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Artigo de método

Eletrofisiológica Gravação De

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⸱

DOI:

10.3791/51355

⸱

26 de fevereiro de 2014

 ,  , 
1MCDB, Yale University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve gravação extracelular das respostas potenciais de ação disparados pelos neurônios do gosto labellar em Drosophila.

Resumo

A resposta ao gosto periférica de insectos pode ser fortemente investigada com técnicas electrofisiológicas. O método descrito aqui permite ao pesquisador para medir as respostas gustativas diretamente e quantitativamente, refletindo a entrada sensorial que o sistema nervoso do inseto recebe estímulos do paladar em seu ambiente. Este protocolo descreve todos os passos fundamentais na realização desta técnica. Os passos críticos na montagem de um equipamento de eletrofisiologia, como seleção de equipamento necessário e um ambiente adequado para a gravação, são delineadas. Nós também descrevem como se preparar para a gravação, fazendo referência e gravação de eletrodos apropriados e soluções de saborizante. Nós descrevemos detalhadamente o método utilizado para a preparação do inseto pela inserção de um eletrodo de referência de vidro na mosca, a fim de imobilizar a tromba. Mostramos vestígios dos impulsos elétricos disparados por neurônios do gosto em resposta a um açúcar e um composto amargo. Aspectos do protocolo são as technically desafiador e que incluem uma extensa descrição de alguns desafios técnicos comuns que podem ser encontrados, como a falta de sinal ou ruído excessivo no sistema, e as possíveis soluções. A técnica tem limitações, tais como a incapacidade de proporcionar estímulos temporalmente complexos, observar fundo disparar imediatamente anterior ao estímulo de entrega, ou usar compostos de sabor insolúveis em água convenientemente. Apesar destas limitações, esta técnica (incluindo variações menores referenciados no protocolo) é um padrão, procedimento amplamente aceito para a gravação de respostas neuronais Drosophila a gosto compostos.

Introdução

O sentido do gosto permite que um insecto para detectar uma vasta gama de produtos químicos solúveis e desempenha um papel importante para a aceitação de uma substância nutritiva, ou a rejeição de um nocivos ou tóxicos. Gosto também é pensado para jogar um papel na seleção de parceiros, através da detecção de feromônios 1-5. Estas funções importantes e diversificados têm feito o sistema de gosto inseto um alvo atraente de investigação sobre como os sistemas sensoriais traduzir estímulos ambientais em saídas comportamentais relevantes.

A unidade principal do sistema gosto Drosophila melanogaster é o cabelo gosto, ou sensillum. Moléculas entrar no sensillum através de uma poro na sua ponta de 2,6. Sensilas são encontrados no labellum, as pernas, a margem da asa, e a faringe 6. Por labelo, o número ea localização dos sensilla é estereotipado. Existem três classes morfológicas de sensilla com base em comprimento: o comprimento (L), intermediário (I) e curto (S ) Sensilla 7,8. Cada sensillum contém dois (I-tipo) ou quatro (L-e S-type) neurônios receptores gustativos (GRNs) 9. Diferentes GRNs respondem a diferentes tipos de estímulos do paladar: amargo, açúcar, sal e osmolaridade 7,10 e expressar diferentes subconjuntos de receptores gustativos 8,11-13. Apenas I e S-type sensilla conter GRNs amargas-responsive 8,10. O projecto GRNs para o gânglio supraesofágico (SOG) e a sua activação por moléculas de sabor é retransmitida para o sistema nervoso central mais elevada para a descodificação, resulta em uma resposta comportamental 6. O número relativamente pequeno de neurônios ea receptividade para análise molecular e comportamental tornar o sistema gosto Drosophila um excelente modelo para o estudo de sistemas gustativos em geral. A relativa facilidade com a qual o sistema pode ser manipulado através de mutação genética ou o sistema de expressão GAL4-UAS também serve como uma ferramenta valiosa 14,15.

EOR "> Porque estes sensilas sobressaem a partir da superfície do labellum, que constituem excelentes alvos para electrofisiologia. O disparo dos GRNs pode ser monitorizada usando a gravação extracelular. Historicamente, o método de gravação da parede lateral, que utiliza um eléctrodo de vidro inserido no sensillum para registar a actividade neuronal, 26 foi utilizada. No entanto, este método é tecnicamente difícil de executar, e que é difícil de gravar durante muito tempo a partir de cada preparação. método A ponta de gravação, o qual mede a resposta dos neurónios com um eléctrodo que proporciona simultaneamente um saborizante, se tornou o método de escolha 9,16. Ele tem sido utilizado para investigar o sistema de sabor de Drosophila melanogaster 8,10,17,18, bem como um número de outras espécies de insectos 19-23. Tem foi muito facilitado pelo desenvolvimento do amplificador tastePROBE, que supera uma das principais desvantagens do método de ponta de gravação, compensandoa grande diferença de potencial entre o eletrodo de referência eo inseto sensillum, permitindo que os potenciais de ação GRN a ser gravado sem amplificação excessiva ou filtragem 24. Outro desenvolvimento importante foi o uso de citrato de tricholine como eletrólito de gravação 25. TCC suprime respostas do GRN sensível ao osmolaridade e não estimula a GRN sensível ao sal, fazendo com que as respostas geradas por tastants amargo e açúcar muito mais fácil de analisar 25.

Aqui nós descrevemos como gravação ponta Drosophila labellar sensilla está realizado no laboratório Carlson. Este protocolo irá explicar como criar um equipamento adequado eletrofisiologia, como preparar a voar, e como realizar gravações gustativas. Também apresentamos alguns dados representativos obtidos através da gravação de subconjuntos de Drosophila sensilla, bem como alguns problemas comuns e as possíveis soluções que podem ser encontradas ao usar estetécnica.

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Protocolo

O protocolo a seguir está em conformidade com todas as orientações de cuidados de animais da Universidade de Yale.

1. Reagentes e Equipamentos Preparação

  1. Gravar configuração do equipamento (Figura 1A).
    1. Escolha uma sala para a instalação equipamento que está livre de grandes variações de temperatura ou umidade e também isolado de fontes de ruído elétrico e mecânico, como geladeiras e centrífugas.
      figure-protocol-1
      Figura 1. (A) Visão de configuração de gravação equipamento. Estereomicroscópio (a) está montado na plataforma de anti-vibração (b) o suporte do eléctrodo. Referência (c) é montada na plataforma em frente do andar de entrada (d), por meio de micromanipuladores. Um tubo de plástico de saída (e) fornecimento de corrente de ar humidificado dirigido à preparação mosca também está montado em tEle plataforma. O andar de entrada é ligado ao amplificador (f), o qual está ligado ao sistema digital de aquisição (DAS), (g), a qual está ligada a um PC (h). (B) Configuração de eletrodos e tubo de saída:. Eletrodo de referência à esquerda, eletrodo de registro no lado direito, e fluxo de ar tubo de saída dirigida a preparação mosca Clique aqui para ver imagem ampliada.
    2. Monte estereoscópico para centro de mesa anti-vibração ou plataforma.
    3. Anexar micromanipuladores para a preparação do eletrodo de referência / inseto e headstage / eletrodo de gravação à esquerda e à direita do microscópio, respectivamente, utilizando suportes magnéticos.
    4. Montagem de descarga do tubo de plástico numa terceira micromanipulador para a parte traseira do microscópio, orientado de tal modo que a abertura do tubo é apontada para a localização da mosca da preparação (ver Figura 1B).
    5. Usando tubos de plástico flexível, emtomada taq tubo de plástico para um frasco de vácuo parcialmente cheio com água. Conectar uma pequena bomba de aquário de bolha de ar através da água na garrafa, gerando uma corrente de ar humidificado por meio do tubo de saída de plástico para a mosca.
    6. Monte fibra óptica fonte de luz fora da mesa de vibração, orientando as saídas para iluminar a preparação ao refletir a luz através de um pedaço de papel cartão branco diretamente abaixo da preparação. Certifique-se de que a fonte de luz não descansa sobre a mesa. Nota: o benefício de reflectir a fonte de luz sobre um disco de papel é duplo: ela melhora o contraste, tornando mais fácil visualizar sensilas, e evita o aquecimento da preparação que iria resultar a partir da luz directa.
    7. Ligue amplificador tastePROBE no sistema de aquisição digital (DAS), e o DAS em um computador pessoal, de acordo com o manual do fornecedor. Ligue pé gatilho pedal e organizar em espaço de trabalho. Nota: as tomadas eletricamente isoladas para o amplificador eo DAS são altamente desejávelcapaz.
    8. Eletricamente terra microscópio, micromanipuladores, e fonte de luz, ligando componentes metálicos para a mesa usando clipes jacaré e comprimentos de fio elétrico isolado e fita isolante. Eletricamente terra plataforma de metal conectando-se a construção de solo ou DAS, que é aterrado através ficha de alimentação.
    9. Instalar o software de aquisição apropriado para o DAS de escolha no computador pessoal. Nota: Certifique-se de que os drivers de aquisição digital são compatíveis com o sistema operacional do PC.
    10. Configure amplificação software (10-100x), a filtragem do sinal (tipicamente um filtro de banda Bessel definir a partir de 100 Hz-3, 000 Hz), e taxa de amostragem (pelo menos 10 KHz). Nota: amplitudes de sinal dos neurônios gustativos são tipicamente na faixa de mV 0,5-2, por isso, a escala de exibição é definido para facilitar a sua visualização. Nota: O filtro de 100 Hz ajuda a excluir o ruído elétrico estranho, no entanto, muda a forma de picos e pode fazer avançada pico classificação more desafiando. Em alternativa, um filtro de 1 Hz pode ser usado.
    11. Opcionalmente, uma gaiola de Faraday, pode ser disposta em redor da mesa de vibração todo. No entanto, as pequenas folhas da folha de alumínio é geralmente suficiente para reduzir o ruído gerado pelo ambiente externo ou investigador.
  2. Eletrodo de vidro Preparação
    figure-protocol-2
    Figura 2. Referência e gravação de eletrodos. Fotografia sob a ampliação de capilares de vidro puxado para dentro do eletrodo de referência, com (A) e sem (B) ponta quebrada, e eletrodo de registro (C). Barra branca representa 2 mm. Clique aqui para ver imagem ampliada.
    1. Puxe a referênciaeletrodo de um capilar de vidro, utilizando um instrumento de pipeta extrator. Nota: As definições exatas do programa pipeta extrator irá variar de instrumento para instrumento. Tente conseguir um tempo muito longo conicidade gradual. O tamanho do poro na ponta não é crucial porque a ponta vai ser quebrado antes da preparação da mosca (Figuras 2A e 2B), no entanto, tornar-se que o diâmetro da extensão cónica do eléctrodo não é nem muito fino, o que não irá permitir o suficiente imobilização do labelo, nem muito grande, o que poderia danificar os neurônios gustativos ou ruptura das glândulas salivares.
    2. Puxe eletrodo gravação de um capilar de vidro de borosilicato com filamento usando um instrumento pipeta extrator. Tente alcançar um afunilamento que é menor do que a do eléctrodo de referência, e um diâmetro de poro de aproximadamente 10-15 mM (Figura 2C) 28.
  3. Preparação de soluções de saborizante
    1. Use Beadle-Ephrussi solução Ringerção (B & E) como eletrólito do eletrodo de referência. Para fazer um litro de B & E, dissolver 7,5 g de NaCl, 0,35 g de KCl, e 0,279 g de CaCl 2 2H 2 O ∙ em um litro de água ultrapura. Armazenar aliquotas pequenas a -20 ° C.
    2. Utilizar 30 mM solução tricholine citrato (TCC) como electrólito eléctrodo de registo e solvente para soluções de saborizante 25, se as respostas GRN amargas ou açúcar são para ser medido. Alternativamente, uma solução de cloreto de potássio mM 1-3 pode ser usado se as respostas da célula água estão a ser medidos.
    3. Para fazer com que as soluções de saborizante, pesar quantidade adequada de saborizante em pó e adicione a TCC para fazer uma concentração de estoque inicial. Use-a para fazer diluições em série a partir deste estoque inicial para produzir a concentração desejada para o teste. Nota: Se saborizantes não se dissolvem prontamente em água, um outro solvente, tal como etanol, pode ser utilizado para fazer a concentração estoque inicial. Uma solução de controle adequado de TCC e solvente sem saborizantedeve ser usado no presente caso.
    4. Armazenar aliquotas de longo prazo a -20 ° C. Armazenar uma alíquota de uma solução de trabalho de saborizante, a 4 ° C durante a gravação de uso para até uma semana, dependendo das propriedades químicas do saborizante.

2. Drosophila Preparação

figure-protocol-3
Figura 3. Preparação de voar para a gravação. (A) posição de inserção do eletrodo de referência em tórax dorsal de mosca. A seta branca indica o eletrodo de referência. (B) Posição intermédia do eletrodo de referência: avançado através pescoço e cabeça, tromba ainda não prorrogada. (C, D) Voar com eletrodo de referência na posição final com a ponta do eletrodo dentro labelo e probóscidetotalmente estendida. Clique aqui para ver imagem ampliada.

  1. Colete moscas recém eclosed para gravar a partir de culturas de voar bem conservados, cultivados sob condições de temperatura e-umidade controlada, e idade-los em 5-10 dias frescos frascos de cultura antes de gravar.
  2. Descontraia placa microscópio no gelo por 15-30 minutos antes de preparar mosca.
  3. Aterramento eletrodo de referência de vidro com solução B & E usando um longo, agulha de plástico fino de 0,5 mm de diâmetro, tal como uma agulha espinhal e seringa de 1 ml e bata suavemente para fora todas as bolhas. Quebre pequena quantidade de ponta fora usando uma pinça e usar a ação capilar para tirar todas as bolhas restantes com um lenço de papel, observando sob microscópio de dissecação.
  4. Deslize B & E-preenchido eletrodo de referência no fio de suporte do eletrodo de referência, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar.
  5. Aspirar voar em uma ponta P200 pipeta, usando aspirador mosca construídode tubulação, malha, e ponteira; 29 lugar no balde de gelo e leve à geladeira por 30-60 seg.
  6. Remova a placa de microscópio de gelo, limpe toda a umidade, ea posição debaixo do microscópio. Bata suavemente voar para fora da ponta da pipeta no prato microscópio.
    Nota: a mosca deve ser suficientemente imobilizada para manipular facilmente.
  7. Sob baixa ampliação, retire as patas dianteiras com um par de fórceps, mantendo o tórax estável com o outro par de fórceps. Posicione a mosca em seu lado ventral, lateral dorsal voltada para cima. Nota: Sempre tome cuidado para evitar tocar o labelo com a pinça em todos os momentos durante o processo de preparação para minimizar danos mecânicos.
  8. Enquanto mantém a mosca no lugar com um par de fórceps, insira o eletrodo de referência na linha média do tórax posterior dorsal. Um ângulo sugerido de entrada é de aproximadamente quarenta e cinco graus, na direção da cabeça (Figura 3A).
  9. Fixe o electrod referênciatitular e com modelagem em argila de tal forma que a mosca é visível debaixo do microscópio em grandes ampliações. Manobra e ângulo do eletrodo de vidro através do pescoço e cabeça, deslizando a voar para o suporte do eletrodo de referência usando dois pares de fórceps. Nota: Trabalhe rapidamente, mas sem problemas, é mais fácil para concluir esta etapa, enquanto a mosca ainda é imobilizado por causa do frio (Figura 3B).
  10. Gentilmente estender a tromba com um par de fórceps, enquanto desliza a mosca ainda mais para baixo o eletrodo de referência vidro, até que a ponta do eletrodo está no interior do labelo ea tromba está totalmente estendido (Figuras 3C e 3D). Nota: Tome cuidado para não perfurar qualquer parte do tecido tromba ou distender a borda do labelo com o eletrodo de referência, pois isso pode danificar a voar e / ou sabor neurônios e afetam a qualidade de gravação.

3. Gravar a partir de Labellar sensilla

figure-protocol-4
Figura 4. Gravar a partir de mosca. (A) labelo de preparação mosca na esquerda, com eletrodo de registro alinhados para contato em direito, em grandes ampliações. (B) eletrodo de registro e sensillum único no labelo em contato, sob alta ampliação. Clique aqui para ver imagem ampliada.

  1. Sempre aterre-se tocando a superfície metálica da mesa anti-vibração ou plataforma antes de tocar em qualquer equipamento durante o processo de gravação! Nota: É extremamente importante para não fornecer uma carga estática para o andar de entrada, como que podem danificar o circuito.
  2. Titular seguro eletrodo de referência para micromanipulador montado na mesa de ar de recording plataforma. Posição um lobo de labelo em microscópio de campo de vista, sob alta ampliação (tipicamente pelo menos 140X), e em linha com fluxo de ar umidificado.
  3. Ligue fluxo de ar umidificado, computador, DAS, e amplificador. Software de aquisição de Abrir.
  4. Enxaguar e encher eletrodo de vidro com gravação de saborizante desejado.
    1. Lavar eléctrodo de registo de vidro com água ultrapura usando uma seringa e um tubo de plástico 28 para puxar as pequenas quantidades de água através do tubo, pelo menos, dez vezes.
    2. Enxágüe com eletrodo de registro de saborizante, pelo menos cinco vezes. Preencha eletrodo de registro aproximadamente um terço a metade do caminho completo com saborizante e retire do tubo. Se houver bolhas de ar, toque para liberar ou simplesmente encher o eletrodo.
    3. Deslize eléctrodo ao fio de prata do andar de entrada de forma rápida e sem problemas de modo a não introduzir bolhas de ar.
  5. Estimular único sensillum com eletrodo de registro cheio de saborizante.
    1. Use o micromanipuutilizar a calculadora para trazer o eletrodo de registro alinhado com sensillum de interesse.
    2. Pressionar o pedal para accionar o modo de aquisição do amplificador.
    3. Avançar o eletrodo de registro com o botão de controle micromanipulador fina com cuidado até que ele entra em contato com ponta de sensillum ea gravação começa.
    4. Retire o eletrodo após 1-2 seg.
    5. Repita o passo 3.5 com outro sensilla, se desejar. Nota: Espere pelo menos 1 min entre apresentações ao mesmo sensillum. Se a gravação de um único saborizante por um período prolongado de tempo, a solução do saborizante pode secar e a solução na ponta pode tornar-se mais concentrado. Isso pode ser remediado, contactando delicadamente a ponta do eletrodo de vidro com papel suave para remover uma pequena quantidade de líquido por ação capilar.
  6. Para gravar as respostas a uma outra de saborizante, lavar e eletrodo de registro de carga com novo do saborizante e repita o passo 3.4. Nota: Completamente enxaguar o eletrodo entre tastants é absolutely crucial para evitar a contaminação cruzada.
  7. Salve arquivos de dados periodicamente com as informações de identificação, tais como data, genótipo, e saborizantes. Nota: É importante manter um registro escrito da identidade e do saborizante sensillum de cada apresentação durante a gravação de sessão para análise de dados.

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Resultados

A Figura 5A mostra a resposta de um L sensillum a um açúcar, sacarose. O mesmo sensillum não responde a um composto amargo, berberina. Figura 5B mostra que uma sensillum tipo I, que contém um neurónio sensível amargo, exibe maiores picos de amplitude em resposta a berberina e menores picos de amplitude em resposta a sacarose. L sensilas exibir uma resposta mínima do fundo para o controlo de solvente, TCC, enquanto sensilas exibir praticamente nenhuma resposta à CTP (Figura 5).

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Discussão

Sensilas Labellar variar na facilidade de gravação devido às diferenças em morfologia e organização anatómica. Às vezes, um sensillum não responder a quaisquer tastants, mesmo aquele que é conhecido por provocar uma resposta positiva. A frequência com que isso ocorre varia dependendo do tipo de sensillum. L sensilla são mais consistentemente ágil e são relativamente fáceis de acessar devido ao seu comprimento. Em geral, S sensilla são sempre sensível, mas sua curta duração e posição no labelo fazer um bom contato desafi...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por uma concessão 1F31DC012985 predoctoral NRSA (para RD) e por concessões do NIH para JC

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Weiss Linnea pelos comentários úteis sobre o manuscrito, o Dr. Ryan Joseph para ajuda compilando números, eo Dr. Frederic Marion-Poll para assessoria técnica útil. Gostaríamos também de agradecer as observações úteis de quatro colaboradores.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microscópio de zoom estéreoOculares OlympusSZX12 DFPLFL1.6x PF: WHN10x-H/22capaz de ampliação de ~150X com suporte de montagem em mesa de longa distância de trabalho
cinéticosde mesa antivibraçãoBenchMate2210
MicromanipuladoresNarishigeNMN-21
Suportes magnéticosENCOModelo #625-0930
Referência Suporte de eletrodoHarvard ApparatusESP/W-F10NPode ser montado em pipeta sorológica de 5 ml para alcance estendido
Silver WireWorld Precision InstrumentsAGW15100,3-0,5 mm de diâmetro
deretorta
Tubo de plásticode saída genérico,
tubo de plástico flexívelNalgene8000-0060VI grau 1/4 in diâmetro interno 
Cônico genérico de 500 ml, com braço lateral
Bomba de AquárioJardins AquáticosAirpump 2000
Fonte de Luz de Fibra ÓpticaDolan-Jenner IndustriesFiber-Lite 2100
Cartão/Papel BrancoSistema de Aquisição Digital Whatman1001-110
Alternativa SyntechIDAC-4: National Instruments NI-6251  
AmplificadorTasteprobe TasteprobeSyntechDTP-1
Tasteprobe
Alligator ClipsGrainger1XWN7Qualquer marca está bem
FioConector
de Ouro Genérico Pinos Computador
DellVostroVerifique a compatibilidade com o sistema de aquisição digital e software
Software de aquisiçãoSyntechAutospikeO Autospike funciona com o IDAC-4; alternativamente, use o LabView com a folha de alumínio NI-6251
e/ou a gaiola de FaradayBlindagem contra ruído eletromagnético
Capilares de vidro de borosilicatoPrecision Instruments1B100F-4
Extrator de PipetasSutter Instrument CompanyModelo P-87 Flaming/Brown Micropipette
Beadle e Ephrussi RingerVeja a receita na seção de protocolo
Citrato de tricolina, 65% Estereomicroscópio SigmaT0252-100G
OlympusVMZ 1x-4xCapaz de ampliação de 10-40X
BaldePontas
Pipeta P200Genéricas Agulha espinhal genérica
TerumoSN*2590
Seringa de 1 mldeBeckton-Dickenson
Montado a partir de pontas de pipeta P1000, tubo de plástico flexível e malha
Argila
FórcepsFerramentas de ciência fina por Dumont11252-00#5SF (pontas superfinas)
Seringa de 10 mlBeckton-Dickinson301029
Tubo de PlásticoTygonR-3603
Sistemas Suporte genérico de 1 cm de diâmetro Frasco Headstage Elétrico Isolado Pessoal World Precision Instruments 5482 World Extrator Solução de Gelo de Aspirador Moscas 301025 de modelagem genérico

Referências

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