Configurando um Microscópio folha de luz simples para Em Toto Imagem de C. elegans Desenvolvimento

Resumo

Este protocolo descreve a configuração de uma folha de microscópio de luz e sua implementação para imagem in vivo de C. elegans embriões.

Resumo

Técnicas rápidas e baixas de imagem phototoxic são pré-requisito para estudar o desenvolvimento de organismos in toto. Microscopia folha de luz com base reduz foto-branqueamento e ação fototóxica em comparação com a microscopia confocal, proporcionando imagens em 3D com resolução subcelular. Aqui apresentamos a configuração de um microscópio folha base de luz, que é composto por um microscópio vertical e um pequeno conjunto de elementos opto-mecânico para a geração da folha de luz. O protocolo descreve como construir, alinhar o microscópio e caracterizar a folha de luz. Além disso, ele detalha como implementar o método no toto imagens de C. elegans embriões utilizando uma câmara de observação simples. O método permite a captura de 3D e duas cores filmes time-lapse mais algumas horas de desenvolvimento. Isso deve facilitar o rastreamento de forma da célula, as divisões celulares e proteínas marcadas por longos períodos de tempo.

Introdução

A formação ea formação de um organismo envolve movimentos celulares, mudanças no formato da célula, divisão celular e diferenciação celular. Compreender a progressão e coordenação destes processos exigem ferramentas de imagem rápidos com capacidade de três dimensões e resolução subcelular. Entre as técnicas com estes em recursos de imagem in vivo, microscopia de iluminação luz folha também chamada microscopia de iluminação avião single / seletiva tem a vantagem única de produzir efeitos de baixa phototoxic e baixa fotodegradação ^1,2.

Em microscopia de iluminação da folha, a amostra é iluminada a partir do lado de uma folha de luz, o qual executa o corte óptico. O caminho de iluminação e o caminho de detecção são perpendiculares uns aos outros e a folha leve está alinhado de forma a coincidir com o objecto plano focal da lente objectiva de detecção. A amostra é colocada na intersecção dos dois caminhos, umnd pode ser movido ao longo do eixo para permitir a detecção de imagem 3D. Apenas o plano de interesse é iluminado e todos os pontos deste plano são detectados ao mesmo tempo. Isto aumenta significativamente a velocidade de aquisição e reduz a fotodegradação, bem como fototoxicidade em comparação com microscopia confocal ^3.

Praticamente, microscopia de iluminação folha é fácil de configurar e align: para dois imagem dimensional, sem varredura é necessário nem para a parte de detecção, nem para a parte de iluminação; como uma técnica de campo largo com capacidade de corte, a imagem tridimensional pode ser obtida através de um único movimento do eixo da fase, com a amostra.

Aqui apresentamos a criação de um microscópio simples folha de luz e sua implementação no toto imagens de C. elegans embriões. C. elegans embriões são bem adaptados para viver in vivo imaging devido a sua transparência, linhagem invariante e estereotipada célula posiciona ^4,5. A configuração da folha de luz desenvolvido baseia-se num microscópio vertical padrão para a detecção. O protocolo apresentado abaixo detalha como construir e alinhar o módulo de excitação / caminho, testar e caracterizar a folha de luz e montar a amostra para geração de imagens 3D. Ele também fornece exemplos de filmes time-lapse adquiridos com a configuração em várias cepas expressando marcadores fluorescentes.

Protocolo

1. Configuração da Folha de Luz eo Caminho de Detecção

A Figura 1 apresenta um esquema geral da configuração óptica.

1. Coloque e fixe o microscópio e os lasers na mesa óptica.
2. Combine lasers 488 nm, 561 nm e 405 nm, com os correspondentes espelhos dicróicas. Após os espelhos dicróicos, os lasers têm de ser precisamente co-alinhadas. Note-se que a escolha dos comprimentos de onda de laser, os espelhos dicróicos, filtros ópticos e é determinada a partir dos espectros de absorção dos marcadores fluorescentes específicos utilizados nas experiências.
3. Coloque o filtro sintonizável acústico-ótico (AOTF). Use a folha de teste fornecido pelo fornecedor para ajustar a frequência ea potência do AOTF. Quando bem alinhada, cerca de 90% da energia do laser é transmitido a um máximo de ajuste tal como medido por um powermeter. Note que alguns lasers pode ser totalmente controlado por software, o que poderia tornar o AOTF desnecessário.
4. Coloque e fixeo telescópio. Note-se que o telescópio é composta por duas lentes que ampliam o feixe com uma largura igual ou maior do que o diâmetro da abertura da parte de trás da lente objectiva iluminação. A lente com distância focal menor deve vir em primeiro lugar.
5. Lugar, alinhar e fixar o periscópio trazendo para cima do percurso óptico mais perto da abertura da parte de trás da lente cilíndrica. Note-se que os dois espelhos do periscópio são montados de uma forma que o seu eixo longo está colocando na inclinação do espelho para refletir o feixe totalmente expandida.
6. Coloque a lente cilíndrica próxima da saída de periscópio. Note-se que a lente cilíndrica focaliza o feixe em um sentido e deixa colimada na outra direção, formando assim uma folha de luz.
7. Recentrar a folha de luz resultante usando a lente objetiva iluminação. Note-se que o ponto focal imagem da objectiva de iluminação deve coincidir com o ponto focal do objecto o objectivo de detecção. Projeto do feixeem uma tela (por exemplo, uma parede) em uma longa distância. Mova o objetivo de iluminação ao longo do eixo do feixe de iluminação para obter na tela contornos nítidos da folha de luz.
8. Coloque a linha quad (405/488/561/638) filtro de emissão no lugar reservado no microscópio (cubo).
9. Coloque a câmara EMCCD na porta de saída do microscópio.
10. Fixar o primeiro estágio de translação manual sobre o palco de microscópio por meio de parafusos em furos na platina do microscópio. Note-se que a borda da plataforma de translação tem de ser posicionado a cerca de 2 cm de distância a partir do centro da platina do microscópio, de modo a que a tina é centrado por baixo da lente objectiva de detecção.
11. Fixar o segundo estágio de translação manual sobre o primeiro. As direções das duas etapas tem que ser perpendicular (X e Y traduções).
12. Fixar a fase Z piezoeléctrico no topo das duas fases anteriores. Note-se que uma plataforma motorizada pode ser utilizado em vez do estágio piezeléctrico.
13. Fixe o holde tinar (ver Figura 2), na parte superior das fases. A cuvete irá, assim, ser colocado na intersecção do caminho de iluminação e o caminho de detecção, que são perpendiculares um ao outro.

2. Verificar a folha de luz

1. Encha uma tina de vidro com solução fluorescente, e colocá-lo no porta-amostras no cruzamento dos dois caminhos ópticos. A folha de luz é assim visível. Tem de ser horizontal, e simétrico / centrada em relação à lente objectiva de detecção.
2. Retirar a lente cilíndrica e adquirir uma imagem para medir a espessura da folha de luz. Note-se que a espessura da folha de luz depende da abertura numérica (AN) da iluminação da lente objectiva (cerca de 3-4 mm para NA = 0,3). Note-se que para uma dada lente, a espessura da folha, a luz pode ser aumentada reduzindo o tamanho do feixe de entrar na abertura traseira, com uma fenda. Note-se que as microesferas fluorescentes pode ser utilizado para medir o machadoial e resolução lateral do microscópio.
3. Volte a colocar a lente cilíndrica antes de iniciar o experimento.

3. A montagem de C. elegans Embriões

Os passos seguintes são apresentados na Figura 3.

1. Use uma caneta de marcação de diamante para cortar um pedaço de uma lâmina de vidro de 10 x 20 x 1 mm.
2. Prepare 5% bacto-agar na água, fervê-lo e mantê-lo em um bloco de aquecimento a 60 ° C.
3. Adicionar 50 ul de poli-L-lisina sobre um lado da peça de corte da lâmina, deixá-lo secar.
4. Coloque uma lâmina de microscópio no banco e corrigi-lo.
5. Justapor a peça de corte de lâmina com a lâmina fixa e adicionar uma gota de agar derretido no topo. Esprema o agar usando outra lâmina de microscópio limpa para obter um bloco de ágar fina.
6. Permitir que o bloco de ágar para secar antes de retirar o top slide.
7. Cortar a almofada de ágar sobre o lado da lâmina fixa, de modo a deixar um excesso de cerca de 3 mm of agar e remova cuidadosamente a lâmina fixa.
8. Adicionar 50 mL de poli-L-lisina sobre o agar e deixe secar completamente.
9. Coloque vermes grávidas em meio M9 em um vidro de relógio.
10. Cortar os vermes ao nível da vulva com um bisturi para libertar os embriões.
11. Sob um binóculo identificar os embriões na fase de interesse e recolhê-las usando uma pipeta microcapilar.
12. Colocar os embriões na parte do agar revestidos com poli-L-lisina, que se projecta a partir da peça de corte da lâmina. Coloque os embriões apenas junto à fronteira do slide. Não posicione os embriões na fronteira do agar, porque não vai ser estável o suficiente. Remover cuidadosamente o líquido, de modo que os embriões vai ficar sobre a camada de poli-L-lisina.
13. Alinhar rapidamente os embriões para evitar a dessecação.
14. Colocar a lâmina de corte em um prato de plástico Petri e adicione delicadamente meio M9 para cobrir o slide.
15. Verifique sob um binóculo que os ovos ainda estão presos no ágar.

4. Gravação de C. Desenvolvimento elegans

1. Fixar a preparação anterior (corte deslizante, além de embriões de agar) no suporte de amostra e coloca-se numa cuvete. Figura 4 descreve o titular caseiro e A Figura 5 mostra uma vista da tina em contexto de observação.
2. Fixar a cuvete na fase piezoeléctrico.
3. Identificar a posição dos embriões com iluminação de campo brilhante.
4. Inicie o software feito em casa controlando a AOTF, a câmera eo estágio piezoelétrico. Note-se que um software livre, tal como micromanager, também pode ser utilizado.
5. Selecione a linha de laser e de energia (AOTF).
6. Ajustar a posição da folha de luz utilizando a fase três instruções de suporte da lente cilíndrica e a lente de iluminação. Mover o palco ao longo da direcção lateral (X) para obter o sinal mais brilhante. Ajustar então a posição Z da folha de luz, e a posição longitudinal (Y) para obter the melhor relação sinal-ruído. Note-se que a posição do foco folha de luz pode ter de ser ajustada a partir de um embrião de um outro para corrigir as diferenças de comprimento de caminho de luz.
7. Para adquirir imagens de lapso de tempo, selecione o tempo de exposição, o ganho, o tempo entre duas imagens, bem como o número de imagens a serem adquiridas, eo poder do laser. Para 2 aquisição de cores, selecione uma segunda linha de laser. Duas imagens coloridas são adquiridos de forma consecutiva.
8. Para adquirir pilha az, selecione também a distância entre as duas fatias, eo início e fim posições do piezoelétrico.

Resultados

Três experimentos de gravação de lapso de tempo 3D a partir de três diferentes C. elegans estirpes ilustrar o tipo de dados que podem ser obtidos usando a configuração do microscópio folha de luz descrita acima. Nós verificamos que, nestas condições, os embriões se desenvolvem em velocidade normal e sobreviver a imagem, de acordo com relatórios anteriores, indicando que a imagem SPIM provoca apenas baixos níveis de fototoxicidade em C. elegans embriões ^6,7.

A primeira linhagem expressa uma histona fundida a GFP (zuIs178; stIs10024). A gravação foi realizada durante 2 horas, com uma pilha de fatias 20 (distância entre fatias de 1 um) feita a cada 37 seg. Figura 6 ilustra um plano da pilha em diferentes pontos de tempo. Ambos os núcleos interphasic (seta) e cromatina condensada mitótico (cabeça de seta) são claramente visíveis.

A segunda estirpe expressa um tubulina fundido a GFP (ruIs57) e uma histonafundido com mCherry (itIs37; stIs10226). A gravação foi realizada durante 16 min, com uma pilha de fatias 20 (distância entre fatias de 1 um) feita a cada 105 s. Figura 7 ilustra diferentes planos da pilha e diferentes pontos de tempo. O filme associado 1 apresenta reconstruções 3D em três momentos sucessivos. Durante a divisão, o fuso mitótico (verde) e cromossomos condensados ​​(vermelho) são claramente visíveis, permitindo o acompanhamento das orientações de divisão celular durante o desenvolvimento.

A terceira estirpe expressa a apolipoproteína VIT-2 fundido a GFP (pwIs23) e uma membrana ligada mCherry (ltIs44). O registo foi feito durante 25 minutos, com uma pilha de fatias 10 (distância entre fatias de 1 um) feita a cada 30 seg. Figura 8 ilustra diferentes planos da pilha e diferentes pontos de tempo. Os movimentos rápidos das partículas de gema de lipoproteínas (verde) no interior das células podem ser facilmenteseguido.

Figura 1: configuração óptica SPIM composto da iluminação e detecção de unidades, frente e vista para o fundo. Na unidade de iluminação, os lasers combinados pelos espelhos dicróicos entrar AOTF, o qual controla a potência de cada laser independentemente. Em seguida, o telescópio aumenta o tamanho do feixe por 4 vezes e a periscópio traz para a altura do microscópio. A lente cilíndrica forma a folha de luz, que é reorientada pelo objectivo iluminação. A unidade de detecção é integrado no microscópio vertical e é composta principalmente por a lente de detecção, o filtro, o tubo de lente e o EMCCD. A amostra é colocada na intersecção entre os caminhos de iluminação e detecção. A fase piezoeléctrico permite vertical (Z) deslocamentos de amostrapara a aquisição 3D.

Figura 2:. Titular Cuvette O portador consiste em três placas de alumínio e é enroscado sobre a fase piezoeléctrico. A cuba de vidro é realizado por uma mola (em vermelho).

Figura 3: Montagem protocolo de C. elegans embriões para experiências SPIM. A peça cortada de vidro é revestido com poli-L-lisina. Uma almofada de ágar é posicionada sobre a superfície revestida. Poli-L-lisina Adiciona-se então para a almofada de ágar. Finalmente, C. elegans embriões são alinhados na almofada de ágar revestidos com poli-L-lisina.

Figura 4: Exemplo de titular. O detentor encaixa às dimensões interiores da tina de vidro. Duas molas (em vermelho) manter a lâmina de vidro (descrito na Figura 3). Este suporte é então colocado dentro da tina de vidro.

Figura 5:... Suporte da amostra no contexto observação embriões são imobilizadas sobre a lâmina de vidro de acordo com o protocolo resumido na Figura 3 A corrediça é mantida pelo suporte de amostras descrito na Figura 4 O suporte de amostra é inserida na cuvete de vidro, detida pelo titular descrito na Figura 2. A folha de luz é horizontal e illuminates os embriões a partir do lado. A lente da objectiva de detecção esteja na vertical, por cima da amostra.

Figura 6: a gravação de um C. elegans embrião expressar uma fusão histona :: GFP imagens individuais de um embrião transgênico avião expressar uma histona :: fusão GFP (zuIs178; stIs10024) em momentos diferentes imagens extraídas de uma gravação de lapso de tempo 3D:.. pilhas feitas de 20 fatias ( distância entre fatias de 1 mm); tempo de exposição por fatia: 30 ms; intervalo de tempo entre as pilhas: 37 seg; tempo de aquisição total: 2 horas. Arrow: núcleo interphasic, cabeça da seta: cromatina condensada mitótico. No instante t = 0 min, o embrião está na fase de 2 células-e a t = 120 min, o embrião contém cerca de 70 células como esperado sob s normais de desenvolvimentoxixi (notar que apenas as células contidas num mesmo plano são visíveis nas imagens e não todas as células do embrião). O poder de iluminação foi de 30 μW a 488 nm (medido na saída do objectivo de iluminação). Clique aqui para ver este vídeo.

Figura 7: A gravação de um C. elegans embrião expressando um Tubulin :: fusão GFP e uma histona :: fusão mCherry. Imagens extraídas de uma gravação de lapso de tempo 3D de um C. elegans embrião expressando um Tubulin :: fusão GFP (ruIs57) e um Histone :: fusão mCherry (itIs37; stIs10226). Condições de gravação: a aquisição de uma pilha de 20 fatias (distância entre fatias 1mm) a cada 105 seg; tempo de aquisição total: 16 min; tempo de exposição: 200 ms para cada canal. O painel A mostra 10 fatias da mesma pilha. O painel B mostra a mesma fatia cada 210 seg. O poder de iluminação foi de 30 μW e 300 μW, para 488 e 561 nm, respectivamente lasers (medido na saída do objectivo de iluminação). Clique aqui para ver este vídeo.

Figura 8: a gravação de um C. elegans embrião expressando uma VIT-2 :: GFP Fusion e um alvo a membrana mCherry. Imagens extraídas de uma gravação de lapso de tempo 3D de um C. elegans embrião expressando uma fusão VIT-2 :: GFP (PWIs23) e um mCherry direcionados à membrana (ltIs44). Condições de gravação: aquisição de uma pilha de 10 fatias (distância entre fatias 1 mícron) a cada 30 seg; tempo de aquisição total: 25 min; tempo de exposição por canal: 200 ms. O painel A mostra as 5 primeiras fatias da mesma pilha. O painel B mostra a mesma fatia cada 30seg. Clique aqui para ver este vídeo.

Discussão

Este protocolo descreve uma configuração fácil de microscopia folha de luz para imagem in vivo de C. elegans embriões. Os elementos ópticos necessários para criar e alinhar a folha de luz, incluindo lasers, expansor de feixe, colimação e lentes de foco, pode ser facilmente montado em um banco óptico. Em combinação com um microscópio vertical para o caminho detecção ea câmera, este fornece uma solução simples de configurar uma folha de microscópio de luz.

Essa geometria faz com que o ambiente de exemplo simples. O espécime vivo é colocado em uma cuba de vidro, que é realizada, posicionado e movido por um pequeno conjunto de peças mecânicas. Como microscopia iluminação folha é uma técnica de campo grande com capacidade de corte, apenas um único eixo motorizado movimento é necessário para imagens 3D. Isto limita o requisito de sincronização para um único elemento de varrimento e facilita o desenvolvimento do software. Comparado com ISPIM ⁶ nossa geomet verticalry permite o uso de elevados lente objectiva NA para detecção. Comparada com as configurações SPIM com lentes objectivas em relação ao plano horizontal da montagem da amostra e a imagem de uma série de embriões são mais fáceis. Ao todo, a implementação desta técnica é simples e pode ser alcançado com pouca experiência em ótica. Isto é uma alternativa mais barata a microscopia confocal, com as vantagens de uma maior velocidade e fototoxicidade reduzida, mas inconveniente de uma resolução axial inferior.

Também desenvolvemos uma maneira fácil e reprodutível para montar C. embriões elegans para imagem in vivo utilizando este sistema. O procedimento de montagem é rápida (15 minutos) e é adequado para experiências diárias. Para C. elegans imagem, as vantagens desta configuração simples são pelo menos duas dobras: (i) em imagem toto é possível sem rotação e, portanto, a reconstrução 3D é simples; (Ii) a montagem da amostra é fácil e vários embriões podem ser visualizados sequencialmenteno mesmo slide. Nós mostramos exemplos de filmes de lapso de tempo com resolução temporal suficiente para observar as divisões celulares e alterações na forma celular. O poder de microscopia folha de luz para estudar C. desenvolvimento elegans também foi ilustrado recentemente por outros ^{6, 7, 8.} Portanto, esta técnica vai ser muito útil para estudar a morfogénese e padronização da C. elegans embrião.

Este sistema pode também ser utilizado para analisar o desenvolvimento de outros organismos modelo? É importante reconhecer que a implementação de microscopia de iluminação folha para pequenas e transparente organismo, como C. elegans é menos rigorosa do que para organismos maiores, como embriões de Drosophila. In toto imagens de Drosophila normalmente requer rotação e multi-view reconstruções ^{9, 10.} Excitação de dois lados com lentes objetivas de excitação colineares também pode reduzir os efeitos de sombra causados ​​pela attenuatíon da luz ^11. No entanto, a configuração aqui apresentada é ainda adaptado para a imagem de um lado dos embriões de Drosophila, com baixo branqueamento e baixo photoxicity. Esta configuração também pode ser útil para imagem pequenas e transparentes embriões como ascídias ou peixe-zebra.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
SPIM
Microscópio vertical de detecção
	ZEISS	Axiophot 1
100x W objetiva (NA 1.1, W.D. 2.5mm)	NIKON
EMCCD retroiluminado	ANDOR	DU-885K-CS0-#VP
Iluminação
LASER 488 nm / 60 mW	TOPTICA	iBeam smart
LASER 405 nm / 120 mW	TOPTICA	iBeam smart
LASER 561 nm / 500 mW	COBOLT	JIVE 500	para imagens de lapso de tempo, 50 ou 100mW é suficiente
filtro Banda de rejeição de laser de linha quádrupla ZET 405/488/561/638	AHF	F57-405
Dicróico 405	AHF	F38-405
Dicróico 488	SEMROCK	Di01-R488
AOTF	AA	AOTFnC-400.650-TN
espelhada
50 mm	THORLABS		telescópio lente 5X
200 mm	THORLABS		telescópio 5X
periscópio	THORLABS	RS99/M
lente cilíndrica f=100mm	THORLABS	ACY254-100-A
10X NA 0,3	NIKON
xyz stage	NEWPORT
Amostra
Bacto Agar	Bectkton Dickinson	214010	5% em solução de
Poli-L-Lisina em água	Sigma	P8920
Capilares GC100F-10, 1,0 mm oD, 0,58 mm ID, 100 mm L	Havard Appartus	30-0019
Tubo de aspiração (pipeta de boca)	Dutsher	55005
M9 médio:
KH2PO4 (3g/L)	Qualquer fornecedor
Na2HPO4 (6g/L)	Qualquer fornecedor
NaCL (5g/L)	Qualquer fornecedor
MgSO4 (1 mM final)	Qualquer fornecedor
de suporte de cubeta	FEITO EM CASA feito		por Brice Detailleur
porta-amostras	HOME MADE		feito por Claude Moretti
x estágio	NEWPORT
lamínula 50x20x1 mm	MARIENFELD		cortado em seguida em 10x20x1mm
piezo palco elétrico com amplificador/controlador	PI	P-622. Cubeta ZCD / E-625.CR
40mmx40mmx10mm	HELLMA	704.002-OG.40 mm- 10mm de altura
Lápis de marcação de vidro com ponta de diamante	VWR
Software
C++ (Qt) software			desenvolvido por Olivier Blanc e Claire Chardè s, disponível mediante solicitação. Soluções alternativas: micromanager ou labview