Proteína Consenso Brain-derivada, protocolo de extração para o Estudo do cérebro humano e murino Proteome Usando ambas 2D DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

Summary

Um protocolo de extração de proteínas comum utilizando tampão uréia / tiouréia / SDS para tecido cerebral humano e camundongos permite indentification de proteínas por 2D-DIGE e sua posterior caracterização por mini-immunoblotting 2DE. Este método permite a obtenção de resultados mais reprodutíveis e confiáveis ​​a partir de biópsias humanos e modelos experimentais.

Abstract

Electroforese em gel bidimensional (2DE) é uma ferramenta poderosa para detectar modificações proteoma potencialmente relacionados com diferentes condições fisiológicas ou patológicas. Basicamente, esta técnica baseia-se na separação de proteínas de acordo com o seu ponto isoelétrico, num primeiro passo, e em segundo lugar de acordo com os seus pesos moleculares por electroforese SDS em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Neste relatório, um protocolo de preparação da amostra otimizado para pouca quantidade de post-mortem e cérebro do rato tecido humano é descrito. Este método permite efectuar tanto a electroforese bidimensional em gel diferença de fluorescência (2D-DIGE) e mini-imunotransferência 2DE. A combinação destas abordagens permite não só para encontrar novas proteínas e / ou modificações de proteínas em sua expressão, graças à sua compatibilidade com detecção por espectrometria de massa, mas também uma nova visão sobre a validação de marcadores. Assim, mini-2DE acoplado a licenças de Western blotting para identificar e validar pós-Translacionais modificações, proteínas catabolismo e fornece uma comparação qualitativa entre diferentes condições e / ou tratamentos. Aqui, nós fornecemos um método para estudar componentes de agregados de proteínas encontradas na DA e demência de Lewy, como o peptídeo beta-amilóide e da alfa-sinucleína. O nosso método pode assim ser adaptado para a análise do proteoma e proteínas insolúveis extrair a partir de modelos de tecido do cérebro e ratos humanos também. Em paralelo, pode fornecer informações úteis para o estudo de vias celulares e moleculares envolvidos em doenças neurodegenerativas, bem como potenciais novos biomarcadores e alvos terapêuticos.

Introduction

Os transtornos mentais e neurológicos representam 13% da carga global de doenças, novos desafios, como os mecanismos fisiopatológicos, fatores de risco e biomarcadores prodromal deve ser explorado ^1. Em linha com esse objetivo, proteômica estudos do cérebro humano tornou indispensável para descobrir vias moleculares envolvidas em processos como a memória, o comportamento, as emoções e plasticidade neuronal, por exemplo, não só para o fisiológico, mas também para condições patológicas. Portanto, a utilização de modelos animais e, mais especificamente, os ratinhos transgénicos, leva uma ampla gama de possibilidades para imitar a etiologia de desordens neurod....

Protocol

1. Homogeneização e extração de proteínas de tecido do cérebro humano e do rato

1. Homogeneização do tecido cerebral. Homogeneizar o tecido cerebral de 10% (w / v) em 8 M de ureia, 2 M tioureia e 1% w / v de tampão de SDS (UTS) com um vidro Potter (para amostras humanas) ou Teflon homogeneizador (para as amostras de ratos). Sonicate a 60 Hz 30 pulsos com um gerador de ultra-som de aplicar 0,5 seg para a desintegração do tecido total de ^{13, 14.}
   1. Determinar a concentração de proteína, com ensaio de Bradford, utilizando BSA como padrão. Este tampão de extracção de UTS é totalmente compatível com uma dimensão de SDS-PAGE, enquanto lisados ​​não....

Results

Proteômica no tecido cerebral continua sendo um desafio uma vez que não existe tampão ideal para recuperar 100% de proteínas, as proteínas do citoesqueleto, especialmente associada membrana ou. O primeiro conjunto de experimentos foram focados na busca de um tampão de lise adequado compatível com as duas abordagens e que permite recuperar um grande painel de proteína. Assim, três tampões de lise foram ensaiadas para determinar o mais adequado. Em primeiro lugar, utilizou-se o tampão de biologia molecular e bioquímica co.......

Discussion

Descobrindo as mudanças de expressão de proteínas patológicas, busca de biomarcadores ea modulação de vias potenciais para alvos farmacológicos estão entre os objectivos dos neuroproteomics aproxima ^30. Entre as ferramentas emergentes, o campo 2DE adiciona uma expectativa promissora. No entanto, um consenso deve ser atingido de modo a minimizar a variabilidade e aumentar a reprodutibilidade dos experimentos. Na linha de esta ideia de um protocolo padronizado para realizar 2D-DIGE (Figura 2) e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo	GE Healtcare	25-8010-65
Immobiline DryStrip	GE Healtcare		Referência em função do intervalo/tamanho do pH
IPG Buffer, pH X-X	GE Healtcare		Referência em função do intervalo de pH desejado
AMBERLITE IRN-150L RESINA DE LEITO MISTO 1	GE Healtcare	551797N
DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l	KIT CAIXA GE Healtcare	17-1335-01
IPG 1 * 1 KIT	GE Healtcare	28-9334-92	Caixa de plástico para fazer a reidratação passiva
Filtro MILLEX GS	Millipore	SLGS033SB
Criterion XT Géis Pré-moldados 13.3 x 8.7 cm (L x C)	Bio-Rad		Referência em função do MW para separar
a Unidade de Foco Isoelétrico IPGphor III	GE Healtcare	11-0033-64
Ettan DALTsix Sistema de Eletroforese Grande	GE Healtcare	80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm	Empresa de Gel	P2D1.5