Para entender a estrutura das redes neuronais, caracterização funcional e morfológica de neurônios individuais é uma necessidade. Aqui, nós demonstramos rotulagem juxtasomal biocitina, que permite que registros eletrofisiológicos na configuração extracelular, mas mantendo a capacidade de rotular intracelular do neurônio para a reconstrução post hoc de dendrítica e arquitetura axonal.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Juxtasomal biocitina Labeling para estudar a função Estrutura de Relacionamento Individual neurônios corticais
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O córtex cerebral é caracterizada por múltiplas camadas e muitos tipos de células distintas que em conjunto, como uma rede de responsáveis por várias funções cognitivas superiores, incluindo a tomada de decisões, o comportamento sensório-guiada ou memória. Para entender como essas redes neuronais complexas executar tais tarefas, um passo crucial é determinar a função (ou atividade elétrica) de tipos de células individuais dentro da rede, preferencialmente quando o animal está realizando uma tarefa cognitiva relevante. Além disso, é igualmente importante para determinar a estrutura anatômica da rede e da arquitetura morfológica dos neurônios individuais para permitir a engenharia reversa da rede cortical. Avanços técnicos disponíveis hoje permitem gravar a atividade celular em acordada, comportando animais com a valiosa opção de post hoc identificar os neurônios registrados. Aqui, nós demonstrar a técnica de rotulagem juxtasomal biocitina, que envolve a ação de gravação potenciômetroal spiking na configuração extracelular (ou solta-patch) usando pipetas de patch convencionais. A configuração de gravação juxtasomal é relativamente estável e aplicável em condições comportamentais, incluindo anestesiado, sedado, acordado fixo-cabeça, e até mesmo no animal se movendo livremente. Assim, este método permite que liga tipo de célula ação específica potencial spiking durante comportamento animal para a reconstrução dos neurônios individuais e, em última análise, todo o microcircuito cortical. Neste vídeo manuscrito, vamos mostrar como os neurônios individuais na configuração juxtasomal pode ser rotulado com biocitina em ratos anestesiados com uretano para identificação post hoc e reconstrução morfológica.
Introdução
As redes neurais consistem em vários tipos de células, caracterizado por as propriedades morfológicas e fisiológicas altamente específicos 1-7. Como consequência, os tipos de células individuais de realizar tarefas especializadas no seio da rede (ver, por exemplo Gentet et al. 8 e Burgalossi et al. 9). Estamos apenas começando a entender as funções específicas do tipo de célula através de redes neuronais e muito ainda está para ser descoberto. Para este fim, muitos laboratórios são adoptar abordagens experimentais que permitem a análise de propriedades morfológicas da mesma população neuronal do que os parâmetros fis....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Preparação do animal
Todos os procedimentos experimentais são realizados de acordo com a lei holandesa e após avaliação por um comitê de ética local no VU University Amsterdam, Holanda.
- Anestesiar uma ratazana Wistar (P25-P45, ♂ / ♀) com isoflurano (2-3% em oxigénio) e, subsequentemente, com uretano (20% em 0,9% de NaCl, 1,6-1,7 g / kg) por injecção intraperitoneal. Avaliar a profundidade da anestesia, monitorando retirada pitada, reflexos das pálpebras, e os movimentos de vibrissas.
- Administrar uma dose adicional de uretano (10% da dose inicial) no caso de o animal não chega a profundidade da anestesia suficiente ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
O conhecimento detalhado sobre a estrutura 3D de neurônios individuais é crucial para elucidar os princípios organizacionais das redes neuronais. Nosso método consiste em um gasoduto para alcançar rotulagem biocitina alta qualidade a partir de uma preparação in vivo, permitindo assim a classificação post hoc neuronal e reconstrução detalhada do dendrítica e arquitetura axonal de neurônios individuais em alta resolução. Dependendo da qualidade da rotulagem juxtasomal, os neurónios são recuperadas com di.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O método permite a gravação de juxtasomal em ação vivo potencial spiking de unidades individuais de todo condições comportamentais (anestesiados, acordado ou se movendo livremente fixo-cabeça) com a opção do neurônio gravado para hoc classificação pós tipo de célula e / ou reconstrução 3D-rotulando biocitina. A principal vantagem é a obtenção de parâmetros fisiológicos na configuração extracelular (assim não invasiva), sendo ainda capaz de marcar o neurónio intracelularmente com bioci.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os authros tem nada a revelar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer aos Profs. Huibert Mansvelder e Bert Sakmann para amplo suporte, Dr. Marcel Oberlaender para discussões frutíferas e proporcionando rastreamento neuronal, e Brendan Lodder para assistência técnica. Os dados foram adquiridos utilizando o ntrode VI para LabVIEW, generosamente fornecidos pela R. de Bruno (Columbia Univ., NY, EUA). Esta pesquisa foi apoiada pela Max Planck Society e do Centro Bernstein de Neurociência Computacional, Tuebingen (financiado pelo Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa (BMBF; FKZ: 01GQ1002)) (RTN), Centro de Pesquisa e Neurogenomics Cognitiva (CNCR) , Neuroscience Campus Amsterdam (NCA), o financiamento para....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sistema de controle SM-6 | Luigs Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Amplificador Lynx-8 | Neuralynx | ||
| Amplificador Axoclamp-2B | Axon Instruments | ||
| Osada modelo EXL-M40 | Osada, Inc. | ||
| Dispositivo piezoelétrico | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| LabView | National Instruments, Austin, TX, USA | Software de aquisição | |
| LabView Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY | ||
| Sugi cotonetes absorventes | Kettenbach | 30601 | |
| Citocromo C do coração equino | Sigma | C2506 | |
| Catalase do fígado bovino | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain padrão ABC-kit | Vector | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Uretano | Sigma | U2500 | |
| Isoflurano | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaína | Sigma | L5647 | |
| Simples rápido cimento dental | Kemdent | ACR308 / ACR924 | |
| Biocitina | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| Glicerol de grau analítico | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
Referências
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
