O nosso laboratório desenvolveu hidrogéis de poliacrilamida reticulada-ADN, um sistema dinâmico de hidrogel, para compreender melhor os efeitos da modulação da rigidez do tecido sobre a função das células. Aqui, nós fornecemos esquemas, descrições e protocolos para preparar estes hidrogéis.
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Artigo de método
Preparação de ADN de poliacrilamida reticulada-hidrogéis
Neste artigo
Resumo
Resumo
Mechanobiology é uma área científica emergente que aborda o papel crítico de pistas físicas em dirigir a morfologia ea função das células. Por exemplo, o efeito da elasticidade do tecido em função celular é uma importante área de pesquisa por causa da rigidez do tecido mechanobiology modula com a doença, o desenvolvimento, e a lesão. Materiais imitando tecido-estática, ou materiais que não podem alterar a rigidez vez células são banhados, são predominantemente utilizados para investigar os efeitos da rigidez do tecido sobre as funções celulares. Embora as informações recolhidas a partir de estudos estáticos é valiosa, esses estudos não são indicativos da natureza dinâmica do microambiente celular in vivo. Para melhor enfrentar os efeitos da rigidez dinâmica em função das células, foi desenvolvido um sistema de poliacrilamida hidrogel reticulado-DNA (géis de DNA). Ao contrário de outros substratos dinâmicos, géis de DNA tem a capacidade de aumentar ou diminuir a rigidez após a fabricação, sem estímulos. Geles de ADN consistem de ADN crosslAs tintas que são polimerizados em uma espinha dorsal de poliacrilamida. Adição e remoção de ligações cruzadas através da entrega de DNA de fita simples permite temporais, espaciais e controle reversível da elasticidade gel. Temos demonstrado em relatórios anteriores que a modulação de elasticidade dinâmico gel DNA influencia o comportamento de fibroblastos e neurônio. Neste relatório e vídeo, nós fornecemos um esquema que descreve os mecanismos de reticulação do gel de DNA e instruções passo-a-passo sobre os géis de preparação de DNA.
Introdução
Substratos estáticos e dinâmicos são duas categorias de biomateriais que foram desenvolvidas para estudar os efeitos de elasticidade do tecido, ou em função da rigidez das células. Substratos estáticos são incapazes de alterar as suas propriedades físicas depois de serem fabricadas e / ou uma vez as células são banhados. Poliacrilamida (PA) foram os primeiros géis bidimensionais substratos, estáticas que foram sintetizadas para investigações mechanobiology 5,17. Geles PA são fáceis de preparar, barato, versátil e pode ser fabricado com uma ampla gama de módulos elásticos. Embora essas vantagens técnicas fazem PA géis um substrato comumente aplicado, substr....
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Protocolo
NOTA: O protocolo inteira de preparação gel para processamento de células tem um mínimo de seis dias. Tempo estimado para preparo do gel é de 8 horas, mais um O / N incubação. Tempo estimado para imobilização gel e recozimento DNA é de 8 horas, mais uma etapa O / N enxaguar. Tempo estimado para a funcionalização gel é de 2 horas. Tempo para a galvanização e crescimento das células é dependente do tipo de cultura e de aplicação, mas é necessário um mínimo de quatro dias.
1 Preparação do Gel de DNA
Nota: Preparar géis de DNA em três etapas distintas. Primeiro, polimerizar individualmente SA1 e SA2 ssDNA em um back....
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Resultados
Antes de nossos estudos, interações célula-ECM foram observados em biomateriais compatíveis estáticas ou dinâmicas em substratos irreversíveis e unidirecionais. Estes substratos não refletem com precisão a natureza dinâmica do microambiente celular. Nosso trabalho muda os paradigmas técnicos existentes, fornecendo um modelo mais fisiológico para estudar as interações célula-ECM no amolecimento e endurecimento biomateriais dinâmicos. Em estudos anteriores, foram analisados os efeitos de substratos dinâmicos em células .......
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Discussão
A capacidade dos geles de ADN para amolecer ou endurecer antes e após a adesão das células torna-os um modelo ideal para estudar o papel da rigidez do tecido dinâmico em função da célula. Todos os três modelos têm sido utilizados em estudos biológicos e mecânicos. No entanto, todos os três modelos têm elasticidade semelhantes em várias percentagens de reticulação, que indica o comprimento de reticulação não influenciar a elasticidade de gel do DNA (Tabela 2). Em contraste, a concentração de acrilamida a.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer: Dr. Frank Jiang, Dr. David Lin, Dr. Bernard Yurke e Dr. Uday Chippada por suas contribuições sobre o desenvolvimento da tecnologia do gel de DNA; Dr. Norell Hadzimichalis, Smit Shah, Kimberly Peterman, Robert Arter pelos seus comentários e edições deste manuscrito; fontes de financiamento, incluindo a Comissão Jersey New on Spinal Cord Research (Grant # 07A-019-SCR1, NAL) e New Jersey Institute Neuroscience (MLP); e editores de Engenharia de Tecidos, Parte A permissão para reimprimir Figuras 2 e 4 e Biomateriais permissão para reimprimir figura 3.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| ssDNA | Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com | Não vórtice ssDNA. Inverta suavemente o frasco para injetáveis e/ou a solução de pipeta para misturar. | |
| PBS com cálcio e magnésio | Qualquer marca. | ||
| 100x tampão Tris-EDTA (tampão TE) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com | T9285 | |
| 10x tampão Tris-Borato-EDTA (tampão TBE) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | 93290 | TBE é uma toxina reprodutiva. |
| Solução de acrilamida a 40% | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) | BP14021 | A acrilamida é uma toxina. |
| Persulfato de amônio (APS) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | A3678 | Prepare uma solução a 2% em tampão TE. APS é uma toxina e irratante. |
| Tetrametiletilenodiamina (TEMED) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | T9281 | Prepare uma solução a 20% em tampão TE. TEMED é inflamável, corrosivo e toxina. |
| Tampa de lamínula redonda de 12 mm de diâmetro | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) fishersci.com | 12-545-82 | |
| Adesivo óptico Norland | 72 Norland Products (Cranbury, NJ) norlandprod.com | NOA72 | |
| Placa | Qualquer marca. | ||
| microcentrífuga | Qualquer marca. | ||
| Sulfo-SANPAH | ProteoChem ou Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com ou thermofisher.com | C111 ou 22589 | Prepare uma solução de 0,315 mg/ml em água imediatamente antes de usar. Dissolva a 37 > C e esterilizar por filtro. É normal observar sulfo-SANPAH não dissolvido no filtro. Sulfo-SANPAH é sensível à luz e, portanto, a solução deve ser protegida da luz até a exposição aos raios UV. |
| Poli-D-lisina (PDL) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | P6407 | Prepare uma solução de 0,2 mg/ml em água e filtre e esterilize. |
| Affymetrix de colágeno tipo I | (Santa Clara, CA) affymetrix.com | 13813 | Prepare uma solução de 0,2 mg/ml em ácido acético 0,2 N. A solução precisa permanecer fria o tempo todo para evitar a polimerização. O ácido acético é inflamável, tóxico e corrosivo. |
| Tampa de vidro 22 x 60 | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) | 12-544-G | |
| Pipeta de deslocamento positivo | Gilson, Inc (Middletown, WI) gilson.com | F148504 | |
| Bloco de calor | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) | 11-718 | |
| Fonte | Coloque os géis o mais próximo possível da luz UV. A luz UV pode causar lesões na pele ou nos olhos. | ||
| Termômetro | Qualquer marca. | ||
| Gás nitrogênio | GTS-Welco (Flemington, NJ) www.praxairmidatlantic.com/ | NI 5.0UH-R |
Referências
- Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).
- Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A.
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