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Artigo de método

Proteína Consenso Brain-derivada, protocolo de extração para o Estudo do cérebro humano e murino Proteome Usando ambas 2D DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

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DOI:

10.3791/51339

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10 de abril de 2014

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1Team Alzheimer & Tauopathies, Jean-Pierre Aubert Research Centre, Inserm UMR 837, 2EA 4308-Department of Reproductive Biology-Spermiology-CECOS, CHRU-Lille, 3EA2686-Laboratorie d'Immunologie, Faculté de Médecine - Pôle Recherche, 4Department of Neurology, CHRU-Lille

Neste artigo

Resumo

Um protocolo de extração de proteínas comum utilizando tampão uréia / tiouréia / SDS para tecido cerebral humano e camundongos permite indentification de proteínas por 2D-DIGE e sua posterior caracterização por mini-immunoblotting 2DE. Este método permite a obtenção de resultados mais reprodutíveis e confiáveis ​​a partir de biópsias humanos e modelos experimentais.

Resumo

Electroforese em gel bidimensional (2DE) é uma ferramenta poderosa para detectar modificações proteoma potencialmente relacionados com diferentes condições fisiológicas ou patológicas. Basicamente, esta técnica baseia-se na separação de proteínas de acordo com o seu ponto isoelétrico, num primeiro passo, e em segundo lugar de acordo com os seus pesos moleculares por electroforese SDS em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Neste relatório, um protocolo de preparação da amostra otimizado para pouca quantidade de post-mortem e cérebro do rato tecido humano é descrito. Este método permite efectuar tanto a electroforese bidimensional em gel diferença de fluorescência (2D-DIGE) e mini-imunotransferência 2DE. A combinação destas abordagens permite não só para encontrar novas proteínas e / ou modificações de proteínas em sua expressão, graças à sua compatibilidade com detecção por espectrometria de massa, mas também uma nova visão sobre a validação de marcadores. Assim, mini-2DE acoplado a licenças de Western blotting para identificar e validar pós-Translacionais modificações, proteínas catabolismo e fornece uma comparação qualitativa entre diferentes condições e / ou tratamentos. Aqui, nós fornecemos um método para estudar componentes de agregados de proteínas encontradas na DA e demência de Lewy, como o peptídeo beta-amilóide e da alfa-sinucleína. O nosso método pode assim ser adaptado para a análise do proteoma e proteínas insolúveis extrair a partir de modelos de tecido do cérebro e ratos humanos também. Em paralelo, pode fornecer informações úteis para o estudo de vias celulares e moleculares envolvidos em doenças neurodegenerativas, bem como potenciais novos biomarcadores e alvos terapêuticos.

Introdução

Os transtornos mentais e neurológicos representam 13% da carga global de doenças, novos desafios, como os mecanismos fisiopatológicos, fatores de risco e biomarcadores prodromal deve ser explorado 1. Em linha com esse objetivo, proteômica estudos do cérebro humano tornou indispensável para descobrir vias moleculares envolvidas em processos como a memória, o comportamento, as emoções e plasticidade neuronal, por exemplo, não só para o fisiológico, mas também para condições patológicas. Portanto, a utilização de modelos animais e, mais especificamente, os ratinhos transgénicos, leva uma ampla gama de possibilidades para imitar a etiologia de desordens neurodegenerativas humanas 2.

Abordagens proteômicas estão hoje disponíveis, a fim de realizar estas novas perspectivas no campo da neurociência. Electroforese em gel bidimensional (2DE) é um método simples e potente provável que permite comparar o proteoma de uma vasta gama de amostras. Além disso, é também umpoderoso método para isolar uma proteína a partir de uma mistura complexa, a fim de identificar e analisar mais por espectrometria de massa. Esta técnica consiste, essencialmente, em duas etapas sucessivas: 1) a separação de proteínas de acordo com o seu ponto isoeléctrico (pi) por isoelectrofocusing (IEF). Mais precisamente, um potencial elétrico é aplicado através das tiras de acrilamida Immobiline entre um gradiente de pH e, em seguida, as proteínas irão migrar e se concentrar em um pI determinado em função de sua carga líquida global. 2) proteínas Isoelectrically focadas são desnaturados e negativamente carregados pela adição de dodecilsulfato de sódio (SDS), desse modo as proteínas na sua primeira estrutura são separadas de acordo com o seu peso molecular aparente (MW) por SDS-PAGE 3. Estas duas propriedades distintas nos permitem enfrentar um duplo valor para ir mais longe no estudo do proteoma. Por um lado, esta abordagem oferece a possibilidade de realizar uma análise quantitativa utilizando corantes mínimas método 2D-DIGE, e por outro lado um qualitativanálise e por mini-2DE acoplada a transferência de western.

A análise quantitativa por 2D-DIGE concede a expressão da proteína muda todo o proteoma amostra. Resumidamente, as amostras são rotulados com três cianinas (Cy2, Cy3 e Cy5) emitindo em três comprimentos de onda diferentes (azul, verde e vermelho). Estes corantes fluor mínimo contendo grupo de éster N-hidroxi succinimidil reagir com o grupo ε-amino de lisinas de resíduos de proteínas, resultando em ligações covalentes amida 4. Resíduos de lisina são rotulados apenas entre 1-3% e evitando assim várias etiquetas por adição de proteína e grandes modificações carga líquida 5, 6. Cy3 e Cy5 são muitas vezes utilizados para rotular duas amostras independentes, enquanto Cy2 Tag uma mistura de igual proporção das amostras para comparar. As duas principais vantagens são de que todas as amostras marcadas são misturadas e IEF e SDS-PAGE são realizadas em um gel de uma só vez para cada passo, evitando inter variabilidade entre experiências, devido à géis de comparação. Além disso, apresenta-se um limiar de detecção de pico de cerca de 1 femtomole de proteína 7. Géis são digitalizados e software 2D compara as imagens de fluorescência de gel 2D, onde Cy2 serve como padrão interno permitindo a identificação de diferenças estatísticas entre os pontos para a sua posterior identificação por espectrometria de massa. O software de análise de 2D utilizando o padrão interno atinge uma rápida detecção de menos do que 10% das diferenças entre as amostras com mais de 95% de confiança estatística 8.

A análise qualitativa por mini-2DE é um passo crucial para a caracterização de proteínas. O princípio é o mesmo que anteriormente descrito para a separação de pI e PM, mas, neste caso, as proteínas são transferidas a partir de um pequeno gel de poliacrilamida para uma membrana e imunotransferência é executada posteriormente. Enquanto uma dimensão de electroforese em gel proporciona as alterações na expressão de proteína por um ou vários epitopos da proteína em função do anticorpo, o INFORMAÇÃOn de mini-2DE dota com dois parâmetros adicionais. Em primeiro lugar, os isovariants proteína mudar em função do pI, indicando que as modificações pós-traducionais pode ter lugar. Em segundo lugar, a identificação de espectrometria de massa pode ser um indicativo de zimogénios plausíveis e produtos do catabolismo de proteínas. Portanto, as modificações observadas por 2D-DIGE provavelmente indicativo dos mecanismos de mudanças no perfil global proteoma subjacentes. Alinhamentos de immunoblots entre várias amostras para o mesmo epítopo de proteína / s por mini-2DE podem refletir mudanças de acidez derramando luz em variações pós-traducionais pouco observados ou até mesmo não por immunoblotting monodimensional 9, 10. Além disso, esta análise informa sobre os potenciais locais de clivagem, devido ao conhecimento do pI e PM dos resíduos metabólicos 11,12.

A combinação destas duas técnicas proporciona uma análise proteômica complementar. Por um lado 2D DIGE oferece um tipe das diferenças, permitindo um isolamento precisa de polipéptidos, cuja expressão é diferente. Essas diferenças consistem essencialmente no aparecimento ou desaparecimento de uma mancha ou aumento / diminuição da intensidade de um dado, uma a análise dos géis fluorescentes software. No entanto, estas observações são, por si só não consegue explicar a natureza da modificação observada. Por estas razões, uma vez que o polipéptido é isolado e identificado por espectrometria de massa, a utilização de mini-2DE permite confirmar precisamente 1) A identidade da proteína isolada e 2) a natureza da diferença: a mudança no nível isovariant / isoforma expressão, modificações pós-traducionais e os processos de clivagem, por exemplo. No entanto, é necessário o desenvolvimento de um tampão de lise a partir tanto compatíveis com o 2D-DIGE e com mini-2DE, a fim de limitar as dispersões potenciais resultantes da utilização de protocolos de extracção que são muito diferentes.

No presente artigo, desdescrito um protocolo adaptado para a preparação, extracção e desempenho de 2D-DIGE e técnicas de mini-2DE de proteínas cerebrais provenientes de tecido humano e de rato.

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Protocolo

1. Homogeneização e extração de proteínas de tecido do cérebro humano e do rato

  1. Homogeneização do tecido cerebral. Homogeneizar o tecido cerebral de 10% (w / v) em 8 M de ureia, 2 M tioureia e 1% w / v de tampão de SDS (UTS) com um vidro Potter (para amostras humanas) ou Teflon homogeneizador (para as amostras de ratos). Sonicate a 60 Hz 30 pulsos com um gerador de ultra-som de aplicar 0,5 seg para a desintegração do tecido total de 13, 14.
    1. Determinar a concentração de proteína, com ensaio de Bradford, utilizando BSA como padrão. Este tampão de extracção de UTS é totalmente compatível com uma dimensão de SDS-PAGE, enquanto lisados ​​não são sobre-aquecido para evitar a carbamilação 15.
    2. Adicionar 1% (w / v) de Amberlite e incubar com agitação suave durante 10 minutos à temperatura ambiente. A partir de então filtrar para 0,22 filtros de seringa e, finalmente, adicionar a SDS para a solução de uréia / tiouréia. Este passo reduz a quantidade de ácido úrico e ácido isociânico, que estão em equilibrio com uréia em solução e facilitar a sua degradação.
  2. A precipitação da proteína de clorofórmio / metanol. Precipitar entre 100-150 mg de proteína para 11 centímetros Tiras IPG e 1-1,5 mg para 18 centímetros queridos (independentemente da faixa de pH selecionado para realizar o IEF).
    1. Realize todos os passos no gelo ou a 4 ° C. Clorofórmio fresco e metanol a 4 ° C durante 30 min antes de iniciar o procedimento de precipitação.
    2. Adicionar três volumes de metanol e um volume de clorofórmio para um volume de UTS lisado. Agite manualmente a mistura e adicione três volumes de água fria. Vortex durante 1 min e sedimentar as proteínas por centrifugação a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C.
    3. Descartar o sobrenadante utilizando uma pipeta de Pasteur e adicionar três volumes de MeOH frio. Vortex novamente e centrifugar a 12000 xg durante 30 min a 4 ° C. Finalmente descartar o sobrenadante e secar o sedimento sob N 2.
  3. A preparação de proteínas para análise 2D.Ressuspender o sedimento seco ao proteína em 2D-tampão (8 M de ureia, 2 M tioureia, suplementado com 4% de CHAPS). Lava-se a solução com Amberlite tal como indicado acima e tentar manter a proporção de 500 mg de proteína por 200 ul de tampão para o 2D-2D DIGE. Nota: tampão 2D pode ser armazenada a -80 ° C ou mantido a 4 ° C durante uma semana (para evitar a degradação de ureia).
    1. Sonicar e armazenar as amostras à temperatura de -80 ° C até à realização da etapa seguinte. Notável, este protocolo pode ser usado após a solubilização ácido fórmico de proteína agrega 10. Resumidamente, evapora-se o ácido fórmico sob N2 e ressuspender o sedimento como descrito.

2. 2D DIGE

  1. As amostras de teste de qualidade. Amostras de dose novamente usando método de Bradford. Dilui-se 15 ug de proteínas no tampão de amostra LDS, aquece-se a 37 ° C e 15 carregar em 4-12% de gel de poliacrilamida.
  2. Coloração com Coomassie. Mancha de gel de poliacrilamida com 0,1% (w / v) de CoomassieBlue G-250, 50% de EtOH e 10% (v / v) de solução de ácido acético durante pelo menos 1 hr. Vamos fundo Destain durante a noite em 7% de ácido acético e 10% (v / v) da solução de etanol.
  3. Rotulagem pré-eletroforética das amostras. Antes de realizar marcação com corante de cianina, verificar o pH da amostra, o qual deve ser de base ou mesmo neutro uma vez que a substituição de N-hidroxissuccinimida é mais eficiente a pH básico e dado que a duração óptima a pH 8,6.
    1. Rotular minimamente as duas amostras de estudo com corantes Cy3 ou Cy5 fluorescentes, com uma razão de 50 ug protein/400 corante pmol e manter durante 1 hora a 4 ° C na escuridão para facilitar o grupo éster reactivo NHS dos cianinas com a amina não protonada grupos de lisinas.
    2. Reduzir variações de amostra fazendo uma rotulagem cruz com Cy3 e Cy5 corantes, evitando um acoplamento preferencial de uma amostra para uma cyanine particular. Note-se que a marcação mínima cianina-corante pode ser adaptado para a pequena quantidade de proteínas em manter a proporção de 1 ug protein por 8 pmol cyanine-dye. Se assim for, o sistema de mini-2DE pode ser usado em vez de um grande sistema de gel 2D. Isto irá permitir a análise 2D-DIGE por uma pequena quantidade de tecido cerebral.
    3. Rotular um conjunto de ambas as amostras com a mesma quantidade de proteína (50 ug no total) com o corante fluorescente Cy2 e usado como padrão interno. Use as mesmas condições, como indicado anteriormente.
    4. Completar até um volume total de 350 ul com tampão de 2D que contém 1,1% de reagente de Destreak, 1,2% de tampão de IPG e vestígios de Azul de Bromofenol o total de 150 ug de proteínas marcadas (50 ug de Cy2, 50 ug de Cy3 e 50 ug de Cy2). Execute esta etapa em quadruplicado utilizando quatro faixas independentes. Além disso, preparar duas tiras não-rotulados adicionais (um para cada amostra) com 350-450 mg de proteína para os geles de preparação.
    5. Deixe as seis faixas carregadas durante a noite coberto com óleo mineral para reidratação passiva.
  4. Isoelectrofocusing. Realizar o IEF a 206; C. Para um pH de 3 11NL, 18 cm de tira do protocolo é: configuração máxima atual é 50 mA / faixa durante 8 etapas: 1) 150 V etapa por 1 hora, 2) 200 V etapa, durante 5 horas, 3) 500 V gradiente para 2 horas, 4) gradiente 1.000 V para 2 horas, 5) 2.000 V gradiente de 2 horas, 6) 4.000 V gradiente de 2 horas, 7) 8.000 V gradiente de 2 horas e 8) para um total de 24.000 V · passo hr . Depois de IEF, despachar o excesso de óleo mineral utilizando papel de cromatografia e armazenar as tiras a -20 ° C até que a segunda dimensão.
  5. IPG Tiras equilíbrio. Equilibrar as tiras em 6 M de ureia, 2% de SDS, 30% glicerol, 50 mM Tris-HCl pH 8,6, tampão com 1% de DTT, durante 15 min e depois com 4,7% de iodoacetamida no mesmo tampão mas sem DTT.
  6. A segunda dimensão ou eletroforese SDS-PAGE. Adicione os seis géis de 12% SDS-PAGE (1,5 M Tris-HCl pH 8,6, 12% de acrilamida / bis-acrilamida, 0,1% (w / v) de SDS, 0,072% (w / v) de APS e 0,1% (v / v) TEMED ), ao mesmo tempo, utilizando um grande sistema 2D, com quatro placas de vidro de baixa fluorescência para o strips com amostras de fluorescência e outras duas placas de vidro com 1,5 mm de espessura para géis de preparação, a fim de extirpar os spots de proteínas.
    1. Carregar os seis tiras de IPG no topo dos géis e mais camadas com 0,5% (w / v) de agarose. O tampão de corrida é composto de Tris 25 mM, glicina 192 mM e 0,1% (w / v) de SDS. Efectuar a migração de 2,5 W / gel durante a noite com um sistema de refrigeração definida para 4 ° C 16,17.
  7. Aquisição e análise de imagens de fluorescência. Use um scanner Typhoon 9400 para obter as imagens géis de fluorescência (12 imagens para um experimento). Digitalização Cy2, imagens Cy3 e Cy5 para cada gel em 488/520 nm, 532/580 nm e 630/670 nm de excitação / emissão de comprimentos de onda, respectivamente. Use um software de informática para analisar as imagens. Os dados são representativos das alterações do volume de ponto associadas com a distribuição do sinal de entre os quatro géis entre as duas amostras estudadas.
  8. Coloração Coomassie para grandes géis. Corrigir os géis de preparação em 50% (v / v) de EtOH e 3% (v / v) de solução de ácido fosfórico durante pelo menos 24 horas. Em seguida, depois, lavar duas vezes com água ultra-pura, durante 20 min. Realizar coloração em 34% (v / v) de MeOH, 17% (w / v) de sulfato de amónio e 2% de ácido ortofosfórico durante 1 h antes da adição de 0,1% (w / v) de Coomassie Blue G-250. Mantenha os géis na coloração por pelo menos 48 horas e descorados em água ultra-pura.
    1. Spots para a identificação de MS. Uma vez que imagens de fluorescência são analisados, o software fornece uma lista de pontos cuja expressão é estatisticamente diferente. Excisar manualmente essas manchas de geles preparativos. Este procedimento requer a prática e alguns destreza manual, a fim de evitar a contaminação da queratina. Em seguida, as amostras podem ser mantidas em água à temperatura de -20 ° C até que o envio para o MS. Identificação Spot é perfeitamente compatível com a espectrometria de massa em tandem (MS / MS) e da relevância das identidades de proteína é julgado de acordo com a pontuação baseada Mowse calculado com um valor-p de 0,05 (p <0,05) 18 probabilidade.

    3. Qualitativa ensaio Mini-2DE

    1. Ressuspender máximo de 100 ug de proteína em tampão de amostra 2D, até um volume final de 200 ul de uma tira de IPG 11 centímetros. No caso do sistema de sobre-expressão ou a proteína purificada, a quantidade de partida pode ser reduzido para 20 mg.
    2. Adicionar 1,1% (v / v) de reagente Destreak, 0,55% (v / v) de tampão de IPG e vestígios de azul de bromofenol para um volume final de 200 ul. Então, vortex, fazer um giro rápido e carregar em uma tira de IPG para reidratação passiva (para trazer a tira a sua espessura original) durante a noite coberto com óleo mineral. Nota: a proporção de tampão de IPG é a mesma para todos o intervalo de pH desejado (pH 3-11, 4-7, 7-11, etc), mas a sua composição varia em função da gama de pH seleccionada.
    3. Isoelectrofocalisation. Realizar IEF a 20 ° C. A duração do programa depende do intervalo de pH seleccionado. Notável, parâmetros como electroendosmosis pode perturbar o perfil IEF e, nestes casos,optimização em tempo electrofocalisation é necessário 19. Nota: não é necessariamente um IEF já que proporciona melhores resultados, mas a diminuição do tempo de IEF pode também melhorar a resolução. Depois de IEF, as tiras de IPG pode ser armazenada a -20 ° C, durante meses.
    4. IPG tiras equilíbrio. Equilibrar as tiras num tampão contendo 25 mM Tris-HCl pH 6,8, DTT 20 mM, 10% glicerol, 5% de SDS, 0,05% de azul de bromofenol. Adicione três banha equilíbrio durante 15 minutos com a solução tampão de mudança entre cada banho.
    5. SDS-PAGE. A camada de tira de IPG num gel pré-moldado (IPG um poço, 11 centímetros tira de IPG) com uma percentagem de poliacrilamida escolhido dependendo do MW da proteína de interesse. Em seguida, seque o gel para uma membrana de nitrocelulose / PVDF de 100 mV durante 33 min.
    6. Incubar durante a noite com o anticorpo necessário e visualizar pela atividade da peroxidase. Realize os alinhamentos de immunoblots usando polipeptídeos não relacionados revelados pelo anticorpo secundário. Chegar a um semi-quantitative análise por densitometria do volume e intensidade para os vestígios / manchas com software ImageJ.

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Resultados

Proteômica no tecido cerebral continua sendo um desafio uma vez que não existe tampão ideal para recuperar 100% de proteínas, as proteínas do citoesqueleto, especialmente associada membrana ou. O primeiro conjunto de experimentos foram focados na busca de um tampão de lise adequado compatível com as duas abordagens e que permite recuperar um grande painel de proteína. Assim, três tampões de lise foram ensaiadas para determinar o mais adequado. Em primeiro lugar, utilizou-se o tampão de biologia molecular e bioquímica co...

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Discussão

Descobrindo as mudanças de expressão de proteínas patológicas, busca de biomarcadores ea modulação de vias potenciais para alvos farmacológicos estão entre os objectivos dos neuroproteomics aproxima 30. Entre as ferramentas emergentes, o campo 2DE adiciona uma expectativa promissora. No entanto, um consenso deve ser atingido de modo a minimizar a variabilidade e aumentar a reprodutibilidade dos experimentos. Na linha de esta ideia de um protocolo padronizado para realizar 2D-DIGE (Figura 2) e...

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Divulgações

Autores têm nenhum conflito de interesses a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo Inserm, da Universidade de Lille 2, MEDIALZ, Labex (laboratório de excelência, programa investir para o futuro) e DISTALZ (desenvolvimento de estratégias inovadoras para uma abordagem transdisciplinar para a doença de Alzheimer). FJ.FG é atualmente uma bolsa destinatário da ANR (Agência Nacional de Pesquisa Francês / NeuroSplice de Tau Projet ANR-2010-BLAN-1114 01), mas este trabalho foi também com o apoio de uma bolsa da JCCM (Espanha).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 NmoGE Healtcare25-8010-65
Immobiline DryStripGE HealtcareReferência em função do intervalo/tamanho do pH
IPG Buffer, pH X-XGE HealtcareReferência em função do intervalo de pH desejado
AMBERLITE IRN-150L RESINA DE LEITO MISTO 1 GE Healtcare551797N
DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 lKIT CAIXA GE Healtcare17-1335-01
IPG 1 * 1 KITGE Healtcare28-9334-92Caixa de plástico para fazer a reidratação passiva 
Filtro MILLEX GSMilliporeSLGS033SB
Criterion XT Géis Pré-moldados 13.3 x 8.7 cm (L x C)Bio-RadReferência em função do MW para separar
a Unidade de Foco Isoelétrico IPGphor IIIGE Healtcare11-0033-64
Ettan DALTsix Sistema de Eletroforese GrandeGE Healtcare80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm Empresa de GelP2D1.5

Referências

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