Uma estratégia para sensíveis, Large Scale quantitativos Metabolomics

Resumo

Metabolite perfis tem sido um ativo valioso para o estudo do metabolismo na saúde e na doença. Utilizando cromatografia normal em fases líquida acoplada à espectrometria de massa de alta resolução com mudança de polaridade e um ciclo rápido, nós descrevemos um protocolo para analisar a composição metabólica polar de material biológico com alta sensibilidade, precisão e resolução.

Resumo

Metabolite perfis tem sido um ativo valioso para o estudo do metabolismo na saúde e na doença. No entanto, as plataformas atuais têm diferentes fatores limitantes, como o trabalho intensivo preparações de amostra, baixos limites de detecção, velocidades de varredura lenta, otimização de método intensivo para cada metabólito, e a incapacidade de medir tanto positivamente e íons negativamente carregados em experiências individuais. Portanto, um protocolo de metabolômica novela poderia avançar estudos metabolômica. Cromatografia hidrófilo à base de amida permite análise de metabolitos polares sem qualquer transformação química. MS de alta resolução usando o Q-Exactive (QE-MS) melhorou óptica de íons, o aumento da velocidade de varredura (256 ms na resolução 70.000), e tem a capacidade de realizar comutação positivo / negativo. Usando uma estratégia de extracção de metanol frio, e o acoplamento de uma coluna de amida com QE-MS permite a detecção robusta de 168 metabolitos polares alvo e milhares de características adicionais simultaneamente. Datum tratamento é realizado com um software comercialmente disponível de uma maneira altamente eficiente, e características desconhecidas extraídos a partir dos espectros de massa pode ser consultado na base de dados.

Introdução

Metabolomics, definido como um ensaio que mede vários metabolitos simultaneamente, tem sido uma área de grande interesse. Metabolomics fornece uma leitura direta da fisiologia molecular e forneceu insights sobre o desenvolvimento e doenças como o câncer de ^1-4. Ressonância magnética nuclear (RMN) e cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS) estão entre os mais utilizados instrumentos ^5-9. RMN, especialmente foi usado para experiências de fluxo desde que os compostos marcados de isótopos pesados, tais como ¹³ C metabolitos marcados, são RMN-activo ^10,11. No entanto, esta estratégia requer relativamente elevado grau de pureza da amostra e grande quantidade de amostra, o que limita as suas aplicações em metabolômica. Enquanto isso, os dados recolhidos a partir de RMN precisa de análise intensiva e atribuição composto de espectros de RMN complexo é difícil. GC-MS tem sido amplamente utilizada para os metabolitos polares e estudos de lípidos, mas requer os composto volátilds e, portanto, muitas vezes derivação de metabólitos, o que às vezes envolve química complexa que pode ser demorado e introduz ruído experimental.

Cromatografia líquida (LC) acoplada à espectrometria de massa triplo quadrupolo utiliza o primeiro quadrupolo para selecionar os íons pais intactos, que são fragmentados no segundo quadrupolo, enquanto o terceiro quadrupolo é usado para selecionar fragmentos característicos ou íons filha. Este método, que registra a passagem de íons de pais para filha íons específicos, é denominado de monitoramento de reações múltiplas (MRM). MRM é um método muito sensível, específico e robusto tanto para pequenas moléculas e quantificação de proteínas ^12-15,21. No entanto, MRM tem suas limitações. Para alcançar alta especificidade um método MRM precisa ser construído para cada metabólito. Este método consiste na identificação de um fragmento específico de energia de colisão e optimizado, o que requer conhecimento prévio do prope correspondentesrties dos metabólitos de interesse, tais como informações de estrutura química. Portanto, com algumas excepções que envolvem a perda neutra de fragmentos comuns, não é possível identificar metabolitos desconhecidos com este método.

Nos últimos anos, a espectrometria de massa de alta resolução (HRMS) instrumentos foram lançados, como a série LTQ-Orbitrap e Exactive, o QuanTof e TripleTOF 5600 ^16-18,22. HRMS pode proporcionar um rácio de massa para carga (m / z) de iões intactas dentro de um erro de poucos ppm. Portanto, um instrumento HRMS operado pela detecção de todos os iões de precursor (ou seja, modo de varrimento completo) pode obter informação estrutural directa da massa exacta e a composição elementar resultante da substância a analisar, e esta informação pode ser usada para identificar possíveis metabolitos. Com efeito, todas as informações sobre um composto pode ser obtido com uma massa exacta, até o nível de isómeros estruturais. Além disso, um completométodo de verificação não requer conhecimento prévio de metabólitos e não requer método de otimização. Além disso, uma vez que todos os íons com m / z cair na faixa de varredura pode ser analisado, HRMS tem uma capacidade quase ilimitada em termos de número de metabólitos que podem ser quantificados em uma única corrida em comparação com o método MRM. HRMS é também comparável ao de um MRM quadrupolo triplo da capacidade quantitativa devido ao ciclo de trabalho curto, resultando num número comparável de pontos de dados que podem ser obtidos de uma análise completa do MS. Portanto, HRMS proporciona uma abordagem alternativa para o metaboloma quantitativos. Recentemente, uma versão melhorada do HRMS denominada espectrometria de massa Q-Exactive (QE-MS) pode ser operado sob a comutação entre os modos positivos e negativos com tempos de ciclo suficientemente rápido em um único método, o que amplia o alcance de detecção ^19. Aqui nós descrevemos a nossa estratégia metabolômica usando o QE-MS.

Protocolo

1. Preparação de LC-MS Reagentes, Estabelecimento de um método de cromatografia, e estabelecimento de procedimentos operacionais de instrumentos

1. Preparação de solventes LC
   1. Prepare 500 ml fases móveis. A é acetato de amónio 20 mM e 15 mM de hidróxido de amónio em 3% de acetonitrilo / água, pH final de 9,0; e B é 100% de acetonitrilo.
   2. Vagamente tampar a garrafa, coloque-o em um banho de água sonicador e sonicate por 10 minutos sem aquecimento extra. (Este passo é o de assegurar que todos os sais de amónio e dissolver completamente que não há bolhas de ar residual.)
   3. Transferir 250 ml de solvente a uma garrafa de 250 ml de vidro para uso LC-MS, e manter o restante a 4 ° C.
2. Prepare a solução de calibração gama baixa massa. É importante a utilização de uma mistura de calibração de gama baixa massa personalizado para aplicações metabolómicos para assegurar que as massas exactas são detectados com pesos moleculares baixos.
   1. Pesar 5 mg de ambos Sodihum fluoroacetato e ácido homovanilico e dissolvê-los em 5 ml de água para fazer uma concentração final de 1 mg / ml. Dissolver em metanol diazinon para fazer uma concentração final de 10 mg / ml.
   2. Para preparar 1 ml de solução negativa baixa calibragem massa, misture 960 ml de solução de calibração térmica negativa com 20 ml de fluoroaceate sódio e solução de ácido homovanílico. Para fazer com que 1 ml de solução positiva baixa calibragem massa, misture 990 ml de solução de calibração termo positivo e 10 ml de solução diazinon. (A solução de calibração de baixa massa deve ser armazenada a 4 ° C e ser preparado fresco a cada 2 meses.)
3. Calibração de QE-MS em uma missa Gama Baixa
   1. Antes de realizar a calibração de baixa faixa de massa, efectuar uma calibração de massa padrão (m / z, 150-2,000) nos modos positivos e negativos com base em instruções do fabricante.
   2. Uma vez que uma massa de calibração normal passa, ajustar o intervalo de varredura de 60-900 m / z no painel de controle do instrumentoe uma fonte de CID de 25 eV no modo positivo e de 35 eV no modo negativo é aplicado. (Isto dará sinais consistentes de ião fragmento cafeína e o ião sulfato. O intervalo de varrimento aqui é fixo, porque a última m / z não deve ser maior do que a 15x da partida m / z)
   3. Uma vez que a fonte de íons é estável, em seguida, realize a calibragem personalizado. Nota: Uma fonte estável é definida como inferior a 10% da variação de corrente total de iões no modo positivo, e menos do que 15% em modo negativo. Os iões de calibração correspondendo à medida e m / z são indicados na Tabela 1.
4. Estabelecer a instrumentação LC-MS para análise metabólito polar. LC é acoplado a um QE-MS para separação e detecção de metabolito.
   1. Equipar o QE-MS com uma sonda de ionização electrospray aquecida (H-ESI). Defina os parâmetros de ajuste relevantes para a sonda, conforme listado: temperatura do aquecedor, 120 ° C; gás bainha, 30; gás auxiliar, 10; varrer a gás, 3; pulverizar tensão, 3,6 kV paramodo positivo e 2,5 kV para o modo negativo. Ajuste da temperatura de capilar a 320 ° C, e S-lente a 55.
   2. Construir um método de varredura completa da seguinte forma: faixa de varredura completa: 60 a 900 (m / z); resolução: 70.000; tempo máximo de injeção: 200 ms com tempos típicos de injeção de cerca de 50 ms; controle automático de ganho (AGC): 3.000.000 íons. Essas configurações resultar em um ciclo de trabalho de cerca de 550 ms para a realização de exames em modo positivo e negativo.
   3. Estabelecer o método de cromatografia. Empregar uma coluna de amida (100 x 2.1 mm id, 3.5 mm) para separação de compostos à temperatura ambiente ^13,15. A fase móvel A é como descrito acima, e a fase móvel B é acetonitrilo. Usar um gradiente linear como se segue: 0 min, 85% B; 1,5 min, 85% de B, 5,5 min, 35% B; 10 min, 35% B, 10,5 min, 35% B, 14,5 min, 35% B, 15 min, 85% B e 20 minutos, 85% de B. O caudal é de 0,15 ml / minuto, desde 0 até 10 minutos e 15 a 20 min, e 0,3 ml / min, 10,5-14,5 min.

2. Preparation de Amostras metabólito

1. Preparar um solvente de extracção. Misturar 40 ml de metanol (LC-MS grau) e 10 ml de água (LC-MS grau) em um tubo de 50 ml, e mantê-lo no freezer -80 ° C durante pelo menos 1 hora antes da utilização. Nota: O procedimento e os passos que se seguem podem ser modificadas para a extracção do tecido biológico e amostras de fluidos.
   1. HCT cancro do cólon 8 Cultura de células em três placas de 10 cm ou de placas de 6 poços, com meio de crescimento completo, meio RPMI 1640 suplementado com 10% inactivado pelo calor de soro fetal bovino e 100.000 unidades / L de penicilina e 100 mg / L de estreptomicina.
   2. Quando as células chegar a 80% de confluência, remover rapidamente o meio e coloque o prato ou prato em cima de ^13,15 gelo seco. Adicionar 1 ml de solvente de extracção imediatamente (80% de metanol / água), e transferir a placa para a -80 ° C congelador. Para uma placa de 10 cm, adicionar 3 ml de solvente de extracção para cada poço. (Tentar remover o meio, tanto quanto possível, para evitar o efeito de supressão de iões devido aos sais residuais do meio.)
   3. Deixar a placa durante 15 min. Retire-o do freezer, e raspar as células para o solvente em gelo seco. Transferir a solução de 1,7 ml de Eppendorf e centrifuga com a velocidade de 20.000 xg, a 4 ° C durante 10 min. (Preparar metabólitos celulares a partir de três pratos separados para fazer três amostras idênticas. A finalidade de manter dois tubos é ter um como um backup.)
   4. Transferir o sobrenadante para dois novos tubos Eppendorf, e secá-las sob vácuo velocidade. Isto leva cerca de 3-6 horas, dependendo da velocidade de vácuo utilizado. (As amostras também podem ser secas durante a noite sob atmosfera de azoto.)
   5. Após a secagem, armazenamento de tubos de cada amostra no freezer -80 ° C. Quando pronto, reconstituir uma amostra em 20 ml de água (LC-MS grau), e injectar 5 ml de LC-QE-MS para análise.

3. Configuração de Sequência Amostra

1. Uma vez que a calibração foi corretamente realizado na QE-MS, equilibrar coluna LC por 5 min com 85% de A a um fluxotaxa de 0,15 ml / min, o que é a condição inicial do gradiente LC.
2. Configure a seqüência de amostra, de forma aleatória. Nota: Neste modo, que distribui as flutuações introduzidas por LC-MS para cada amostra e garante comparação mais precisa entre as diferentes amostras. Cada 6 amostras, adicionar uma corrida de lavagem, o qual partilha o mesmo método de MS, excepto o gradiente de LC é de 95% de A durante 10 min e seguido de uma coluna de equilíbrio de 5 minutos a 85% A com uma taxa de fluxo de 0,15 ml / min. Adicionar amostras em branco (100% de água) após cada corrida lavagem para avaliar o ambiente do sistema e transitar níveis.
3. Salve a sequência e uma vez que a coluna LC mostra a pressão estável, em torno de 400 psi, iniciar a seqüência de execução. Se não há outro exemplo é para ser executado após esta sequência, em seguida, adicionar uma corrida de paragem no fim da sequência, que tem uma taxa de fluxo de 0 ml / min, no fim do gradiente e escolha de "espera", após terminar a seqüência.
4. Re-executar a mesma amostra definida 12 horas após a calibração. (Esta is para avaliar a variação de massa de erro após a calibração.)

4. Publicar Análise Instrumento de Limpeza e Manutenção

1. No final da sequência, lava-se a coluna com 95% de A a uma taxa de fluxo de 0,2 ml / min, durante 2 horas, e, se necessário, inverter a coluna antes da lavagem.
2. Remova a coluna LC e se conectar diretamente a LC à fonte de íons por um sindicato. Preparar um solvente de limpeza, / metanol / ácido fórmico água (v: v: v, 90:10:0.2), definido de MS em modo de repouso, e um sistema de lavagem de LC-MS, a uma taxa de fluxo de 0,1 ml / min durante 1 hora para remover o precipitado residual sais ou outras impurezas. Abaixe a taxa de fluxo, se houver pressão do sistema muito.
3. Ajuste da temperatura de capilar a 50 ° C, e retirar a gaiola de iões. Retire cuidadosamente o cone de varredura de íons e do tubo de transferência de íons após a temperatura capilar cai para 50 ° C. Use uma malha grosseira, tal como lixa, para remover as impurezas deixadas sobre a superfície do cone de varrimento de iões.
4. Coloque a transferência de iõestubo dentro de um tubo Falcon de 15 ml contendo 10 ml de água 90% / metanol com ácido fórmico a 0,1%. Depois de sonicação o tubo num banho de água de ultra-sons durante 20 minutos, decanta-se o solvente no interior, substituí-la com 10 ml de metanol puro e sonicar durante mais 20 minutos. (Se necessário, a sonicação pode ser feito a 40 ° C ou mesmo uma temperatura mais elevada para obter melhores resultados de limpeza.)

5. Análise de LC-MS de Dados

1. Para garantir a seqüência de amostra é executado sem problemas, depois de terminar as duas primeiras amostras na seqüência, verificar picos de metabolitos desconhecidos. Use um arquivo csv listando nomes metabólito, fórmula química neutra e modo de detecção (positivo ou negativo), como o arquivo de entrada eo arquivo de saída contém picos extraídos e erro em massa em ppm. Se a forma do pico é anormal ou o erro de massa é desligado por mais do que 5 ppm, em seguida, o resto da sequência deve ser parado e solução tem de ser feito.
2. Escolha o método de "alinhamento de picoe extração frame "em software disponível comercialmente. Selecione os dados brutos de LC-MS e agrupá-los. Escolha amostras no meio da seqüência de execução como amostra de referência de cromatografia para o alinhamento de pico. Envie uma semente quadro incluindo metabólitos conhecidos para a análise metabólitos alvejado com dados coletados e as sementes quadro correspondente.
3. Realizar análise de dados em modo positivo e negativo separadamente. Use a configuração padrão para outros parâmetros. Desligue a função de pesquisa de banco de dados e executar o fluxo de trabalho. Exportar os dados processados ​​como uma folha de excel, contendo a área do pico de cada frame. Os primeiros conjuntos de quadros correspondem aos metabolitos na lista alvo. Nota: Para uma análise metabolito alvo, a informação metabolitos é obtido com base nos estudos anteriores ^13,15.
4. Para uma análise metabólito não segmentados, escolha o método de "extração de componente". Carregar amostras em branco para o fundo subtração. Definir pico intensidade do limiar de umt 10 ^5, a largura m / z de 10 ppm e a relação sinal-ruído de 3.
5. Utilizar dados metaboloma humano para a identificação de compostos desconhecidos. Use um filtro de CV para remover os componentes com grandes currículos dentro de amostras idênticas. Ir manualmente através de cada componente e escolher aqueles com pico bem definido ou relativamente grande diferença em amostras de diferentes tipos de pesquisa de banco de dados. Exportar dados com acessos em banco de dados. (Alinhamento Peak pode ser contornado se a pontuação alinhamento de pico é muito baixa.)

Resultados

A precisão dos dados metabolômica altamente depende do desempenho do instrumento LC-QE-MS. Para avaliar se o instrumento está a funcionar em boas condições, e se o método aplicado é adequado, vários picos LC metabolitos conhecidos são extraídos a partir da cromatografia iónica total de (TIC), como mostrado na Figura 1. Metabolitos polares, incluindo aminoácidos, intermediários glicólise , intermediários de TCA, nucleótidos, vitaminas, ATP, ^NADPH e assim por diante têm uma boa retenção na colu...

Discussão

Os passos mais críticos para perfilamento metabolito bem sucedida em células, utilizando este protocolo são: 1) o controlo do meio de crescimento e extracção cuidadosa das células; 2) ajustar o método de LC com base em MS configuração método para garantir que não são suficientes (geralmente pelo menos 10) pontos de dados em um pico para a quantificação; 3) fazer uma calibragem baixa massa antes de executar amostras; 4) a injecção de não mais do que 5 ml de evitar um tempo de retenção de deslocamento e alargamento do pic...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Mistura de calibração positiva	Thermo Scientific	#88323	É sensível à luz. Armazene a 4 ° C
Mistura de calibração negativa	Thermo Scientific	#88324	Armazenar a 4 ° C
Diazinon	Sant Cruz Biotecnologia	#C0413	Causa irritação nos olhos, então trabalhe com capuz. Armazene a 4 °
Inserção de agulha C H-ESI Fisher	Scientific	#1303200	Isso pode ser substituído ou limpo com 5% de ácido fórmico/água (remova o anel de borracha) se estiver entupido.
Coluna de amida Xbridge	Waters	#186004860	A coluna Guard é recomendada para aumentar a vida útil da coluna.