É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Preparação de Primário Miogênica de Células Precursoras / Culturas de mioblastos de Vertebrados basais Linhagens

20.2K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/51354

⸱

30 de abril de 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Alabama at Birmingham, 2Nutrition Métabolisme Aquaculture, INRA UR1067, 3Laboratoire de Physiologie et Genomique des Poissons, INRA UR1037

Neste artigo

Resumo

A cultura in vitro sistemas provaram indispensável para a nossa compreensão de myogenesis vertebrados. No entanto, ainda há muito a ser aprendido sobre o desenvolvimento do músculo esquelético não Mamífero e crescimento, particularmente na taxa basal. De uma forma eficiente e robusta para isolar as células estaminais de adultos deste tecido, as células precursoras miogénicos (PPM), e manter a sua auto-renovação, a proliferação e diferenciação de uma configuração de cultura primária permite a identificação de mecanismos reguladores conservadas e divergentes ao longo as linhagens de vertebrados.

Resumo

Devido à dificuldade e tempo inerente envolvido com o estudo do programa miogênica in vivo, sistemas de cultura primários derivados das células-tronco adultas residentes do músculo esquelético, as células precursoras miogênicas (PPM), têm se mostrado indispensável para a nossa compreensão do desenvolvimento do músculo esquelético de mamíferos e crescimento. Particularmente entre a taxa basal de vertebrados, no entanto, os dados são limitados descrevendo os mecanismos moleculares que controlam a auto-renovação, a proliferação e diferenciação de PPM. De particular interesse são potenciais mecanismos que estão na base da capacidade de vertebrados basais a sofrer considerável postlarval esquelético myofiber hiperplasia (ou seja, peixes teleósteos) e regeneração completa após perda apêndice (ou seja Urodelos anfíbios). Além disso, o uso de mioblastos em cultura pode ajudar na compreensão da regeneração e da recapitulação do programa miogénica e as diferenças entre eles. Paraeste fim, que descrevem em pormenor um protocolo robusto e eficiente (e variações neles) para isolar e manter PPM e sua descendência, mioblastos e de miotubos imaturas, em cultura celular, como uma plataforma para a compreensão da evolução do programa miogénica, começando com o mais vertebrados basais. Capitalizando sobre o status organismo modelo do peixe-zebra (Danio rerio), relatamos a aplicação deste protocolo a pequenos peixes do clado ciprinídeo Danioninae. Em paralelo, este protocolo pode ser utilizado para realizar uma abordagem comparativa mais ampla, isolando PPM do axolotl mexicano (Ambystomamexicanum) e até mesmo roedores de laboratório. Este protocolo é agora amplamente utilizados no estudo myogenesis em várias espécies de peixes, incluindo a truta arco-íris, salmão e besugo 1-4.

Introdução

Compreensão considerável de myogenesis mamíferos foi obtida através da recapitulação do processo em ambos os rato primária (Mus musculus) culturas de mioblastos ea linha celular derivada de rato bem descrita, C2C12 5. Começando nos anos 1950, 6, estas culturas conduziram a muito avanço na compreensão do programa murinemyogenic e, por extensão, miogenese em outros vertebrados. Além disso, uma única célula técnicas myofiber explantes têm aumentado a compreensão das interações entre células satélites e fibras musculares em torno 7-9. Culturas celulares são particularmente atraentes para as investigações de miogênese, devido ao curto espaço de tempo a partir de precursor de célula diferenciada 10, relativa facilidade de transfecção de RNAi 11-14, transgênico 15,16 e superexpressão estudos 14,17,18, a expansão in vitro seguida de transplante in vivo 18-20, e até mesmo uma miniaturaarison de células precursoras miogênicas e seus agentes reguladores em todo taxa 21,22. Embora as diferenças devidas ao meio artificial do sistema de cultura têm sido descritos 5,23, estes sistemas in vitro têm provado ser indispensável para a dissecção do programa que regula a formação de complexo de multinucleadas, myofibersfrom terminalmente diferenciada mononucleated células progenitoras proliferativas conhecidos como myosatellite células (MSCs) entre os mamíferos.

Fora da classe Mammalia, no entanto, a conservação e / ou divergência de mecanismos que controlam myogenesis são mal compreendidos, em grande parte devido à dificuldade em cultura de células precursoras miogênicas (PPM) e mioblastos de vários táxons. De facto, as culturas de mioblastos primários apenas tenham sido descritas em três aves 24-26, um réptil 27, algumas anfíbios 28-30, e alguns peixes 1,3,4,31-33. Linhagens de células miogênicas contínuos de vediferentes roedores 34-36 rtebrates são ainda mais raros, com a única linha de não-mamíferos miogênica célula sendo derivado de codornas japonesas (Cortunix japonica), QM7 37. Apesar de muitas tentativas de imortalização, uma linha celular miogênica teleósteos permanece indefinida e um protocolo para a transfecção eficiente dessas células só foi publicado este ano 15. Assim, os protocolos claros e bem otimizadas para cultivar PPM primárias e mioblastos de uma variedade de vertebrados são muito necessárias, não só para expandir ainda mais o nosso conhecimento sobre a evolução do programa miogênica, mas para empregar o poder da fisiologia comparativa para fazer descobertas em o tratamento de doenças do músculo esquelético e distúrbios humanos.

Enquanto a literatura contém muitos relatos de isolamento MPC / mioblastos 38-49, é comum que os autores descrevem os protocolos para esses isolamentos em breve, muitas vezes incompletos, formatos. Além disso, os protocolos mais instrutivas reported foram desenvolvidos para ratos 50-53, e algumas delas contam com seleção anticorpo 54,55 ou transgenes fluorescência 56,57, tornando estes protocolos inutilizável ou íntimos espécie não roedora impraticáveis ​​utilizadas por biólogos musculares. Com pouco sabe sobre piscine, anfíbio, réptil e miogênese, um protocolo detalhado e completo, descrito com orientação audiovisual e com eficiência demonstrada em espécies distantemente relacionadas, seria mais útil para o campo.

Descrita pela primeira vez por Powell e seus colegas em 1989 58, o seguinte protocolo foi inicialmente desenvolvido para isolar PPM e mioblastos de peixes salmonídeos (ou seja, a truta arco-íris, Oncorhynchus mykiss, e salmão do Atlântico, Salmo salar) e alguns ciprinídeos maiores (ou seja, peixinho, Carassiusauratusauratus) . Em 2000, Fauconneau e Paboeuf otimizado uma cultura de mioblastos primário para truta arco-íris 59, e minoroptimizations made que o protocolo utilizável em vários peixinhos menores do clade Danioninae (peixe-zebra, Danio rerio, e Danio gigante, Devario aequipinnatus) 32, devido às muitas ferramentas genéticas disponíveis para o trabalho do peixe-zebra e, portanto, seus parentes próximos. Peixes teleósteos são organismos atrativos para estudo devido à sua estratégia de crescimento divergentes (pelo menos na maioria das espécies). Grandes salmonídeos, como a maioria dos peixes, crescer indeterminadamente, com potencial de crescimento desenfreado por uma assíntota na maturidade, mesmo em idade avançada 60-62. Ao contrário de peixe-zebra, grandes danionins como o Danio gigante 63 e potenciais de crescimento exibição Danio moustached típicos de peixes teleósteos, tornando a sua justaposição direta uma plataforma ideal para a compreensão se escolha o destino da célula MPC desempenha um papel na hiperplasia do músculo esquelético contra hipertrofia.

Da mesma forma, temos demonstrado que este protocolo pode ser utilizado com ratos e axolotls, com rendimento relativamente alto celular e VIABíndices ILIDADE. Salamandras Urodelos, como a axolotl mexicano (Ambystomamexicanum), possuem a notável capacidade de regenerar tecidos, incluindo membros e caudas 64-66 inteiras. Esta característica faz com que esses anfíbios modelos interessantes de perda de massa muscular esquelética e envelhecimento. Usando o protocolo descrito abaixo, uma abordagem similar pode ser efectuada, como foi feito em muitas espécies de peixes, fornecendo um contexto comparativo ainda maior de tais estudos. Como muitos biólogos verdadeiramente apreciam comparativos, os avanços mais significativos em biologia básica e translacional biomedicina pode ser feita quando os dados são analisados ​​dentro do mais amplo espectro (aqui, toda a linhagem dos vertebrados).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Declaração de Ética: Todos experimentação envolvendo animais vertebrados descritos aqui foi previamente aprovado pelo Comitê da Universidade de Alabama em Birmingham Institutional Animal Care e Use e é consistente com as diretrizes estabelecidas pela Secretaria de Laboratório Animal Welfare, National Institutes of Health de os EUA Departamento de Saúde e Serviços Humanos.

1. Preparação para a Cultura

  1. Preparar o meio de base da seguinte forma: 9 mM de NaHCO3 (1,51 g por 2 L), HEPES 20 mM (9,53 g por 2 L), em DMEM (13,48 g / L; 26,96 g por 2 L).
    1. Determinar o pH e ajustar a 7,40 com HCl ou NaOH.
    2. Determinar e ajustar a osmolalidade ~ 300 mOsm com NaCl (se necessário).
    3. Filtro esterilizar utilizando (2) sistemas de esterilização de 1 L de vácuo e armazenar a 4 ° C protegidos da luz durante até 2-3 meses.
      NOTA: Ver Tabelas 1 e 2 para o reagente completo, ferramentas, consumveis, e informações sobre o equipamento.
  2. Prepara-L-lisina-tratados poli placas por dissolução de 5 mg de irradiadas-γ poli-L-lisina (> 300.000 mw) em 50 ml de água ultrapura esterilizada. Misturar suavemente por inversão durante 10 minutos à temperatura ambiente, assegurar a dissolução completa dos polímeros de lisina.
  3. Pipetar a quantidade necessária de poli-L-lisina solução em cada poço, de acordo com o tipo de placa (Tabela 3). Permitir que as placas de suporte em fluxo laminar capuz durante 5 minutos.
  4. Em seguida, remova-poli-L-lisina solução e lavar duas vezes com água estéril. Permitir placas para o ar seco em fluxo laminar capô por 20 minutos.
  5. Obter 1 mg de laminina (origem Engelbreth-Holm-Swarm) e dissolver em 50 ml de meio de base para uma concentração final de 20 ug / ml. Aplicar a solução de laminina para placas de cultura celular de poli-L-lisina-tratados em 2 mg / cm 2. (Ver Tabela 3 para diferentes tamanhos de placas)
  6. Agite suavemente a solução para garantir full bem cobertura. Selar as placas com fita laboratório e colocar em incubadora por 24 horas. A incubadora deve ser definido como a temperatura apropriada para a espécie a ser utilizadas (ver Tabela 7), e sem gases adicionais necessitam de ser adicionados à incubadora.
    NOTA: A laminina devem ser autorizados a aderir às placas por 24 horas antes de semear células. Não fazer isso irá resultar em pobre para não adesão celular.
  7. Prepare mídia, como descrito na Tabela 4. Mídia completa é melhor preparada no dia de uso.
  8. Em preparação para o isolamento de tecido, montar os seguintes itens e autoclave: 300-500 ml copo (s); pratos de vidro de Petri; bisturi alças; fórceps (fina e grossa); tesoura de dissecção; e várias folhas de papel autoclave repelente de água.
    NOTA: Para cada pessoa ajudar com o processo de dissecação, (2) alças de bisturi, (1) pinças (tipo dependendo da preferência pessoal), (1) tesoura de dissecção, e (5-10) folhas de papel autoclave repelente de água sãosuficiente.
  9. Além dos artigos acima autoclavados, montar etanol a 70%, um equilíbrio do peso, 50 ml de tubos cónicos estéreis (número depende do tamanho da cultura), e gelo.

2. Dissecção de tecido

  1. Antes de começar, certifique-se de que um estoque suficiente de peixes.
    NOTA: A idade do peixe a ser utilizado é de importância crítica. Enquanto os peixes de duas espécies diferentes podem ser de pesos semelhantes, um peixe mais jovem de uma espécie irá possuir mais do que um peixe PPM mais velho de outra espécie. Como regra geral, os peixes mais novos, especialmente quando se trabalha com salmonídeos, são as melhores. Para danionins, peixe tão antiga como um ano pode ser utilizada de forma otimizada, enquanto salmonídeos de idade 4-6 meses ou mais jovens (até 15 g) são ideais.
  2. Para cada 5 g de tecido a ser dissecado, alíquota de 25 ml do meio de isolamento para um estéril tubo de 50 ml.
  3. Pesar, massa registro e número do tubo (s). Colocar os tubos em gelo.
  4. Eutanásia 2-3 peixede cada vez, por imersão em> 300 mg / L de sódio tamponada com bicarbonato de tricaina metanossulfonato. Permitir o movimento do opérculo cessar durante> 5 minutos e, em seguida, mergulhe peixe em etanol a 70% (contida nos copos estéreis) durante 30 segundos.
  5. Retire o peixe a partir de etanol 70% e colocar em autoclave papel repelente de água. Diretamente atrás do opérculo, usar um bisturi para fazer uma incisão superficial, superficial. Remover as escamas da pele e agarrando a pele através da incisão acima mencionado e puxar para cauda de peixe.
  6. Após a remoção da pele, extirpar o epaxial, fast-glicolítico muscular 'branco' do peixe de ambos os lados (evitando o músculo 'vermelho' slow-oxidativo localizado perto da linha lateral) e coloque no meio de isolamento. Descartar o restante dos peixes tal como exigido pela instituição.
    Células Embora seja perfeitamente possível PPM cultura provenientes de músculo vermelho, quase todas as publicações usando teleósteos PPM tem utilizado isolados do epaxial m: NOTAyotome.
  7. Repita os passos 2,4-2,6 até uma quantidade suficiente de músculo é obtido. Durante a dissecção, garantir que o tecido do músculo permanece reunido em gelo para manter a viabilidade celular.

3. Dissociação mecânica

  1. Despeje um tubo de 25 ml / 5 g de tecido muscular em uma placa de Petri de vidro. Usando dois bisturi lida com anexados # 10 lâminas de bisturi, tecido picada até obter uma consistência de chorume ou purê. Um movimento "vai-e-vem" de puxar as lâminas de bisturi após se funciona melhor.
    Nota: Enquanto homogeneizadores tecido pode parecer adequado, o número de células viáveis ​​serão drasticamente reduzidos, se não abolido.
  2. Usando uma pipeta de 25 ml sorológica e pipeta sorológica, remover o tecido empapado e substituir no tubo cônico de origem.
  3. Repita os passos 3,1-3,2 até todos os tecidos em todos os tubos foi dissociado mecanicamente.
  4. Tecido Centrifugar durante 5 minutos a 300 xg e 10 ° C.
  5. Folldevido a centrifugação, descartar os 25 ml de sobrenadante de mídia com uma pipeta 25 ml sorológico, aspirador a vácuo, ou por decantação cuidadosa.
  6. Adicionar 25 ml de meio de lavagem a cada tubo de tecido, ressuspender e recentrifuge como acima.
  7. Lavar duas vezes com meio de lavagem, remoção do sobrenadante de cada vez.

4. Dissociação enzimática

  1. Durante o passo 3.4, preparar uma solução de colagenase por combinação de 0,22 g de colagenase do tipo IV e de 44 ml de meio de base (ou quantidade suficiente para g/0.22 0,11 ml).
  2. Misture um copo por 10-15 minutos a 4 ° C. Filtro esterilizar com uma seringa de 50 ml e um filtro de seringa de 0,45 um.
    NOTA: Mais do que um filtro de seringa pode ser necessário, dependendo da preparação da colagenase. Colagenase obtidos a partir de diferentes Worthington Biochemical fornecedores representa mais dificuldade durante a filtração. A colagenase é utilizado para dissociar ligações peptídicas em colagénio que constituem o endomísio. Estedigestão vai remover essa barreira protetora das fibras musculares.
  3. Por cada grama de tecido muscular, ressuspender o tecido numa solução de colagenase a 0,2%. Para se 5 g de tecido muscular, adicionar 10 ml de solução de colagenase e de 15 ml de meio de base.
  4. Adicionar 10 ul de PSF por ml de solução / meio base de colagenase (por exemplo, 250 ul para 25 ml). Certifique-se de que o tecido é bem suspenso, pois isso irá afetar a eficiência da digestão enzimática.
  5. Incubar o tecido muscular em colagenase durante 60 minutos a 18 ° C com oscilação suave. Dependendo do grau de dissociação mecânica e espécies, a digestão de colagenase pode ser prolongado até 90 minutos, embora isto possa afectar a viabilidade celular.
  6. Seguindo os tubos de digestão com colagenase, cónicos de centrifugação a 300 xg durante 5 minutos a 12 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender o tecido em 25 ml de meio de lavagem.
  7. Recentrifuge a 300 x g durante 5 minutos a 126; C. Repita com o meio de lavagem uma segunda vez.
  8. Depois de lavar duas vezes o tecido, o tecido do músculo ressuspender em 25 ml de meio de lavagem e tritura-se com uma pipeta 10 ml serológico até o tecido / homogenato médio passa dentro e para fora da pipeta com relativa facilidade. 5-10 triturações é geralmente suficiente.
    1. Repetir com uma pipeta de 5 mL e, em seguida, serológico cânula de metal de 16 gauge ligada a uma seringa.
  9. Tubos de centrífuga cónicos a 300 xg durante 5 minutos a 12 ° C. Decantar o sobrenadante.
  10. Durante a centrifugação acima de 5 minutos, a preparação da solução de digestão de tripsina por combinação de 0,25 g de tripsina com 5 ml de meio de base.
  11. Agita-se a 4 ° C durante 10-15 minutos e filtra-se esterilizar com uma seringa de 20 ml e de 0,45 um filtro de seringa.
  12. Recuperar tubos cónicos e adicionar 100 ul de solução de tripsina e 4,9 ml de meio de dissociação para cada 1 g de tecido muscular de cada tubo. Para example, adicionar 500 mL de solução de tripsina e de 24,5 ml de meio de dissociação de 5 g de tecido muscular.
    NOTA: A tripsina é uma serina-protease que irá separar as células precursoras a partir de miogénicas a lâmina basal.
  13. Tecido Ressuspender no tripsina / dissociação médio. Incubar durante 20 minutos a 18 ° C.
  14. Após a primeira incubação com tripsina, tubos cónicos de centrifugação a 300 xg durante 1 min a 12 ° C.
  15. Neutraliza-se a tripsina pela combinação dos sobrenadantes com meio de isolamento, a uma concentração de 1 volume de sobrenadante para 4 volumes de meio de isolamento. Armazenar a 4 ° C durante a segunda digestão com tripsina.
  16. Para o sedimento restante do tecido, repetir os passos 4,12-4,15, combinando o sobrenadante seguinte passo 4.15 com o meio sobrenadante / isolamento a partir da primeira digestão de tripsina.
  17. ALTERNATIVAMENTE: Os colagenase e tripsina digestões podem ser combinadas para optimizar os rendimentos de células.
    1. Para fazer isto, tritura-se o digerir com colagenase usando uma cânula de metal (6 de comprimento e calibre 16 funciona melhor) ligada a uma seringa de 20 ml, até o homogeneizado passa facilmente através da cânula.
    2. Para o homogeneizado, adicionar 500 mL de solução de tripsina (preparado no passo 4.10) e incubar a 18 ° C durante 20 minutos.
    3. Seguindo os tubos de incubação, cónicos de centrifugação a 300 xg durante 1 minuto, a 12 ° C.
    4. Neutraliza-se a tripsina pela combinação dos sobrenadantes com meio de isolamento, a uma concentração de 1 volume de sobrenadante para 4 volumes de meio de isolamento.
    5. Armazenar a 4 ° C durante a segunda digestão com tripsina.
    6. Prossiga com o passo 4.18 como com o protocolo padrão.
  18. Dispensar a final sobrenadante / isolamento mistura meio em tubos de 50 ml cônico e centrifugar a 300 xg durante 10 minutos a 12 ° C.
  19. Remover o sobrenadante tomando cuidado para não perturbar o celularpelotas. Pipeta de 2 ml de meio completo a cada tubo, dissolvendo cada sedimento celular.
  20. Combinar as células suspensas em meio completo em um tubo de 50 ml.
  21. Lavar cada tubo com 1 mL de meio completo, que combina com o conjunto de células ressuspensas anteriormente.
  22. Tritura-se com uma cânula de metal e uma seringa de 5-10 vezes.
  23. Filtrar a suspensão de células através de um coador de células de 100 mM, lavagem com meio completo.
  24. Filtra-se a suspensão de células através de um coador de células de 40 ^ m.
  25. Adicionar meio completo suficiente para 50 ml e centrifugar a 300 xg durante 10 minutos a 15 ° C.

5. Contar, diluição e Sementeira de Células

  1. Após a centrifugação final no passo 4.25, remover o sobrenadante por decantação cuidado ou com uma pipeta sorológica. Ressuspender o sedimento de células em 5 ml de meio completo.
  2. Com células totalmente ressuspenso, remover 20 ul, De suspensão de células e colocar em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  3. Adicionar 5 mL de corante azul de Tripan e aguarde 5 minutos. Usando um hemocitómetro, determinar o número de células viáveis.
  4. Após a determinação, diluir as células com a concentração necessária. Teleósteos PPM são mais cultivadas a 150.000-200.000 células por cm 2. Para uma estratégia de seis cavidades, chapeamento, diluir as células a 1,5 x 10 6 - 2,0 x 10 6 por ml suporta a proliferação e diferenciação suficiente.
  5. Recuperar-L-lisina-tratados poli, placas revestidas de laminina e células de sementes. (Veja a Tabela 5 para as diluições específica de placa e os volumes de chapeamento.) NOTA: A Tabela 6 descreve o número médio de células isoladas por grama de tecido de músculo isolado a partir de várias espécies de teleósteos. Truta arco-íris (O. mykiss) apresentam menos PPM por grama de tecido muscular do que peixe-zebra (D. rerio) e, assim, exigem mais peixe para isolar a partir de semeadura adequada.
  6. Selar as placas com fita de laboratório e em lugar incubadora de refrigeração, à temperatura adequada. PPM de todas as espécies listadas aqui (exceto para os ratos) pode ser incubados sob condições atmosféricas normais, sem a suplementação de dióxido de carbono (CO 2). (Ver Tabela 7).
  7. Em alternativa: Alguns laboratórios têm adotado um protocolo que exige permitindo PPM a aderir ao substrato de cultura para 40 minutos.
    1. Em seguida, lave as placas com os meios de lavagem para remover as células frouxamente unidas e não aderentes. Aviso: Esta etapa é muito importante para evitar a adesão "não específica" de outras células (por exemplo, os fibroblastos) para os substratos cultura.
    2. Adicionar mídia completas e células lugar na incubadora e cuidar como detalhado abaixo.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Vinte e quatro horas após a sementeira, as células precursoras miogénicos (PPM) deve ser visível ligado ao substrato de laminina (ver as figuras 1a e 1d). Após a sementeira, as células (PPM) adoptar uma forma fusiforme, indicativo desse tipo de células (Figura 1) e são MyoD1 + (Figura 2). Na espécie Danio, PPM parecem ser mais compacto, com processos bipolares menores do que os PPM de espécie Oncorhynchus e Salmo. No entanto, ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

O programa miogénica, em qualquer espécies examinadas, pode ser mais facilmente estudado por meio de um sistema in vitro. Com efeito, após o isolamento, as células precursoras miogénicos (PPM) em peixes ou células myosatellite (MSCs) em mamíferos facilmente entrar neste processo altamente regulado que envolve a proliferação, a retirada do ciclo celular, e a diferenciação terminal de mioblastos e a fusão dos mioblastos em miotubos nascentes. A falta generalizada de linhagens transgênicas repórter gene de espécie...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Não há nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de estender muitos agradecimentos aos Drs.. Josep Planas e Juan Castillo por sua experiência profissional no desenvolvimento e aplicação do presente protocolo cultura para pequenos peixes e anfíbios. Agradecimentos também são devidos aos inúmeros indivíduos que incansavelmente assistida com a dissecção e dissociação do tecido muscular de muitos peixes (tanto em espécies e número), incluindo Matthew carregamento, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall, Ben Meyer, Ethan Remily e Sinibaldo Romero. Este trabalho foi financiado pela Universidade de Alabama em Birmingham Departamento de Biologia fundos de arranque, Center for Research Protease NIH Grant # 2P20 RR015566, NIH NIAMS Grant # R03AR055350 e NDSU avançar NSF Grant # HRD-0811239 para PRB. O suporte também foi fornecido pela UAB Nutrição Obesidade Centro de Pesquisa prêmio # P30DK056336, NIH NIDDK. Seu conteúdo é de responsabilidade exclusiva de seus autores e não necessariamenterepresenta a visão oficial do NIH.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tabela 1. Informações detalhadas sobre
reagentes ReagentCompany (Preferencial v. Alternativo)Número de catálogo (Preferido v. Alternativo)Quantidade por cultura
γ-irradiado poli-L-lisinaSigma-Aldrich (MP Biomedicals)P5899 (ICN19454405)5 mg
DMEM (glicose alta)Sigma-Aldrich (cellgro)MT-50-003-PB (D7777)2 L
LamininaBD Biosciences ( Sigma-Aldrich)CB-40232 (L2020)1 mg
de Bicarbonato de Sódio (NaHCO3)Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)BP328-500 (S5761)1,51 g
HEPES (C8H18N2O4S)Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)BP310-1 (H6147)9,53 g
Antibiótico/AntimicóticoThermo Scientific (Sigma-Aldrich)SV3007901 (A5955)17-20 mL
de Sulfatode GentamicinaLonza (Sigma-Aldrich)BW17-519Z (G1397)2-3 mL
de doador Equino SeraThermo Scientific (Sigma-Aldrich)SH3007403 (H1270)75 mL
de soro fetal bovinoThermo Scientific (Sigma-Aldrich)SH3007103 (F2442)25 mL
de colagenase (tipo IV)Worthington (Sigma-Aldrich)LS004189 (C9891)0,44 g
de tripsina (do pâncreas)MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)ICN15357125 (T5266)1 g
Tabela 2. Consumíveis, Ferramentas e Equipamentos
Ferramentas de ConsumoEquipamento
Placas de Cultura de CélulasFórceps (Grosso)Pipetador
Estéril 50 mL Tubos CônicosFórceps (Fino)Medidor
de pH Fita de LaboratórioCabos de BisturiIncubadora de Resfriamento (Echotherm)
0.2 μ m Sistemas de Esterilização a VácuoLâminas de bisturi (#10, #11)Capuz
Autoclave repelente de água PapelTesoura cirúrgicaColetor de vácuo Pipetas
sorológicasde vidro PlacasPetri Medidor
12-16 G Cânulas com Luer Locks
Tabela 3. Volumes otimizados para revestimento de placas de cultura de células
Tamanho da placacm^2 por poçoPoli-L-lisina*Laminina**
6 poço9,51,6 mL1
24 poço1,90,320,2
48 poço0,950,160,1
96 poço0,320,060,03
*0,1 mg/mL concentração** 0,020 mg/mL concentração
Tabela 4. Meios para isolamento, dissociação e isolamento de
reagentesde cultura WashDissociação
Base Média419,25 mL395,40 mL297,00 mL
Sulfato de gentamicina**0,75 mL0,60 mL-Soro
Equino do Doador75,00 mL--
Soro Fetal Bovino***---
* PSF: penicilina/estreptomicina/coquetel de fungizona (100x); ** Concentração de 50 mg/mL; Caracterizado
Tabela 5. Diluições recomendadas e volumes de revestimento
Tamanho da placacm^2 por poçode revestimentodiluição
6 poços9,51,5-2,0x10^6 células/mL1 mL
24 poços1,91,5-2,0x10^6 células/mL250 μ L
48 poço0,951,5-2,0x10^6 células/mL150 μ L
96 poço0,321,5-2,0x10^6 células/mL50-100 μ L
Tabela 6. Número médio de células por g de tecido
EspécieMédia # células/g de tecido
Danio rerio6.400.000
Danio dangila1.783.000
Devario aequipinnatus1.797.000
Oncorhynchus mykiss66.800
Tabela 7. Temperaturas de incubação recomendadas
Temperaturada espécie
Danio/ Devario spp.26 - 28 &graus; C
Oncorhynchus/Salmo spp.10 * - 18 graus; C
Ambystoma mexicanum18° C
* Temperaturas mais baixas suportam taxas de proliferação mais baixas.
Serológicode fluxo laminar de de microosmolalidade Volume de

Referências

  1. Rescan, P. Y., Gauvry, L., Paboeuf, G. A gene with homology to myogenin is expressed in developing myotomal musculature of the rainbow trout and in vitro during the conversion of myosatellite cells to myotubes. FEBS Letters. 362 (1), 89-92 (1995).
  2. Castillo, J., Codina, M., Martinez, M. L., Navarro, I., Gutierrez, J. Metabolic and mitogenic effects of IGF-I and insulin on muscle cells of rainbow trout. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 286 (5), 935-941 (2004).
  3. Bower, N. I., Johnston, I. A. Paralogs of Atlantic salmon myoblast determination factor genes are distinctly regulated in proliferating and differentiating myogenic cells. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 298 (6), 1615-1626 (2010).
  4. Funkenstein, B., Balas, V., Skopal, T., Radaelli, G., Rowlerson, A. Long-term culture of muscle explants from Sparus aurata. Tissue & Cell. 38 (6), 399-415 (2006).
  5. Cornelison, D. D. Context matters: in vivo and in vitro influences on muscle satellite cell activity. Journal of Cellular Biochemistry. 105 (3), 663-669 (2008).
  6. Harris, M. Quantitative growth studies with chick myoblasts in glass substrate cultures. Growth. 21 (3), 149-166 (1957).
  7. Cornelison, D. D., Wold, B. J. Single-cell analysis of regulatory gene expression in quiescent and activated mouse skeletal muscle satellite cells. Developmental Biology. 191 (2), 270-283 (1997).
  8. Yablonka-Reuveni, Z., et al. The transition from proliferation to differentiation is delayed in satellite cells from mice lacking MyoD. Developmental Biology. 210 (2), 440-455 (1999).
  9. Yablonka-Reuveni, Z., Seger, R., Rivera, A. J. Fibroblast growth factor promotes recruitment of skeletal muscle satellite cells in young and old rats. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (1), 23-42 (1999).
  10. Le Moigne, A., et al. Characterization of myogenesis from adult satellite cells cultured in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 34 (1), 171-180 (1990).
  11. Tripathi, A. K., Ramani, U. V., Patel, A. K., Rank, D. N., Joshi, C. G. Short hairpin RNA-induced myostatin gene silencing in caprine myoblast cells in vitro. Applied Biochemistry and Biotechnology. 169 (2), 688-694 (2013).
  12. Ghahramani Seno,, M, M., et al. Transcriptomic analysis of dystrophin RNAi knockdown reveals a central role for dystrophin in muscle differentiation and contractile apparatus organization. BMC Genomics. 11, 345(2010).
  13. Honda, M., Hosoda, M., Kanzawa, N., Tsuchiya, T., Toyo-oka, T. Specific knockdown of delta-sarcoglycan gene in C2C12 in vitro causes post-translational loss of other sarcoglycans without mechanical stress. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 323-321 (2009).
  14. Rochard, P., et al. Mitochondrial activity is involved in the regulation of myoblast differentiation through myogenin expression and activity of myogenic factors. The Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2733-2744 (2000).
  15. Jackson, M. F., Hoversten, K. E., Powers, J. M., Trobridge, G. D., Rodgers, B. D. Genetic manipulation of myoblasts and a novel primary myosatellite cell culture system: comparing and optimizing approaches. The FEBS Journal. 280 (3), 827-839 (2013).
  16. McGrew, M. J., Rosenthal, N. Transgenic analysis of cardiac and skeletal myogenesis. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (6), 251-256 (1994).
  17. Dong, Y., Pan, J. S., Zhang, L. Myostatin suppression of Akirin1 mediates glucocorticoid-induced satellite cell dysfunction. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
  18. Chen, Y., Melton, D. W., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. MiR-351 transiently increases during muscle regeneration and promotes progenitor cell proliferation and survival upon differentiation. Physiological Genomics. 44 (21), 1042-1051 (2012).
  19. Shadrach, J. L., Wagers, A. J. Stem Cells for skeletal muscle repair. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 366 (1575), 2297-2306 (2011).
  20. Wu, X., Wang, S., Chen, B., An, X. Muscle-derived stem cells: isolation, characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. Cell and Tissue Research. 340 (3), 549-567 (2010).
  21. Farini, A., Razini, P., Erratico, S., Torrente, Y., Meregalli, M. Cell based therapy for Duchenne muscular dystrophy. Journal of Cellular Physiology. 221 (3), 526-534 (2009).
  22. Kim, H. J., Archer, E., Escobedo, N., Tapscott, S. J., Unguez, G. A. Inhibition of mammalian muscle differentiation by regeneration blastema extract of Sternopygus macrurus. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 237 (10), 2830-2843 (2008).
  23. McGann, C. J., Odelberg, S. J., Keating, M. T. Mammalian myotube dedifferentiation induced by newt regeneration extract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13699-13704 (2001).
  24. Cosgrove, B. D., Sacco, A., Gilbert, P. M., Blau, H. M. A home away from home: challenges and opportunities in engineering in vitro muscle satellite cell niches. Differentiation; Research in Biological Diversity. 78 (2-3), 2-3 (2009).
  25. Colbert, D. A., Edwards, K., Coleman, J. R. Studies on the organisation of the chicken genome and its expression during myogenesis in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 5 (2-3), 91-96 (1976).
  26. Bowman, L. H., Emerson, C. P. Post-transcriptional regulation of ribosome accumulation during myoblast differentiation. Cell. 10 (4), 587-596 (1977).
  27. Sun, S. S., McFarland, D. C., Ferrin, N. H., Gilkerson, K. K. Comparison of insulin-like growth factor interaction with satellite cells and embryonic myoblasts derived from the turkey. Comparative Biochemistry and Physiology. Comparative Physiology. 102 (2), 235-243 (1992).
  28. Marusich, M. F., Simpson, S. B. Changes in cell surface antigens during in vitro lizard myogenesis. Developmental Biology. 97 (2), 313-328 (1983).
  29. Schrag, J. A., Cameron, J. A. Regeneration of adult newt skeletal muscle tissue in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 77, 255-271 (1983).
  30. Hinkle, L., McCaig, C. D., Robinson, K. R. The direction of growth of differentiating neurones and myoblasts from frog embryos in an applied electric field. The Journal of Physiology. 314, 121-135 (1981).
  31. Yamane, H., Nishikawa, A. Differential muscle regulatory factor gene expression between larval and adult myogenesis in the frog Xenopus laevis: adult myogenic cell-specific myf5 upregulation and its relation to the notochord suppression of adult muscle differentiation. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. , (2013).
  32. Alexander, M. S., et al. Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors. Muscle & Nerve. 43 (5), 741-750 (2011).
  33. Froehlich, J. M., Galt, N. J., Charging, M. J., Meyer, B. M., Biga, P. R. In vitro indeterminate teleost myogenesis appears to be dependent on Pax3. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. , (2013).
  34. Gabillard, J. C., Sabin, N., Paboeuf, G. In vitro characterization of proliferation and differentiation of trout satellite cells. Cell and Tissue Research. 342 (3), 471-477 (2010).
  35. Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
  36. Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 477-483 (1968).
  37. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
  38. Antin, P. B., Ordahl, C. P. Isolation and characterization of an avian myogenic cell line. Developmental Biology. 143 (1), 111-121 (1991).
  39. Malatesta, M., Giagnacovo, M., Cardani, R., Meola, G., Pellicciari, C. Human myoblasts from skeletal muscle biopsies: in vitro culture preparations for morphological and cytochemical analyses at light and electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 976, 67-79 (2013).
  40. Scott, I. C., Tomlinson, W., Walding, A., Isherwood, B., Dougall, I. G. Large-scale isolation of human skeletal muscle satellite cells from post-mortem tissue and development of quantitative assays to evaluate modulators of myogenesis. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. , 10-1007 (2013).
  41. Baquero-Perez, B., Kuchipudi, S. V., Nelli, R. K., Chang, K. C. A simplified but robust method for the isolation of avian and mammalian muscle satellite cells. BMC Cell Biology. 13, (2012).
  42. Lu, A., et al. Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics. Gene Therapy. 15 (15), 1116-1125 (2008).
  43. Rouger, K., et al. Progenitor cell isolation from muscle-derived cells based on adhesion properties. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 55 (6), 607-618 (2007).
  44. Michal, J., et al. Isolation and characterization of canine satellite cells. In vitro cellular & Developmental Biology Animal. 38, 467-480 (2002).
  45. McFarland, D. C., et al. Isolation and characterization of myogenic satellite cells from the muscular dystrophic hamster. Tissue & Cell. 32 (3), 257-265 (2000).
  46. Burton, N. M., Vierck, J., Krabbenhoft, L., Bryne, K., Dodson, M. V. Methods for animal satellite cell culture under a variety of conditions. Methods in Cell Science: an Official Journal of the Society for In vitro Biology. 22 (1), 51-61 (2000).
  47. Pavlath, G. K. Isolation, purification, and growth of human skeletal muscle cells. Methods in Molecular Medicine. 2, 307-317 (1996).
  48. Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
  49. Doumit, M. E., Merkel, R. A. Conditions for isolation and culture of porcine myogenic satellite cells. Tissue & Cell. 24 (2), 253-262 (1992).
  50. Barjot, C., Jbilo, O., Chatonnet, A., Bacou, F. Expression of acetylcholinesterase gene during in vitro differentiation of rabbit muscle satellite cells. Neuromuscular Disorders: NMD. 3 (5-6), 443-446 (1993).
  51. Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2012).
  52. Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2012).
  53. Musaro, A., Barberi, L. Isolation and culture of mouse satellite cells. Methods in Molecular Biology. 633, 101-111 (2010).
  54. Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119 (4), 543-554 (2004).
  55. Yi, L., Rossi, F. Purification of progenitors from skeletal muscle. J. Vis. Exp. (49), (2011).
  56. Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells and Development. 17 (4), 653-667 (2008).
  57. Bosnakovski, D., et al. Prospective isolation of skeletal muscle stem cells with a Pax7 reporter. Stem Cells. 26 (12), 3194-3204 (2008).
  58. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
  59. Powell, R. L., Dodson, M. V., Cloud, J. G. Cultivation and differentiation of satellite cells from skeletal muscle of the rainbow trout Salmo gairdneri. Journal of Experimental Zoology. 250 (3), 333-338 (1989).
  60. Fauconneau, B., Paboeuf, G. Effect of fasting and refeeding on in vitro muscle cell proliferation in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Cell and Tissue Research. 301 (3), 459-463 (2000).
  61. Rescan, P. Y. Muscle growth patterns and regulation during fish ontogeny. General and Comparative Endocrinology. 142 (1-2), 111-116 (2005).
  62. Johnston, I. A., Bower, N. I., Macqueen, D. J. Growth and the regulation of myotomal muscle mass in teleost fish. The Journal of Experimental Biology. 214, 1617-1628 (2011).
  63. Mommsen, T. P. Paradigms of growth in fish. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 129 (2-3), 207-219 (2001).
  64. Biga, P. R., Goetz, F. W. Zebrafish and giant danio as models for muscle growth: determinate vs. indeterminate growth as determined by morphometric analysis. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 291 (5), 1327-1337 (2006).
  65. Roy, S., Gatien, S. Regeneration in axolotls: a model to aim for! Experimental Gerontology. 43 (11), 968-973 (2008).
  66. Echeverri, K., Tanaka, E. M. Ectoderm to mesoderm lineage switching during axolotl tail regeneration. Science. 298 (5600), 1993-1996 (2002).
  67. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
  68. Froehlich, J. M., Galt, N. J., Charging, M. J., Meyer, B. M., Biga, P. R. In vitro indeterminate teleost myogenesis appears to be dependent on Pax3. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. 49 (5), 371-385 (2013).
  69. Seger, C., et al. Analysis of Pax7 expressing myogenic cells in zebrafish muscle development, injury, and models of disease. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 240 (11), 2440-2451 (2011).
  70. Gabillard, J. C., Ralliere, C., Sabin, N., Rescan, P. Y. The production of fluorescent transgenic trout to study in vitro myogenic cell differentiation. BMC Biotechnology. 10, (2010).
  71. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Purification and separation of individual collagenases of Clostridium histolyticum using red dye ligand chromatography. Biochemistry. 23 (13), 3077-3085 (1984).
  72. Garikipati, D. K., Rodgers, B. D. Myostatin inhibits myosatellite cell proliferation and consequently activates differentiation: evidence for endocrine-regulated transcript processing. The Journal of Endocrinology. 215 (1), 177-187 (2012).
  73. Sanchez-Gurmaches, J., Cruz-Garcia, L., Gutierrez, J., Navarro, I. mRNA expression of fatty acid transporters in rainbow trout: in vivo and in vitro regulation by insulin, fasting and inflammation and infection mediators. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Molecular & Integrative Physiology. 163 (2), 177-188 (2012).
  74. Garikipati, D. K., Rodgers, B. D. Myostatin stimulates myosatellite cell differentiation in a novel model system: evidence for gene subfunctionalization. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (9), 1059-1066 (2012).
  75. Vraskou, Y., et al. Direct involvement of tumor necrosis factor-α in the regulation of glucose uptake in rainbow trout muscle cells. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (3), 716-723 (1152).
  76. Cleveland, B. M., Weber, G. M. Effects of insulin-like growth factor-I, insulin, and leucine on protein turnover and ubiquitin ligase expression in rainbow trout primary myocytes. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 298 (2), 341-350 (2010).
  77. Seiliez, I., et al. Amino acids downregulate the expression of several autophagy-related genes in rainbow trout myoblasts. Autophagy. 8 (3), 364-375 (2012).
  78. Chapalamadugu, K. C., et al. Dietary carbohydrate level affects transcription factor expression that regulates skeletal muscle myogenesis in rainbow trout. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 153 (1), 66-72 (2009).
  79. Seiliez, I., et al. Myostatin induces atrophy of trout myotubes through inhibiting the TORC1 signaling and promoting Ubiquitin-Proteasome and Autophagy-Lysosome degradative pathways. General and Comparative Endocrinology. 186, 9-15 (2013).
  80. Codina, M., et al. Metabolic and mitogenic effects of IGF-II in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) myocytes in culture and the role of IGF-II in the PI3K/Akt and MAPK signalling pathways. General and Comparative Endocrinology. 157 (2), 116-124 (2008).
  81. Seiliez, I., Sabin, N., Gabillard, J. C. Myostatin inhibits proliferation but not differentiation of trout myoblasts. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (2), 220-226 (2012).
  82. Averous, J., Gabillard, J. C., Seiliez, I., Dardevet, D. Leucine limitation regulates myf5 and myoD expression and inhibits myoblast differentiation. Experimental Cell Research. 318 (3), 217-227 (2012).
  83. Fauconneau, B., Paboeuf, G. Sensitivity of muscle satellite cells to pollutants: an in vitro and in vivo comparative approach. Aquatic Toxicology. 53 (3-4), 247-263 (2001).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

C lulas Precursoras Miog nicasCultura Prim ria de C lulasDissec o de TecidoDissocia o Mec nicaDissocia o Enzim ticaTratamento com ColagenaseSubstrato de LamininaPlaqueamento CelularEnsaio de Miog neseModelo de Peixe zebra
Preparação de Primário Miogênica de Células Precursoras / Culturas de mioblastos de Vertebrados basais Linhagens
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.