FIC)	Sigma-Aldrich	455989	Trihidrato
Fereno-S (3-(2-piridil)-5,6-di(2-furil)-1,2,4-triazina-5′,5′ ′-sal dissódico de ácido dissulfônico)	Sigma-Aldrich	92940
L-glutamato de sódio	Sigma-Aldrich
L-glutamina	Sigma-Aldrich
Saponina	Sigma-Aldrich	47036	Preparar uma solução-mãe a 0,1%
de estoque para ensaio
3 M acetato de sódio (pH 6,0)
Ácido
0,2 M ácido
3,3 mM FeCl3 em 0,1 M ácido
30 mM fereno-S
50% (v/v) ácido acético + 30% (p/v) ácido tricloroacético (TCA)
Soluções de reserva para ensaio
AO (120 U/ml)
2,4 mM fereno-S
0,12 mM FeCl3 em citrato