Juxtasomal biocitina Labeling para estudar a função Estrutura de Relacionamento Individual neurônios corticais

Summary

Para entender a estrutura das redes neuronais, caracterização funcional e morfológica de neurônios individuais é uma necessidade. Aqui, nós demonstramos rotulagem juxtasomal biocitina, que permite que registros eletrofisiológicos na configuração extracelular, mas mantendo a capacidade de rotular intracelular do neurônio para a reconstrução post hoc de dendrítica e arquitetura axonal.

Abstract

O córtex cerebral é caracterizada por múltiplas camadas e muitos tipos de células distintas que em conjunto, como uma rede de responsáveis ​​por várias funções cognitivas superiores, incluindo a tomada de decisões, o comportamento sensório-guiada ou memória. Para entender como essas redes neuronais complexas executar tais tarefas, um passo crucial é determinar a função (ou atividade elétrica) de tipos de células individuais dentro da rede, preferencialmente quando o animal está realizando uma tarefa cognitiva relevante. Além disso, é igualmente importante para determinar a estrutura anatômica da rede e da arquitetura morfológica dos neurônios individuais para permitir a engenharia reversa da rede cortical. Avanços técnicos disponíveis hoje permitem gravar a atividade celular em acordada, comportando animais com a valiosa opção de post hoc identificar os neurônios registrados. Aqui, nós demonstrar a técnica de rotulagem juxtasomal biocitina, que envolve a ação de gravação potenciômetroal spiking na configuração extracelular (ou solta-patch) usando pipetas de patch convencionais. A configuração de gravação juxtasomal é relativamente estável e aplicável em condições comportamentais, incluindo anestesiado, sedado, acordado fixo-cabeça, e até mesmo no animal se movendo livremente. Assim, este método permite que liga tipo de célula ação específica potencial spiking durante comportamento animal para a reconstrução dos neurônios individuais e, em última análise, todo o microcircuito cortical. Neste vídeo manuscrito, vamos mostrar como os neurônios individuais na configuração juxtasomal pode ser rotulado com biocitina em ratos anestesiados com uretano para identificação post hoc e reconstrução morfológica.

Introduction

As redes neurais consistem em vários tipos de células, caracterizado por as propriedades morfológicas e fisiológicas altamente específicos ^1-7. Como consequência, os tipos de células individuais de realizar tarefas especializadas no seio da rede (ver, por exemplo Gentet et al. ⁸ e Burgalossi et al. ^9). Estamos apenas começando a entender as funções específicas do tipo de célula através de redes neuronais e muito ainda está para ser descoberto. Para este fim, muitos laboratórios são adoptar abordagens experimentais que permitem a análise de propriedades morfológicas da mesma população neuronal do que os parâmetros fisiológicos foram obtidos ^1,10-15. Aqui, demonstramos o juxtasomal técnica de marcação, que envolve ^16,17 registos electrofisiolicos utilizando pipetas de patch convencionais na configuração extracelular (assim não invasiva) em combinação com a electroporação do neurónio gravado com biocitina. Ogrande vantagem desta abordagem é que a natureza não invasiva assegura que a acção potencial cravação de neurónios individuais é gravado sem alterar (por exemplo, diálise) o conteúdo intracelular da célula. Seguido por eletroporação, a abordagem juxtasomal oferece a opção de identificação post hoc celular e reconstrução de ligação de função (fisiologia) para estrutura (morfologia). Normalmente, a reconstrução morfológica envolve a reconstrução da morfologia dendrítica e axonal, que pode ser estendido para quantificação da coluna e / ou Bouton densidades ou mesmo reconstrução da morfologia neuronal com resolução nanométrica usando microscopia eletrônica. A técnica de gravação juxtasomal pode ser usado para in vivo gravações de vários tipos de células em todo camadas corticais ou em áreas sub-corticais em uma variedade de espécies, embora a maioria dos estudos têm aplicado a técnica em pequenos roedores, como camundongos ou ratos. Nossa pesquisa está focada na gravação e rotulagem de neurôniosde rato córtex somatossensorial primário (S1) e envolve a identificação visual de neurônios registrados ^18, reconstruções dendríticas, em combinação com o registro preciso de um quadro de referência padronizada para fazer engenharia reversa de redes corticais ^4,19 e reconstrução detalhada da arquitetura axonal caracterizar tipo específico de células locais e projeção de longo alcance como alvo ^20.

Comparado com in vivo as técnicas de gravação alternativos (intracelulares ou de células inteiras), as gravações juxtasomal são relativamente estáveis ​​e, portanto, pode ser aplicado em estados comportamentais incluindo anestesiados ^21,22, sedado ^{14, 23} animais fixo-cabeça, ou mesmo livremente em movimento acordado ⁹ . Aqui, vamos mostrar rotulagem juxtasomal em S1 de um rato anestesiado-uretano, embora ressaltamos a aplicabilidade geral desta técnica para muitas preparações de escolha.

Protocol

1. Preparação do animal

Todos os procedimentos experimentais são realizados de acordo com a lei holandesa e após avaliação por um comitê de ética local no VU University Amsterdam, Holanda.

1. Anestesiar uma ratazana Wistar (P25-P45, ♂ / ♀) com isoflurano (2-3% em oxigénio) e, subsequentemente, com uretano (20% em 0,9% de NaCl, 1,6-1,7 g / kg) por injecção intraperitoneal. Avaliar a profundidade da anestesia, monitorando retirada pitada, reflexos das pálpebras, e os movimentos de vibrissas.
2. Administrar uma dose adicional de uretano (10% da dose inicial) no caso de o animal não chega a profundidade da anestesia suficiente ou quando espasmos vibrissas são observadas durante o curso da experiência.
3. Colocar o animal anestesiado na armação estereotáxica equipado com uma almofada de aquecimento, inserir sonda de temperatura rectal e manter a temperatura do corpo do animal, a 37,5 ± 0,5 ° C por uma almofada de aquecimento.
4. Posicione a cabeça do animal no quadro estereotáxico; cortar o cabelo no topo da cabeça com uma tesoura para tornar a pele visível.
5. Injectar 100 ul de 1% de lidocaína (em NaCl a 0,9%) por via subcutânea para a anestesia local no sítio da operação e esperar 3-5 min. Remover a pele que cobre a superfície do crânio por corte na direcção caudal para rostral e limpar o tecido restante.
6. Limpe o crânio extensivamente com NaCl 0,9% e compressas absorventes.
7. Determinar as coordenadas da área do alvo no hemisfério esquerdo (para o córtex somatossensorial primário (S1): 2.5 mm posterior e 5,5 mm lateral ao bregma). Marque a localização no crânio com uma caneta marcador pele cirúrgico.
8. Raspe suavemente o osso por uma broca de dentista da região de interesse até o osso torna-se transparente e os vasos sanguíneos são claramente visíveis.
9. Fazer uma 0,5 mm x 0,5 milímetros craniotomia por corte de uma janela no crânio diluído com um bisturi (# 11), evitando danos à dura-mátere os vasos sanguíneos. Opcional: marcar as bordas da craniotomia usando uma caneta marcador cirúrgico da pele para melhorar a visibilidade.
10. Aplicar uma fina camada de supercola sobre o crânio seco e, em seguida, cimento dental para construir uma casa de banho (ou seja, câmara de registo) que envolve a craniotomia.
11. Aparar os bigodes no lado contralateral a exatamente 5 mm da folículo triz. Opcional: destacar os bigodes aparados com rímel preto.

2. Juxtasomal Recordings e biocitina Labeling

1. Faça pipetas pedaço de vidro de borosilicato com diâmetro de ponta dentro de ~ 1 mícron obter eletrodos com 3-5 resistência mohms. Nota: A morfologia pipeta ideal para a gravação juxtasomal é um afunilamento gradual delgado, um baixo ângulo de cone, e um ~ 1 um ponta (Figura 1).
2. Dependendo da profundidade de gravação (com respeito à superfície pial), as dimensões do atarraxamento do eléctrodo de registo deve ser ajustado. Criticamente importante é que tele cone diâmetro deve ser inferior a 75 um do ponto de entrada no cérebro para evitar danos mecânicos ou tensão para a área de gravação. Isto indica que para as gravações corticais superficiais, um cone de 300-500 um, com um diâmetro exterior de máximo 75 um é requerido (Figura 1A) enquanto que as gravações de camadas corticais profundas relativamente requerem um maior afunilamento de 1.500-1.800 mM, novamente com exterior máxima diâmetro de 75 mM (a 1.800 mM a partir da ponta do eletrodo).
3. Carregar a pipeta patch com campainha normal de rato (NRR) suplementado com 2% de biocitina (ver Tabela 1 para as soluções e reagentes) e montar a pipeta patch em um estágio cabeça fixa a um micromanipulador.
4. Definir o ângulo de suporte de eléctrodo a 34 ° em relação ao plano sagital para alvejar especificamente a coluna D2 de S1 rato.
5. Conecte o palco cabeça a um amplificador em modo bridge (ou seja, grampo atual).
6. Posicione o patchpipeta em estreita proximidade com a craniotomia. Encha a banheira com 0,9% de NaCl e determinar a resistência do eletrodo que deve ser entre 3-5 mohms, avaliada pela aplicação de um pulso quadrado com injeção de corrente positiva (1 nA, 200 ms on / off).
7. Estabelecer sobrepressão de 100-150 mbar e avançar a pipeta patch no 1 mícron passos durante a aplicação corrente positiva como pulsos quadrados (1 NA, 200 ms on / off). Monitorar a mudança de resistência robusto ao estabelecer contato com a dura-máter. Neste ponto, definir as coordenadas do micromanipulador de "zero" para permitir que as medições de profundidade precisas.
8. Avanço em 1 mícron passo-mode até a pipeta de patch penetra na dura-máter indicado por uma queda súbita na resistência do eletrodo. Retire a pressão realização da pipeta.
9. Procure por unidades individuais, enquanto avançam em 1 mM passos. Monitorar a resistência do eletrodo de forma contínua através da aplicação de 200 ms on / off pulsos. Um aumento no Neossolo resistência do eletrodoaliado indica a proximidade de um único neurónio. Avance até o eletrodo potencial de ação positiva (AP) formas de onda de ~ 2 mV são registradas (Figuras 2A e 2B).
10. Opcional: Grave o padrão spiking espontânea do neurônio e determinar spiking, por exemplo, caudal desviando bigodes individuais para 200 milissegundos em um ângulo de 3,3 ° usando um dispositivo piezoelétrico ¹⁸ evocava-triz.
11. Avançar o eletrodo até que a resistência é de 25-35 mohms e spikes têm amplitudes de 3-8 mV para a obtenção de condições ótimas de enchimento juxtasomal. Inicie o preenchimento juxtasomal aplicando pulsos quadrados de corrente positiva (1 nA, 200 ms on / off). Lentamente e gradualmente aumentar a corrente em passos de 0,1 nA enquanto se monitoriza a forma de onda de AP e de frequência (Figuras 2A e 2B).
12. Monitorar a abertura da membrana como um claro aumento na freqüência de AP durante a fase do pulso em bloco (Figura 2C ). A forma de onda de pico durante o enchimento mostra uma largura aumentada e reduzida após-hiperpolarização (Figuras 2C e 2D). Os parâmetros adicionais incluem aumento de ruído ou um pequeno (1-5 mV) mudança negativa DC.
13. Aumentar ou diminuir a corrente (1 nA) ao preencher a manter infusão biocitina estável. Reduzir ou parar os pulsos de corrente em cima súbito aumento da freqüência de AP para evitar toxicidade por excesso de influxo de íons extracelulares, tais como íons de sódio. Nota: cada neurônio respondem de forma diferente à injeção de corrente e juxtasomal parâmetros de rotulagem precisa ser ajustada dependendo das condições de gravação individuais.
14. Acompanhar de perto o sinal após a interrupção da injeção de corrente. A forma de onda de pico depois de uma sessão de enchimento é geralmente ampliado e mostra uma forte redução após hiperpolarização. Espere para a recuperação do neurônio, que é aparente quando a forma de onda de pico retorna às suas propriedades originais (ou seja, presença denormal após-hiperpolarização, Figura 2).
15. Repita biocitina enchendo sessões após a recuperação completa do neurônio para aumentar a carga biocitina para a melhoria da qualidade de coloração.
16. Recolha a pipeta patch passos de 1 mM até que a amplitude do pico diminui para reduzir qualquer tensão mecânica para a célula. Espere pelo menos 1 hora para o biocitina para difundir no meio intracelular, enquanto monitorando de perto a temperatura do corpo do animal e respirar.

3. Irrigando o animal e retirar o cérebro

1. Preparar a configuração da perfusão, enxágüe e pré-carregar os tubos com 0,9% de NaCl.
2. Coloque o animal em uma bandeja cirúrgica e prenda com fita rotulagem padrão. Assegurar profundidade suficiente da anestesia; pitada pé e reflexos palpebrais deve estar ausente.
3. Faça uma incisão medial para lateral (5-6 cm) através da parede abdominal logo abaixo da caixa torácica e proceder em sentido póstero-anterior para expor o esterno.Puxe o esterno anteriormente e separe cuidadosamente o fígado a partir do diafragma.
4. Fazer uma pequena incisão no diafragma, cortar as nervuras inferiores e continuar a incisão ao longo de todo o comprimento da cavidade abdominal para expor o coração.
5. Retire o pericárdio.
6. Insira a agulha para o ventrículo esquerdo e fazer uma incisão no átrio direito. Perfundir com 0,9% de NaCl (~ 8 ml / min) até descoloração do fígado é completa.
7. Mudar a infusão de 4% paraformaldeído (PFA), até que a rigidez da frente pata e maxilar inferior é aparente.
8. Decapitar rato usando um par de tesouras
9. Retire os músculos do pescoço restantes e expor o crânio completamente.
10. Posicione a tesoura no tronco cerebral no lado dorsal e cortar o osso cuidadosamente ao longo da sutura sagital, mantendo a posição dorsal.
11. Retirar os ossos de ambos os lados da sutura sagital para expor o cérebro, utilizando um fórceps. Remova cuidadosamente a dura para evitar dAmage.
12. Insira com cuidado uma espátula sem corte para o lado ventral do cérebro e remover o cérebro suavemente.
13. Pós-corrigir toda a noite cérebro em PFA a 4 ° C. Desligue o cérebro para tampão fosfato 0,05 M (PB) e armazenar a 4 ° C.

4. Fatiar o cérebro em seções tangenciais

1. Pegue o cérebro fora do 0,05 M PB e colocá-lo em um papel de filtro enfrentando anterior. Use uma lâmina afiada para cortar o cerebelo ao longo do plano coronal e separar os hemisférios através do corte ao longo do plano sagital médio.
2. Aplicar supercola na plataforma de montagem e montar o hemisfério esquerdo do seu plano sagital com anterior virado para a direita. Fixe a plataforma de montagem em um ângulo de 45 ° em um vibratome e submergir o cérebro em 0,05 M PB.
3. Prenda uma lâmina de barbear no vibratome e certifique-se que o primeiro contato com a superfície do cérebro está no meio do avião ântero-posterior do hemisfério. Corte de 24 100 pmseções e coletá-los em uma placa de 24 poços contendo 0,05 M PB.

5. Procedimentos histológicos

1. Realizar protocolos histológicos para a coloração do citocromo-oxidase e ²⁴ a-biotina-peroxidase de avidina método de acordo com os métodos anteriormente descritos ^25. Opcional: visualizar biocitina usando conjugados fluorescentes avidina / estreptavidina-Alexa. Este adicionalmente permite-coloração dupla com técnicas de rastreamento retrógrado ou anterógrado.
2. Lavar as secções de 5 x 5 minutos com 0,05 M PB e preparar o tetracloridrato de 3, 3'--diaminobenzidina (DAB) de solução para a coloração de citocromo-oxidase para visualizar barris na camada 4 (L4) de S1 contendo (ver Tabela 2 para soluções e reagentes). Incubar secções 6-12 do pia na solução pré-aquecida para 30-45 min a 37 ° C.
3. Enxágüe seções com 0,05 M PB por 6 x 5 min e saciar a atividade da peroxidase endógena pela incubação todas as seções em 3% H ₂ O ₂ em 0,05 M PB, durante 20 minutos à temperatura ambiente (RT).
4. Enxágüe seções com 0,05 M PB por 5 x 10 min. Incubar em secções ABC-solução (ver Tabela 3 para as soluções e os reagentes) durante a noite a 4 ° C.
5. Enxágüe seções com 0,05 M PB por 5 x 10 min e preparar a solução DAB para visualizar o neurônio cheio de biocitina (ver Tabela 4 para soluções e reagentes). Incubar secções em solução filtrada por 45-60 minutos à temperatura ambiente.
6. Enxágüe seções com 0,05 M PB por 5 x 10 min. Seções montar em lâminas de microscópio e lamínula com Mowiol (ver Tabela 5 para soluções e reagentes).
7. Determine qualidade rotulagem usando microscopia de luz.

Results

O conhecimento detalhado sobre a estrutura 3D de neurônios individuais é crucial para elucidar os princípios organizacionais das redes neuronais. Nosso método consiste em um gasoduto para alcançar rotulagem biocitina alta qualidade a partir de uma preparação in vivo, permitindo assim a classificação post hoc neuronal e reconstrução detalhada do dendrítica e arquitetura axonal de neurônios individuais em alta resolução. Dependendo da qualidade da rotulagem juxtasomal, os neurónios são recuperadas com di...

Discussion

O método permite a gravação de juxtasomal em ação vivo potencial spiking de unidades individuais de todo condições comportamentais (anestesiados, acordado ou se movendo livremente fixo-cabeça) com a opção do neurônio gravado para hoc classificação pós tipo de célula e / ou reconstrução 3D-rotulando biocitina. A principal vantagem é a obtenção de parâmetros fisiológicos na configuração extracelular (assim não invasiva), sendo ainda capaz de marcar o neurónio intracelularmente com bioci...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema de controle SM-6	Luigs Neumann
LN- Mini 23 XYZ
LN- Mini 55 Manipulatorblock X2
Amplificador Lynx-8	Neuralynx
Amplificador Axoclamp-2B	Axon Instruments
Osada modelo EXL-M40	Osada, Inc.
Dispositivo piezoelétrico	Physik Instrumente	PL140.10
LabView	National Instruments, Austin, TX, USA		Software de aquisição
LabView Ntrode Virtual Instrument	R. Bruno, Columbia Univ., NY
Sugi cotonetes absorventes	Kettenbach	30601
Citocromo C do coração equino	Sigma	C2506
Catalase do fígado bovino	Sigma	C9322
DAB	Sigma	D5637
H2O2	Boom	7047
Vectastain padrão ABC-kit	Vector	PK6100
Triton X100	Sigma	T9284
Uretano	Sigma	U2500
Isoflurano	Pharmachemie	45.112.110
Lidocaína	Sigma	L5647
Simples rápido cimento dental	Kemdent	ACR308 / ACR924
Biocitina	Molekula	36219518
PFA	Merck Millipore	8187151000
Trizma base	Sigma	T4661
Mowiol 4-88	Aldrich	81381
Glicerol de grau analítico	Fluka	49767
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma Aldrich	31434
KCl	Sigma Aldrich	60130
CaCl	Sigma Aldrich	22,350-6
MgCl2	Fluka	63072