Nós já desenvolveu uma técnica para implantar fios tetrode no complexo central do cérebro de barata que nos permite monitorar a atividade em unidades individuais de baratas amarrados. Aqui apresentamos uma versão modificada do que a técnica que nos permite também gravar a atividade cerebral em insetos se movendo livremente.
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Artigo de método
Extracelular Fio Tetrode Gravação em Cérebro de Livremente Andando Insetos
Neste artigo
Resumo
Resumo
O crescente interesse no papel de atividade cerebral no controle motor inseto exige que sejamos capazes de monitorar a atividade neural enquanto insetos executar o comportamento natural. Nós já desenvolveu uma técnica para implantar fios tetrode no complexo central do cérebro de barata que nos permitiram gravar a atividade de vários neurônios simultaneamente, enquanto uma barata amarrados virou velocidade de caminhada ou alterado. Enquanto um grande avanço, os preparativos amarrados fornecer acesso a comportamentos limitados e muitas vezes não têm os processos de feedback que ocorrem em animais movendo-se livremente. Apresentamos agora uma versão modificada do que a técnica que nos permite gravar a partir do complexo central da movendo-se livremente baratas como andam em uma arena e lidar com as barreiras, transformando, escalada ou tunelamento. Juntamente com o vídeo de alta velocidade e de corte cluster, agora podemos relacionar a atividade cerebral de vários parâmetros do movimento de insetos comportando livremente.
Introdução
Este artigo descreve um sistema bem sucedido para a gravação de neurônios dentro do complexo central (CC) da barata, discoidalis Blaberus, como o inseto entra em uma arena e lida com objetos que fazem com que se virar, túnel sob, ou passar por cima de obstáculos. Os fios podem também ser ligados a um estimulador de evocar actividade no neuropil circundante, com as consequentes alterações comportamentais.
Na última década, considerável atenção tem sido direcionada para os papéis desempenhados por várias regiões do cérebro em controlar o comportamento de insetos. Grande parte desse foco foi direcionado para as neuropils cerebrais da linha média que são referidos coletivamente como o complexo central (CC). Registaram-se progressos, como resultado de uma ampla variedade de técnicas que visam questões sobre o papel do CC no comportamento. Essas técnicas variam de manipulações neurogenéticos, principalmente em Drosophila, juntamente com behavianálise oral, 1-3, a técnicas eletrofisiológicas que monitoram a atividade neural dentro do CC e tentativa de relacionar a atividade com os parâmetros comportamentais relevantes.
Técnicas eletrofisiológicas incluem gravação intracelular de neurônios individuais identificados 4-9 e gravação extracelular, muitas vezes com múltiplas sondas canal 10,11. Estas duas técnicas são gratuitos. Gravação intracelular com eléctrodos cortantes ou remendo célula completa fornece dados muito pormenorizados sobre neurónios identificados, mas está limitada a uma ou duas células ao mesmo tempo, requer pouco ou nenhum movimento, e pode ser mantido durante períodos relativamente curtos de tempo. Gravações extracelular pode ser facilmente configurado, não necessitam de restrição, e pode ser mantido por horas. Com tetrodes multicanal e corte cluster, bastante grandes populações de neurônios podem ser analisados simultaneamente 9,12. Enquanto PATC célula inteirah foi usado com sucesso em insetos amarrados 13, sentimos que há também uma necessidade de técnicas que nos permitem gravar a atividade neural no cérebro por longos períodos de tempo em se comportando livremente insetos como eles lidam com as barreiras ao movimento para a frente.
A necessidade de gravar como os insetos se move e salta para cima e para baixo nos empurrou em direção a métodos de gravação extracelulares. Tivemos sucesso em boa gravação preparações contido com comercialmente disponíveis sondas 16 canais de silício 11, no entanto, o tamanho pequeno do mesmo grandes baratas significa que as sondas têm de ser montados fora do corpo. Isso, juntamente com a delicadeza dos dentes sonda, fez uma preparação inadequada para andar livre. Em dois projetos anteriores, foram utilizados feixes de fios finos, formando uma tetrodo para realizar propriedades de gravação semelhantes, mas em um arranjo mais robusto. Estes pacotes tetrode nos permitiu gravar a partir de baratas amarrados umd relacionar atividade unidade CC às mudanças na velocidade de andar 14 e virando comportamento resultante do contato da antena com uma haste 10.
Por mais útil que estas preparações amarrados foram e continuarão a ser, eles apresentam algumas limitações. Em primeiro lugar, os comportamentos que o inseto pode executar são limitados a um avião. Ou seja, poderíamos facilmente evocar mudanças na velocidade de caminhada ou de viragem, mas as ações de escalada e túnel não fosse possível, pelo menos com o arranjo típico corda. Em segundo lugar, os preparativos estão amarrados "circuito aberto". Ou seja, eles não permitem o retorno normal de movimento relacionado ao sistema. Assim, como a barata ligado a corda, o mundo visual não foi alterado em conformidade. É possível construir sistemas de amarrar em malha fechada para introduzir este tipo de feedback. No entanto, eles são limitados pela complexidade da programação e de hardware do ambiente visual simulada. Nevertheless, sentimos que poderíamos melhorar nossos métodos de gravação amarrados existentes através da gravação a partir do animal, uma vez que andava livremente em uma arena ou pista e objetos encontrados como faria em seu ambiente natural.
Embora os sistemas sem fios para registo da actividade do cérebro 15 seria o ideal, os sistemas actuais têm limitações no número de canais de gravação, o tempo de aquisição de dados, a duração da bateria e do peso. Nós, portanto, optou por tentar adaptar o nosso sistema de gravação tethered para uso em preparações se movendo livremente. Como melhores sistemas sem fios tornar-se disponíveis, esta técnica pode ser facilmente adaptado a esses dispositivos. O sistema que é descrito neste artigo é leve, funciona muito bem e parece ter pouco efeito deletério sobre o comportamento da barata. Com uma câmara de alta velocidade e de baixo custo de software de corte de cluster, actividade em neurónios individuais do cérebro pode ser relacionada com o movimento. Aqui nós descrevemos a preparção dos fios tetrode e sua implantação no cérebro do inseto, bem como as técnicas de gravação de atividade elétrica e movimento e como esses dados podem ser reunidos para análise posterior.
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Protocolo
1. Preparação de Fios TETRODE
- Puxe um fio de nicromo muito fina (12 mM de diâmetro, revestimento PAC) de cerca de 1,1 m de comprimento. Prenda uma etiqueta de fita para cada extremidade. Pendurar o fio ao longo de um varão roscado horizontal de tal modo que as duas extremidades estão à mesma altura perto da bancada.
- Repita o passo 1.1 para um segundo fio, fazendo mais duas extremidades para um total de 4, e colocá-lo ao lado do primeiro fio (cerca de 1 cm entre eles).
- Fure as quatro pontas com uma etiqueta de fita e coloque a tag para um dispositivo de enrolamento rotativo motorizado. Este dispositivo pode ser feito a partir de um motor de corrente contínua de baixo custo.
- Enrole o tetrode em uma direção por 2 min (60 rpm) e descontrair-lo na direção oposta para 30 seg.
- Use uma pistola de calor para fundir os fios juntos. Não toque nos fios com a arma. Use três para cima e para baixo, passa a partir de direções alternadas, a cada passagem, tendo cerca de 10 seg.
- Cortar a parte superior e a parte inferior dos fios enrolados. Os quatro fios são trançados umd fundidos juntos numa extremidade, mas separam-se do outro.
- Adicionar o tubo de suporte. Corte um comprimento 30 centímetros de tubo de polietileno (diâmetro: dentro de 0,28 milímetros, 0,61 milímetros fora). Passe o tetrodo muito lentamente e cuidadosamente para dentro do tubo de apoio, de modo que ele não dobre.
- Uma vez que a extremidade fundida aparece para o outro lado, puxá-lo de forma a que haja um comprimento igual de fios em ambas as extremidades do tubo de guia.
- Agarre a final em separado de cada fio com uma pinça. Utilizando a base da chama de um queimador de gás, queimar cuidadosamente o material isolante do último 2 ou 3 mm de cada um dos fios. Aqueça o fio até que ele brilha, mas não enrolar.
- Conecte o tetrode com um adaptador de tomada IC masculino-feminino que se encaixa o seu dispositivo de gravação. Coloque a extremidade deinsulated de cada fio em uma tomada diferente do adaptador com uma pinça. Estabilize o fio no soquete com um pequeno pino de metal. Use um ferro de solda ponta fina e preencha o soquete com a solda derretida. Tenha cuidado para não entrar em contatoo fio frágil com o ferro de solda.
- Verificar a impedância de cada fio e a entre a impedância de cada par de fios.
- Coloque a fundido, a extremidade torcido em um recipiente de solução salina e conectar um condutor de fio de cobre a partir da solução salina para o medidor de ohm.
- Ligar a outra extremidade do medidor para o pino encaixe contendo o arame. A impedância de cada fio deve ser inferior a 3 mohms.
- Se os valores acima não são atingidos, tente novamente as conexões de solda.
- Retire os fios do soro fisiológico, lavar as pontas com água, e testar a impedância entre fio para cada par (n = 6). As inter impedância deve estar acima de 5 mohms.
- Se os valores acima não são atingidos, corte uma pequena quantidade da ponta off no final fundido e teste novamente.
- Descarte qualquer conjunto de arame que não atende às exigências de impedância para todos os fios.
- Fixe o tetrode.
- Dobre uma pequena caixa de papel rectangular slightly maior do que o adaptador de tomada.
- Transfira o adaptador na caixa com o lado macho na parte inferior. Penetram na caixa de tal forma que todos os pinos de o lado macho estão fora da caixa, enquanto o resto da placa está dentro da caixa.
- Tape os cantos da caixa do lado de fora. Use pequenos pedaços de fita adesiva de dupla face no lado de dentro da caixa para estabilizar quaisquer fios individuais de fios. O fio deve ser fundida à medida que sai da caixa.
- Misture rapidamente definir epóxi 2 parte e despeje na caixa para garantir o adaptador e todos os fios.
- Anexar a extremidade próxima do tubo de guia para um lado da caixa, com impressões dentárias, mas deixam o tubo de tal forma que abra o tetrodo pode ser puxado através livremente em ambas as extremidades.
- Afie a tetrode.
- Antes de cada experiência, corte a ponta do tetrodo com uma lâmina de bisturi afiada, não tesoura. Isto impede de esmagamento e espalhamento de as extremidades dos fios, proporcionando uma borda plana limpa para o próximo passo.
- Use uma pequena ferramenta rotativa montado verticalmente, com discos de lixa média e fina (estes podem ser combinados em uma única plataforma) para polir a tetrode e remover algum isolamento ponta. Segure o pacote perto do fim com uma pinça. Inclinar a definir a extremidade do fio para um ângulo de 45 ° em relação ao disco de lixar e suavemente tocá-lo para o disco giratório a velocidade moderada durante cerca de 1 ou 2 segundos cada um no meio e em seguida os grãos finos. Repita este mais três vezes, axialmente rotativo o feixe 90 ° de cada vez. É crítico que a direcção de rotação dos discos de lixar é afastado do ângulo raso de as extremidades do cabo, de outro modo a separação dos cabos pode ocorrer.
- O resultado desejado transforma o pacote final a partir de um bordo rectilíneo a uma ponta aguçada, com pequenas quantidades de isolamento removido da extremidade de cada fio. Verifique o ponto de usar um microscópio de dissecação antes do plaqueamento o tetrode. Se algum desgaste ocorre na ponta, recut e repolir.
- Se o teste de impedância durante o subsequpasso ent chapeamento mostra extremamente baixos valores inter-fio (menos do que 4 mohms), que indica muito material removido durante a etapa de polimento. Recorte e repolir o tetrode.
- Placa do tetrode. Colocar a ponta da tetrodo em uma solução saturada de sulfato de cobre (85 ml de água, de ácido sulfúrico a 5 ml, 50 g de sulfato de cobre). Placa de cada arame com uma corrente de 2,5 mA, com um isolador de estímulo. Injetar a corrente por 1 segundo, pause por 1 segundo e repita este processo de 4x.
- Verificar a impedância de cada fio e a interimpedance de cada par de fios. A impedância de cada fio deve estar compreendida entre 0,5-1 mohms e inter impedância deve ser acima de 4 mohms.
- Monte o adaptador na headstage de um sistema de gravação multicanal.
- Anexar um pino inseto se inclinou para um micromanipulador. Prenda a ponta do tetrode ao pino inseto com cera dental
- Antes de cada experiência, corte a ponta do tetrodo com uma lâmina de bisturi afiada, não tesoura. Isto impede de esmagamento e espalhamento de as extremidades dos fios, proporcionando uma borda plana limpa para o próximo passo.
2. Preparação animal
- Anestesiar oBarata com gelo.
- Após a barata pára de se mover, conter a barata verticalmente contra uma superfície plana de cortiça com grandes pinos de sela que estendem o inseto, mas não penetrar em qualquer parte de seu corpo.
- Transferir a preparação em um recipiente de plástico e colocá-gelo à volta do animal para minimizar os movimentos do corpo do fluxo sanguíneo e.
- Coloque um colar de plástico no pescoço para apoiar a cabeça e colocar cera dental em torno da cabeça para estabilizá-lo.
- Corte uma pequena janela entre o ocelos com uma lâmina de barbear e remover a cutícula da cabeça.
- Remover tecidos conjuntivos e gordura com uma pinça para expor o cérebro.
- Colocar um pouco de soro fisiológico barata na cápsula cabeça para cobrir o tecido cerebral.
- Para desheath o cérebro, utilizar uma pinça fina para agarrar suavemente a bainha na parte superior do cérebro e utilizar outro pinça fina para rasgar o invólucro para além de fios da área de implante.
- Abra um pequeno buraco na cabeça cápsula anterior à sagacidade cérebroh um pino de inseto. Insira uma trança de três diâmetros maiores (56 um) com isolamento de fios de cobre no furo para servir como um eletrodo de referência / chão.
- Abaixe a ponta do tetrode à superfície do cérebro com o micromanipulador e posicioná-lo próximo a região do cérebro de interesse.
- Com cuidado, coloque dois pequenos pedaços de folha de acetato fino (2 mm x 1 mm), ligeiramente maior do que o buraco na cápsula cabeça, anterior e posterior à tetrode.
- Ligue o sistema de gravação.
- Lentamente abaixe o tetrode 150-250 mM abaixo da superfície do cérebro, dependendo da qualidade de gravação.
- Desligue o sistema de gravação.
- Mover os dois pedaços de chapa de etilo como perto do tetrodo possível sem tocá-lo (Figura 1A).
- Aquece-se uma pequena espátula ou agulha hipodérmica achatada e colocá-lo em cera dentária tal que existe cera líquida na ponta da espátula. Tocar com cuidado a extremidade de cada pedaço de folha de acetato a partir doTETRODE com a espátula de modo a que a cera líquida pode fluir para cada pedaço e vedar a folga entre ele e a cabeça da cutícula.
- Repita o passo 2.16. Largar uma pequena quantidade de cera líquida sobre a folha de acetato de cada vez. Inicie o processo longe da tetrode e mover-se gradualmente em direção a ela. Eventualmente o tetrode será ancorado por cera dental. Evite ficar cera quente para dentro da cavidade e para o cérebro.
- Use o mesmo método que os passos 2.16 e 2.17 para ancorar o eletrodo de referência / chão com cera.
- Aquece-se a cera que se liga a tetrodo para o micromanipulador para libertar o tetrodo a partir dele.
- Passe o tetrode na cera dental na cabeça para proporcionar um alívio de tensão (Figura 1B).
- Cubra o ciclo de alívio de tensão com cera dental (Figura 1C).
- Retire cuidadosamente as restrições e transferir a preparação para uma placa de Petri. Contenha lado a preparação dorsal com grandes pinos de sela.
- Anexaruma haste ao pronotum usando uma pistola de cola. Este é um pedaço de madeira que se estende do pronoto sobre o abdome.
- Anexar a ponta do tubo tetrodo para a extremidade posterior da haste com cera dental.
- Ancorar a tetrodo eo eletrodo de referência / terra até à extremidade anterior da haste com cera dental.
- Puxar o tetrodo da extremidade de encaixe do tubo, tanto quanto possível, mas não puxar nela, a fim de eliminar a possibilidade de que o animal pode danificar a parte do tetrodo fora do tubo (Figura 1D).
- Remover todas as restrições. Conecte o eletrodo de referência / terreno para a tubulação tetrode com cera dental.
- Espere pelo menos 60 minutos para que o animal se recuperar da anestesia gelo antes de qualquer experiência.
3. Procedimentos Experimentais
- Conecte um PC tanto com o sistema de gravação e uma luz LED usando um cabo USB para porta serial.
- Comece gravações neurais.
- Iniciar gravações de vídeo em 20 quadros por segundo para andar experimentos usando o pacote de aquisição de imagem Motmot 16 ou 120 fps para subir experimentos usando uma câmera de alta velocidade.
- Coloque a barata em um 40 cm x 40 cm Plexiglas arena para andar experiências ou de 58 centímetros de comprimento, 5 cm de largura e 5 cm de altura de arena para subir experimentos. A arena curta tem uma barreira transparente que se estende desde o centro da parede do lado direito para o centro da arena, acima do qual está localizado o andar de entrada. A barreira é usado para evitar que os animais de andar em áreas onde a visão da câmera é bloqueada pela headstage. A arena de escalada tem um bloco de acrílico (ambos 1,2 centímetros ou 1,8 cm de altura e 5 cm de largura) ou uma prateleira localizada a uma altura comparável no centro.
- Gerar um pulso TTL a partir do PC usando um comando personalizado MATLAB. (S = de série ("COM4 '); fopen (s); s.RequestToSend =' desligado '/ s.RequestToSend =' on '/; fclose (s); excluir (s) ;). O pulso TTL gera vezestamp para o sistema de gravação e ou liga ou desliga a luz LED.
- Permitir a barata para explorar a arena até que ele pára de se mover por mais de 30 segundos para andar experimentos. Permitir a barata, quer subir ao longo do bloco / prateleira ou um túnel através da plataforma para subir experimentos.
- Pare de gravações de vídeo.
- Pare gravações neurais.
- Anote o timestamp gerado pelo pulso TTL.
- Remover a barata da arena e esperar pelo menos 3 min.
- Repita os passos 3,2-3,10 para a próxima prova.
- Uma vez que todas as gravações de ter sido concluída, passar 5 seg de corrente de 5 mA DC através de uma das pontas de fio (ânodo) e o eléctrodo de referência (cátodo) para depositar o cobre no cérebro na ponta do fio.
4. Análise off-line
- Sincronizar vídeo e dados neurais ligando o quadro onde a luz do LED é ligado eo timestamp registrado pelo sistema de gravação emnesse momento.
- Marcar locais ponta do fio. Use procedimentos de intensificação Timms para precipitar e observar o cobre em 12 mM cortes seriados 17. Proeminentes depósitos devem ser visíveis em 3-8 secções adjacentes (cerca de 18-48% do comprimento da placa ventral dorsal da área que gravar a partir de) (Figura 2).
- Correlacionar impulsos elétricos específicos para a atividade de neurônios individuais. Siga pico procedimentos de classificação estabelecidos em detalhe em outro lugar 10,14,18. Use o programa KlustaKwik (versão 1.5, autor K. Harris, da Universidade Rutgers) para gerar, clustering automatizada inicial. Importá-los para o programa MClust (versão 3.5, os autores AD avermelhado et al., Da Universidade de Minnesota), para posterior refinamento e análise (Figura 3).
- Acompanhe os movimentos da barata. Para experiências que anda, extrair a posição (visual), o centro da barata da massa e a sua orientação do corpo em cada quadro da vidEO gravações usando o Caltech múltipla Fly Tracker (versão 0.1.5.6; http://ctrax.sourceforge.net/) ea caixa de ferramentas FixErrors associado para MATLAB 19. Para subir experiências, extrair a posição do bloco e cabeça da barata e pronoto em cada quadro do vídeo usando o pacote de software de análise de movimento.
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Resultados
Gravamos a atividade neural de 50 unidades do CC em 27 preparações para experiências de locomoção. Para 15 dessas preparações (23 unidades), as experiências de escalada também foram realizadas. Unidades individuais são nomeados de acordo com números de preparação e de unidade (por exemplo, unidade de 1-2 indica preparação 1, unidade 2).
Instantâneos do vídeo de um ensaio de escalada são mostrados na Figura 4. Todo o vídeo está disponível em vídeo su...
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Discussão
Enquanto os estudos eletrofisiológicos anteriores sobre o CC ou de outras regiões do cérebro do inseto nos forneceu insights sobre a central de controle do comportamento, a maioria deles foram realizados tanto em preparações contido 9,11 ou aqueles amarrados 10,14. Como resultado, o animal de experiência sensorial e estado fisiológico pode ser muito diferentes daqueles em um ambiente natural. Além disso, as tarefas de comportamento que o animal pode realizar são limitados a um avião nessas situaçõe...
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Os autores agradecem Nick Kathman para sugestões e ajudar na preparação para o manuscrito. Esta técnica foi desenvolvida em conjunto com o trabalho apoiado pela AFOSR sob concessão FA9550-10-1-0054 e da National Science Foundation, Grant No. IOS-1120305 para RER.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fio de nicromo | Tecnologia de aquecimento Sandvik | Kanthal RO-800 | Uso para tetrodo |
| Tubulação de polietileno biomédica | A-M Systems | 800700 | Uso para tubulação de tetrodo |
| Lynx-8 | Neuralynx | Uso para gravação de várias unidades | |
| Cheetah 32 | Neuralynx | Uso para gravação de várias unidades | |
| Câmera de alta velocidade | Basler | A602f | Uso para gravação de vídeo para experimentos de caminhada |
| Câmera de alta velocidade | Casio | EX-FC150 | Use para gravação de vídeo para experimentos de escalada |
| WINanalyze | Winanalyze | versão 1.4 3D | Use para rastreamento de vídeo |
| MATLAB | MathWorks | MATLAB R2012b | Uso para geração de pulso TTL e análise de dados offline |
Referências
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Reimpressões e permissões
