Aqui nós descrevemos um protocolo com o marinheiro mutagênese mini-himar1 mediada por transposon para gerar uma biblioteca de mutantes de inserção de alta densidade para a tela, isolar e identificar novos reguladores de alginato no protótipo PAO1 cepa Pseudomonas aeruginosa.
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Artigo de método
Identificação de novos genes associados com alginato de Produção em
Neste artigo
Resumo
Resumo
Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa, do meio ambiente com as capacidades metabólicas versáteis. P aeruginosa é uma bactéria patogênica oportunista que estabelece infecções pulmonares crônicas em pacientes com fibrose cística (FC). O excesso de produção de um polissacarídeo capsular chamado alginato, também conhecido como mucoidy, promove a formação de biofilmes mucóides que são mais resistentes que as células planctônicas a quimioterapia antibiótico e as defesas do hospedeiro. Além disso, a conversão do nonmucoid para fenótipo mucóide é um marcador clínico para o início da infecção crónica em CF. Superprodução alginato por P. aeruginosa é um processo endergonic que tributa pesadamente energia celular. Portanto, a produção de alginato é altamente regulado em P. aeruginosa. Para compreender melhor regulação alginato, nós descrevemos um protocolo utilizando a mutagénese de transposões mini-himar1 para a identificação de novos regulador alginatos em um PAO1 cepa protótipo. O processo consiste em duas etapas principais. Em primeiro lugar, nós transferimos o transposon mini-himar1 (PFAC) do host E. coli SM10/λpir em destinatário P. aeruginosa PAO1 por conjugação entre parentes para criar uma biblioteca de mutantes de inserção de alta densidade, que foram seleccionados em placas de agar de isolamento Pseudomonas suplementado com gentamicina. Em segundo lugar, nós analisamos e isoladas as colónias mucóides para mapear o local de inserção por meio de PCR inversa utilizando iniciadores de ADN que apontam para fora a partir da cassete de gentamicina e sequenciação de ADN. Usando este protocolo, foram identificados dois reguladores novas alginato, Muce (PA4033) e kinB (PA5484), em PAO1 tensão com um tipo selvagem Muca que codifica o fator anti-sigma MUCA para o alginato regulador mestre Algu (ALGT, σ 22) . Este protocolo de mutagénese de alto rendimento podem ser modificados para a identificação de outros genes de virulência causando alterações no colomorfologia ny.
Introdução
A capacidade do oportunista, patógeno Gram-negativa Pseudomonas aeruginosa a produzir alginato é um fator importante na sua capacidade de estabelecer um biofilme. A superprodução de alginato é um fenótipo muitas vezes referida como mucoidy. O isolamento das colônias mucóides de amostras de escarro de indivíduos que sofrem de fibrose cística (FC) é indicativo de uma infecção crônica, e está diretamente associado a um declínio geral na saúde do paciente 1. Atualmente, entende-se que a regulamentação e produção de alginato em P. aeruginosa ocorre principalmente em dois operões. O primeiro é o operon biossintética alginato, que contém 12 gene....
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Protocolo
1. Preparação de Estirpes Bacterianas e biparentais Conjugação
- Inocular E. coli SM10/λpir/pFAC em 5 ml de caldo de Luria (LB) suplementado com 15 ug / ml de gentamicina e colocar num incubador com agitação durante a noite a 37 ° C.
- Inocular P. aeruginosa PAO1 tensão em 5 ml de LB, e coloque em uma incubadora de agitação durante a noite a 42 ° C.
- Meça OD 600 de culturas durante a noite e misture quantidades iguais de PAO1 e E. coli PFAC de tal modo que o volume final é entre 1-1,4 ml.
- Centrifuga-se a mistura de 6000 g durante 5 min.
- Por outro lado, secar as placas de LB para conju....
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Resultados
Tal como ilustrado na Figura 1, o vector de mariner transposão mini-himar1, PFAC, contém duas repetições invertidas com 27 pb que flanqueia os locais de inserção de TA a cassete de resistência à gentamicina aacC1, com o seu promotor σ 70-dependente, e um local de clonagem múltipla (MCS). Além disso, o vector contém os genes que codificam PFAC transposase altamente activa himar1, β-lactamase (bla), e o operão transferência tra. Os locais de inserção.......
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Discussão
É importante notar que este método pode ser utilizado em outras espécies de Pseudomonas com essas alterações: incubar P. e P. fluorescens putida a 30 ° C, e P. stutzeri a 42 ° C; p stuzeri devem ser cultivadas em placas de LB suplementadas com 150 ug / ml de gentamicina; no passo 1.11, P. células stutzeri deve ser transferido para 500 mL de LB em vez de 1 ml. Para além disso, existem dois passos críticos para este protocolo. Em primeiro lugar, a estirpe reci.......
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Divulgações
O autor Hongwei D. Yu é a Ciência Officer e co-fundador da progênese Technologies, LLC Chefe.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Aeronautics and Space Administration West Virginia Space Grant Consortium Nacional (NASA WVSGC), Cystic Fibrosis Foundation (CFF-YU11G0) e NIH P20RR016477 e P20GM103434 à Rede IDeA West Virginia for Biomedical Research Excellence. Agradecemos Vonya M. Eisinger para a assistência técnica com este trabalho.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Caldo Luria | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas ágar isolamento | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pratos Pequenos (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Pratos Grandes (150 O.D. x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Glicerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Incubadora de agitação de bancada | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | agitar a 200 rpm |
| Incubadora de armário | VWR | 1540 | |
| Microcentrífuga de bancada | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Espectrofotômetro | Bio-Rad | 170-2525 | ou método/fornecedor preferido |
| Loops de inoculação diposable | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Frascos criogênicos de 2,0 ml | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| Tubos de 15 ml | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Leite desnatado | Difco DF0032-17-3 | via Fisher Scientific | |
| DNeasy Sangue e Tecido (250) | Qiagen | 69506 | ou método/fornecedor preferido |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | ou método/fornecedor preferido |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | ou método preferido/fornecedor |
| Kit de ligação de DNA FastLink II | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Sal1, endonuclease de restrição | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher Scientific |
| Taq DNA Polimerase | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, Termociclador | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| Frascos criogênicos de 2,0 ml | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
Referências
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).
- Chitnis, C. E., Ohman, D. E. ....
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Reimpressões e permissões
