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Artigo de método

Coloração histoquímica de

42.2K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/51381

⸱

13 de maio de 2014

 , 
1Feedstocks Division, Joint Bioenergy Institute, 2Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

Neste artigo

Resumo

A composição da parede celular vegetal varia entre os tipos de tecido e pode incluir lignina, celulose, hemiceluloses e pectina. Várias técnicas de coloração foram desenvolvidas para visualizar as diferenças no nível do tipo de célula. Este artigo é uma compilação de técnicas de coloração da parede celular comumente usadas.

Resumo

Arabidopsis thaliana é um organismo modelo comumente usado para entender e manipular vários processos celulares em plantas, e tem sido amplamente utilizado no estudo da formação de paredes celulares secundárias. A deposição da parede celular secundária ocorre após a fixação da parede celular primária, um processo realizado exclusivamente por células especializadas, como as que formam vasos e tecidos fibrosos. A maioria das paredes celulares secundárias é composta de celulose (40-50%), hemicelulose (25-30%) e lignina (20-30%). Várias mutações que afetam a biossíntese da parede celular secundária foram isoladas, e os mutantes correspondentes podem ou não exibir mudanças óbvias na composição bioquímica ou fenótipos visuais, uma vez que essas mutações podem ser mascaradas por respostas compensatórias. Os procedimentos de coloração têm sido historicamente usados para mostrar diferenças em uma base celular. Esses métodos são meios exclusivamente visuais de análise; no entanto, seu papel na análise rápida e crítica é de grande importância. O vermelho Congo e o branco calcofluor são corantes usados para detectar polissacarídeos, enquanto o Mäule e o floroglucinol são comumente usados para determinar diferenças na lignina, e o azul de toluidina O é usado para corar diferencialmente polissacarídeos e lignina. As técnicas aparentemente simples de seccionamento, coloração e imagem podem ser um desafio para iniciantes. Começando com a preparação de amostras usando o modelo de A. thaliana, este estudo detalha os protocolos de uma variedade de metodologias de coloração que podem ser facilmente implementadas para observação da organização celular e tecidual nas paredes celulares secundárias das plantas.

Introdução

A parede celular da planta tem uma infinidade de informações dentro de seus vários componentes: lignina, celulose, hemicelulose (xilana, glucuronoxylan, xiloglucano, arabinoxilano, ligação mista glucana, ou glucomanana) e pectina. Técnicas histológicas fornecer dicas visuais importantes no estudo das diferenças dentro das paredes celulares secundárias a nível da organização e celulares. Várias técnicas histológicas foram desenvolvidos e podem ser encontrados na literatura, mas estas técnicas pode ser um desafio para principiantes e demorada porque os protocolos muito detalhado com instruções visuais simples são raramente, se alguma vez disponível. O objetivo deste estudo é fornecer orientações simples para técnicas de coloração histológicas para obter imagens de alta qualidade.

Seccionamento do tecido do tronco é o primeiro passo para a visualização de células e paredes celulares de formas. Embora seções cortados à mão são baratos e levam menos tempo para se preparar, o uso de um vibratome oferece consistência eproduz imagens de alta qualidade. Usando um vibratome permite produzir melhor qualidade de dados, gerando até secções com a mesma espessura, o que ajuda a produzir imagens nítidas e reduz significativamente o risco de produzir diferenças entre amostras imprecisos que seria simplesmente causada por uma preparação de amostra mau. Usando resinas para fixar espécimes frescos pode ser um desafio para iniciantes e ainda pode ser demorado, mesmo para especialistas, quando uma análise precisa ser feito rapidamente. Além disso, torna-se impossível de medir qualquer actividade biológica com a amostra quando tiver sido incorporado numa resina. Uma técnica simples que emprega um molde de agarose e caseiro é útil para a incorporação de tecidos do caule, e que também pode ser utilizado em outras aplicações que requerem uma dissecção de tecidos moles. Em comparação com a incorporação de espécimes em resina, este método tem a vantagem de manter os tecidos vivos e reduzindo a manipulação da amostra. Seccionamento dos tecidos por meio de um vibratome é altamente preciso e gera homogeneaous secções, que, dependendo do objectivo do estudo, poderá, então, ser usados ​​com várias técnicas de coloração diferentes.

Os métodos mais simples de visualizar lignina e outros compostos aromáticos empregar ultravioleta (UV). Excitação de moléculas aromáticas à base de luz UV é uma técnica antiga, mas ainda é uma das abordagens mais rápido para visualização de lignina. No entanto, a visualização UV na verdade não é ideal para a detecção de lignina porque a luz UV vão animar outros compostos aromáticos. A lignina é composta basicamente de três blocos de construção, as monolignóis (álcoois hidroxicinamil: álcool coniferil, álcool sinapyl e álcool p-cumaril) 1-3. Floroglucinol mancha pode proporcionar pistas para a extensão da cinnamaldehydes presentes no xilema, fibras e tecidos da traqueia 4. Floroglucinol é um bom indicador de cinnamaldehydes gerais e pode diferenciar entre cinnamaldehydes e outros aromáticos. Os monómeros de álcool sinapyl pode ser detectadae diferenciando-se pelo uso de Maule mancha. Azul de toluidina O é um corante policromático e, portanto, tem a capacidade de manchar os diferentes elementos da parede celular em diferentes cores 5,6. O principal uso do azul de toluidina O é detectar pectina e lignina 5,6. A vantagem do uso de azul de toluidina O é que muitos elementos da parede da célula pode ser visualizado num único passo. Ambos calcoflúor branco e vermelho congo são fáceis de trabalhar e pode ser usado para visualizar celulose. Calcofluor manchas brancas celulose, calose, e outros β-glucanas não-substituídos ou substituídos fracamente 6-9, ao passo que congo manchas vermelhas directamente para β-(1 → 4)-glucanos e em particular a celulose 10,11. O objetivo deste estudo é fornecer orientações simples para o uso das técnicas de coloração acima mencionados para obter imagens de alta qualidade a partir de A. thaliana hastes.

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Protocolo

1. Tronco Embedding

  1. Adicione uma solução de agarose a 7% em água (7 g de agarose de electroforese em série, em 100 ml de água destilada). Dissolve-se a agarose por autoclavagem durante 20 minutos ou por microondas durante 20 minutos à menor intensidade (por exemplo, intensidade de 10% de um forno de microondas de 1.250 watts).
  2. Prepare um molde caseiro para a incorporação das hastes utilizando frascos de plástico.
    1. Usando uma lâmina de barbear, cortar o fundo cônico de 2 ml com tampa de rosca tubo de microcentrífuga (Parte A). Com uma agulha de seringa, perfurar um furo na tampa do tubo um pouco maior do que o diâmetro da haste para ser incorporado. Em seguida, corte de 0,5 cm da parte inferior de um tubo de microcentrífuga de 0,6 ml (Parte B).
    2. Adicionar a 0,5 centímetros parte de corte do tubo de microcentrífuga de 0,6 ml para o tubo de microcentrífuga ml pré-cortados 2. Selar as duas peças usando Parafilm (Figura 1). NOTA: A parte inferior do tubo é cortada para facilitar a remoção da amostra após o embutido de agarose foi solidificada. Tele furo na tampa vai ajudar na realização do tronco estável quando a haste é incorporado em agarose. O molde servirá para manter a agarose e mantenha o tronco reto ao incorporar. O Parafilm irá segurar as duas partes, A e B, até a agarose é ajustado e a haste é incorporado.
    3. Usando uma lâmina de barbear, uma secção de corte da haste a partir da área de interesse (por exemplo, meio da primeira haste de entrenós). NOTA: O ideal é que o caule deve ser cortado pouco antes embutir para evitar a destruição por desidratação. Alternativamente, a haste pode ser temporariamente armazenados numa placa contendo um filtro de papel humedecido com água. Esta placa pode ser colocada em gelo até estar pronto para ser incorporado para evitar a desidratação dos tecidos e deformação. Armazenar a haste por períodos superiores a 30 minutos, sem alta umidade fará com que o tronco para secar.
  3. Derreter a agarose no micro-ondas a partir da intensidade. CUIDADO: O frasco contendo agarose pode estar quente. Use uma luva para pegar a garrafa. Deixe os derretidos s de agarosetand à temperatura ambiente (entre 20 ° C e 25 ° C) até que se arrefece para cerca de 50 ° C.
  4. Pipeta-se lentamente 5 ml de agarose para o molde plástico premade para encher o frasco. NOTA: Certifique-se que não há bolhas de ar nos moldes. As bolhas de ar fará com que as lacunas no molde agarose e não cobrir completamente a amostra-tronco, o que acabará por levar a corte desigual das seções de amostra.
    1. Deixe a agarose arrefecer durante 30 a 60 segundos para se tornar semi-sólido. Teste com um pequeno palito, certificando-se de que ele pode penetrar e ficar de pé, mas não flutuar, na agarose. NOTA: Se a haste é colocada quando o agarose ainda está quente ele irá danificar a amostra por murchamento do caule, destruindo a morfologia celular.
    2. Coloque a haste nesse frasco encheu-agarose. Certifique-se de que a haste fica em linha reta. Coloque a tampa perfurada, de tal maneira que a ponta da haste é mantida pela tampa. Não rode a tampa de rosca. Algum tempo mais do que uma haste (de um único tipo) pode ser embedded em um único frasco; mas, nesse caso particular, não use o cap. NOTA: Se a tampa de rosca é ligado, a haste vai ter torcida.
  5. Deixar o frasco à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante 10-30 minutos, até que se solidifica.
  6. Retire o molde suavemente deslizando-a para fora do tubo. Abra o Parafilm. Empurre a parte inferior da parte B do molde suavemente com o polegar para libertar a agarose solidificado da parte A para uma lâmina de microscópio de vidro.
  7. Cortar a haste embutida de agarose em três partes aproximadamente iguais de 1,2 cm de comprimento. Cortar a parte do tronco que não estava no agarose e descartá-lo.
    1. Guarde estas peças de agarose com o embutido deriva em hermético 2 ml microtubos em uma caixa de luz, a 4 ° C até que esteja pronto para a seção. Alternativamente, os tubos de armazenar a 4 ° C durante um máximo de uma semana. NOTA: O armazenamento é possível, mas o pesquisador precisa estar ciente de que o incorporado decorre ainda estão vivos e, dependendo do experimento, Artefactos poderia potencialmente ser introduzido.

2. Stem Seccionamento

  1. ATENÇÃO: Leia o manual vibratome com atenção e siga todas as instruções de segurança.
  2. Verifique se o disco de amostra é limpa e completamente seca (livre de qualquer sólido ou líquido). Limpe o disco de amostra com uma lâmina de barbear para remover qualquer cola residual a partir de experiências anteriores e lavar com água. Em seguida, seque com toalha de papel. Nota: Isto irá assegurar que o adesivo funciona bem e se liga à amostra de agarose. Se este passo não é feito adequadamente, é possível que os espécimes não podem aderir ao disco e, mais tarde, fazer com que a amostra cair do disco durante o corte.
    1. Use papel macio limpa para remover qualquer umidade do bloco de agarose contendo os espécimes.
    2. Colocar uma pequena gota de cola de tecido sobre o disco de amostra. Expelido do adesivo para cobrir a área no centro do prato utilizando a ponta da garrafa adesiva. Rapidamente lugaro bloco de agarose de modo que as amostras são ou perpendicular ou em paralelo com a placa durante transversal ou cortes transversais longitudinais, respectivamente. Permitir que o adesivo para fixar a amostra para o disco de amostra à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante 10-30 min. NOTA: Este é um passo sensível ao tempo.
  3. Fixe o disco de amostra no lugar em bandeja de tampão ou cocho. Os blocos de agarose / s com as secções devem estar em paralelo com a lâmina de barbear. Encher o tabuleiro de tampão com água destilada à temperatura ambiente até que as amostras são totalmente submerso.
  4. Corte uma lâmina de barbear ao meio e, em seguida, apare as pontas com uma tesoura resistente para que a lâmina fica completamente plana. Fixe a metade da lâmina de barbear pré-cortados no suporte a faca.
    1. Defina o ângulo do suporte da faca para 84 °, a velocidade a 0,90 mm / seg (posição 8 na vibratome) e freqüência de 50 Hz (posição 5 no vibratome). Corte seções de espessura 100 m. Use o modo contínuo. NÃOTE: Esta espessura foi seleccionada para assegurar que o tecido pode suportar os vários tratamentos ácido e base utilizados em alguns dos protocolos de coloração. Defina a janela de corte e permitir 15-20 minutos em um modo contínuo para o vibratome a seção de um bloco de agarose de aproximadamente 1,2 cm.
  5. Recolha as seções com uma pipeta de plástico descartável durante o corte na bandeja do buffer. Em alternativa, as secções podem ser transferidos a partir da bandeja do tampão para uma proveta de vidro e, em seguida, para uma placa de Petri claro. Transferir algumas seções para os 2,0 ml microtubos. Nota: As amostras são coletadas a partir de uma placa de Petri, porque é mais fácil de ver as seções sobre um fundo claro, e porque bandeja de tampão pode ser preparada para os próximos espécime.
  6. As secções podem ser armazenadas em um tubo de 50 ml ou recolhido e armazenado em tubos de 1,5 a 2 ml de microcentrífuga a 4 ° C durante 30 a 60 min. NOTA: Armazenar as seções por períodos mais longos irá resultar em má qualidade de imagem.

3. Microscópio e Camera Setting for Imaging

  1. Ajustar a iluminação Koehler no microscópio. Escolha um objetivo. Concentre-se na amostra em primeiro lugar. Traga a intensidade da luz a um meio ou inferior. Feche o diafragma de campo (FD) e abertura (AP) ou trazê-lo para a configuração mais baixa possível nesse objetivo particular.
    1. Quanto maior for a ampliação, quanto maior for o anel será. Use o botão de focagem do condensador para focar as íris de campo tão nitidamente quanto possível.
    2. Lentamente trazer a imagem da íris de campo (pequeno anel em forma de hexágono) para o centro utilizando os botões de condensador-centralização (parafusos em forma de pino que cercam o condensador). Lentamente aumentar o diafragma (FD) de tal modo que a íris de campo atinge o limite. Pare de aumentar o FD logo após o campo íris passou a borda.
    3. Aumente lentamente a abertura (AP) para ajustar o contraste. Ajustar a intensidade da luz conforme requerido. NOTA: iluminação Koehler precisa ser ajustado para cada objective, cada dia experimental. Anote os números obtidos após o ajuste para o dia. Esses números serão reutilizados a cada vez que os objetivos são trocados frente e para trás para esse dia especial.
  2. Ajuste a abertura, intensidade, tempo de exposição, o ganho, e filtros como descrito na Tabela 1. Esta informação deve ser utilizada apenas como um guia.
  3. Use uma câmera digital de alta resolução com um grande chip CCD formato interline sem obturador mecânico para capturar imagens de fluorescência; e uma de alta resolução, câmera de alta velocidade para imagens brilhantes em campo.
  4. Processar os slides usando software padrão. Carregar o software. Clique em "Adquirir" e "Set câmera / cartão," em seguida, selecionar a câmera a ser utilizado. Clique em "OK". Clique em "Adquirir" seguido de "guia de cores." Under "guia Cor", escolha "método Bayer" seguido de "Média de quatro." Adicionar o ganho sugerido (vermelho, verde, azul) from Tabela 1. Selecione a opção "Definir salvar" e clique sobre o diretório onde as imagens devem ser armazenadas. Defina "tempo de exposição" a partir das sugestões da Tabela 1. Set "Binning" em "1" e "binning Live" em "1". Foco na região de interesse e clique em "Salvar ao vivo."
  5. Saída de imagens no software da câmera estão no formato "TIF". Analisar as imagens para histoquímica dos tipos de células. Use um software de computador padrão para utilizações a jusante de apresentação e publicação.

4. Ultravioleta e Bright-campo de imagem

  1. Usar uma pipeta de 1 ml, com o corte da ponta da pipeta, de modo que as secções podem ser pipetado para fora facilmente. Gentilmente seções pipeta na ponta e sobre a uma lâmina de microscópio. Cubra as seções com uma lamela. Observe as seções sob luz UV ou iluminação de campo claro.

5. Floroglucinol-HCl (Wiesner) Coloração 12

  1. Dissolve-se 0,3 g de f loroglucinol em 10 ml de etanol absoluto para se preparar uma solução de floroglucinol 3%. Misturar um volume de HCl concentrado (37 N) a dois volumes de 3% em etanol floroglucinol; esta solução é floroglucinol-HCl (pH-HCl) ou Wiesner mancha. NOTA: esta solução é para ser feito fresco no dia da coloração e não pode ser armazenada, porque a solução irá degradar ao longo do tempo e a coloração se tornará ineficaz. CUIDADO: HCl é altamente corrosivo, por isso tenha muito cuidado ao manusear a mancha Ph-HCl.
  2. Transferir secções tronco para um tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Adicionar 1 ml de solução de Ph-HCl ao tubo contendo as secções e cap imediatamente porque o HCl na mancha Ph-HCl é altamente corrosivo. Mova suavemente o tubo para garantir que todas as seções estão manchadas. Uma alternativa para esta etapa é a de manter a tampa aberta do tubo de modo que a solução de Ph-HCl pode ser pipetado para cima e para baixo, de preferência, sem perturbar o segções. NOTA: Tenha cuidado para não pipetar as seções na ponta da pipeta, pois isso pode danificar essas seções.
    1. Usar uma pipeta de 1 ml, com o corte da ponta da pipeta, de modo que as secções podem ser pipetado para fora facilmente sem danos. Pipeta suavemente seções na ponta e sobre uma lâmina de microscópio. Cubra as seções com tampa deslizante. Observe as seções sob iluminação de campo claro. Nota: A solução Ph-HCl seca em 5-10 min, causando uma deterioração dos espécimes. Portanto, a imagem tem de ser concluída dentro desse período de tempo.

6. Maule Coloração 13,14

  1. Dissolve-se 0,2 g de permanganato de potássio em 40 ml de água destilada para preparar uma solução de permanganato de potássio a 0,5%. Guarde em um frasco escuro à temperatura ambiente por um período máximo de 7 dias.
    1. Prepara-se uma solução de HCl a 3,7% pela adição de 1 ml de HCl concentrado (37 N) a 9 ml de água destilada (01:10). Prepara-se uma solução fresca de 3,7% de HCl nadia do experimento. Certifique-se de que a solução de HCl 37 N a ser utilizado não é muito antiga. Solução de hidróxido de amónio concentrado (14,8 M) deve ser armazenado a 4 ° C para evitar que a molaridade da solução saturada de diminuir.
  2. Transferir secções tronco para um tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Adicionar 1 ml de solução de permanganato de potássio a 0,5% para o tubo contendo as secções.
    1. Pipetar a solução de permanganato de potássio 0,5% para cima e para baixo com cuidado, de preferência, sem perturbar as seções. Incubar durante 2 minutos e repetir a pipetagem. Deixe o tubo de microcentrífuga de ficar até que todas as seções sossegar. NOTA: Tenha cuidado para não pipetar as seções na ponta da pipeta, como as seções pode ficar danificado. Pode ser difícil ver as seções de tronco como a solução é escuro, de modo a manter o tubo com as seções sobre rack de tubo de ensaio e permitir-lhes que se contentar com 2 min.
    2. Usando uma pipeta de 1 ml, tirar 700 ml de solução de permanganato de potássio 0,5%.Adicionar 700 mL de água destilada para lavar a solução de permanganato de potássio. Repita 3-4x ou até que a solução de água permanece clara.
    3. Descarte a água. Adicione rapidamente 1 ml de HCl 3% até que a cor marrom profundo é descarregada a partir das seções. Isso pode acontecer dentro de 3-5 min ou pode exigir duas lavagens de 5 min cada. Pipetar para fora toda a solução de HCl 3% e proceder de imediato para a próxima etapa.
    4. Adicionar 1 ml de solução de hidróxido de amónio concentrado. Usar uma pipeta de 1 ml, com o corte da ponta, de tal maneira que as secções podem ser pipetado para fora facilmente sem danos. Pipeta suavemente seções na ponta e sobre uma lâmina de microscópio. Cubra as seções com uma lamela. Observe as seções sob iluminação de campo claro. ATENÇÃO: Devido hidróxido de amônio é extremamente corrosivo, requer cuidado e atenção para evitar causar corrosão ao palco do microscópio ou lente. NOTA: Os vapores de hidróxido de amónio pode embaçar a lamela, tornando-se difícil de observar a amostra. Portanto cuidado extra antes de adicionar a lamela. A solução seca em 5-10 min, por isso a imagem tem de ser concluída dentro desse período de tempo.

7. Vermelho do Congo Coloração 11,15

  1. Dissolve-se 0,5 g de vermelho do Congo em 100 ml de água destilada para preparar uma solução de vermelho Congo a 0,5%.
  2. Transferir secções tronco para um tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Adicionar 1 ml de solução de vermelho Congo a 0,5% para o tubo. Pipeta suavemente a solução vermelho congo 0,5% para cima e para baixo, sem perturbar as seções. NOTA: Tenha cuidado para não pipetar as seções para a ponta da pipeta, pois isso pode danificar as seções.
    1. Incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos e repetir a pipetagem. Seguir com mais 3 minutos de incubação à temperatura ambiente.
    2. Use uma pipeta de 1 ml para tirar 700 mL de 0,5% solução de vermelho congo. Adicionar 700 mL de água destilada para lavar a solução de vermelho congo. Repita a lavagem 3-4x até a solução de lavagemé clara.
    3. Usar uma pipeta de 1 ml com a sua ponta de corte, de tal modo que as secções podem ser pipetado para fora facilmente sem danos. Pipeta suavemente seções na ponta e sobre uma lâmina de microscópio, e cobri-los com lamela. Observar as amostras sobre a lâmina sob o microscópio de luz azul de excitação, utilizando um filtro com uma banda de passagem de 560/40. NOTA: Não armazenar as seções na água por muito tempo, antes da análise microscópica, como a água vai lavar o vermelho Congo em 10-30 min.

8. Branco Calcofluor Coloração 9

  1. Dissolve-se 0,02 g de branqueador fluorescente 28 (calcoflúor branco M2R) em 10 ml de água destilada para preparar uma solução de estoque de 0,2%. A solução a 0,2% pode ser armazenado durante seis meses em um frasco escuro a 4 ° C. Preparar uma solução de trabalho de 0,02% por diluição da solução de reserva 10x de 0,2% com água destilada.
  2. Transferir secções tronco para um tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Adicionar ao tubo 1 ml da calcof 0,02%luor solução branca. Pipeta suavemente a solução branco 0,02% calcofluor cima e para baixo. NOTA: Tenha cuidado para não pipetar as seções para a ponta da pipeta, pois isso pode danificar as seções.
    1. Incubar à temperatura ambiente durante 5 minutos e repetir a pipetagem. Incubar a secção por mais 3 min, à temperatura ambiente. NOTA: Permita que as seções para resolver para o fundo do tubo para facilitar a pipeta a solução, sem danificar as seções.
    2. Use uma pipeta de 1 ml para tirar 700 ml de solução de branco 0,02% calcofluor e adicionar 700 mL de água destilada; aguarde 5 minutos para lavar a solução branco calcofluor. Repita a lavagem 3-4x. Use uma pipeta de 1 ml com o corte da ponteira de tal forma que as seções podem ser pipetado para fora facilmente, sem danos.
    3. Pipeta suavemente seções na ponta e sobre uma lâmina de microscópio e cobrir com uma lamela. Observe as seções sob luz UV.

9. Toluidine Blue O Coloração 16,17

  1. Dissolve-se 0,02 g de azul de toluidina O em 100 ml de água destilada para preparar uma solução a 0,02%. NOTA: A solução de azul de toluidina O podem ser armazenadas durante duas semanas num frasco escuro à temperatura ambiente.
  2. Transferir secções tronco para um tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Adicionar 1 ml de solução de azul de toluidina a 0,02% de S para o tubo. Pipeta suavemente a solução de azul de toluidina O 0,02% para cima e para baixo. Em seguida, incuba-se a temperatura ambiente durante 5 min e depois repetir a pipetagem. NOTA: Tenha cuidado para não pipetar as seções para a ponta da pipeta, pois isso pode danificar as seções. Deixe o tubo de microcentrífuga de ficar parado até que as seções sossegar. Isso pode ser difícil de ver, como a solução é escuro, de modo a manter o tubo que contém as seções na cremalheira tubo de ensaio e permitir-lhes que se contentar com 2 min à temperatura ambiente.
    1. Use uma pipeta de 1 ml para tirar 700 ml de solução de azul de toluidina O 0,02%. Adicionar 700 mL de água destilada para lavar o azul de toluidina O solution. Repita 3-4x ou até que a solução de lavagem é clara. Usar uma pipeta de 1 ml, com o corte da ponta da pipeta, de modo que as secções podem ser pipetado para fora facilmente sem os danificar.
    2. Pipeta suavemente seções na ponta e sobre uma lâmina de microscópio e cobrir com uma lamela. Observe as seções sob iluminação de campo claro.

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Resultados

Stem Embedding e Seccionamento:
A utilização do molde de plástico caseiro para incorporar os caules em 7% de agarose revelou-se fácil e rapidamente (Figura 1). As duas partes (A e B; Figura 1) do sistema de frasco incorporado torná-lo simples para liberar facilmente a haste incorporado em agarose como a agarose não se ater às partes dos frascos que são inertes, mantendo o sistema limpo. Os frascos podem ser reutilizados várias vezes durante anos. A conveniência de armazenamento a...

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Discussão

Secções tronco de A. thaliana são amplamente usados ​​para o estudo da organização das células da parede celular secundária e para examinar qualitativamente as diferenças entre o tipo selvagem e plantas transgénicas. As técnicas comumente utilizadas para a secção dos espécimes são corte manual direta; ou quando as amostras são incorporados em agarose ou fixador, o seccionamento pode ser feito com um vibratome ou micrótomo. Em contraste com o lado de corte, os dois últimos permitem reduzir o risco de produzir di...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos financeiros a divulgar.

Agradecimentos

Somos gratos a Sabin Russell para a assistência edição. Este trabalho fez parte do Instituto Joint BioEnergy DOE (http://www.jbei.org), apoiado pelo Departamento de Energia dos EUA, Escritório de Ciência, Instituto de Pesquisa Ambiental e Biológica, por meio do contrato DE-AC02-05CH11231 entre Lawrence Berkeley Laboratório Nacional e do Departamento de Energia dos EUA.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AgaroseEMDMERC2125Número CAS: 9012-36-6
CloroglucinolSigmaP 35021,3,5-trihidroxibenzeno [Número CAS: 108-73-6]
Ácido clorídricoEMDHX0603-75Número CAS: 7647-01-0
Hidróxido de amônioEMDAX1303-6Número CAS: 1336-21-6
Toulidine Blue OSigmaT3260Cloreto de Blutene, Cloreto de Tolônio [Número CAS 92-31-9] 
Permanganato de potássioSigma223468Número CAS 7722-64-7 
Etanol 190 provaKOPTECV1401Número CAS: 64-17-5
Congo RedSigma C62773,3'-[[1,1'-bifenil]-4,4'-diilbis(azo)]bis(4-aminonaftaleno 1-sulfonato) [Número CAS 573-58-0]
Branqueador Fluorescente 28/ Calcofluor White StainSigma F3543 Ácido 4,4'-bis[[4-[bis(2-hidroxietil)amino]-6-anilino-1,3,5-triazina-2-il]amino]estilbeno-2,2'-dissulfônico [Número CAS 4404-43-7] 
VibratomeLeicaLeica Lâmina vibratória micrótomo VT1000Shttp://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
NavalhaAmerican Safety razor companyItem # 60-0139-0000 Lâmina de borda dupla de aço inoxidável (Personna Super)
Tubos de Microcentrífuga com Tampa de Rosca (2 ml)VWR16466-044
Tubos de Microcentrífuga (0.6 ml)Axygen ScientificMCT-060-C
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Adesivo de TecidoTed Pella Inc10033Loja em 4 ° C ou 20 & C para armazenamento de 3 meses ou mais
MicroondasPanasonicNN-SD762SPELCO Pro CA 44 Adesivo de tecido instantâneo 
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Micro lâminas foscas, 1 mmVWR48312-00375 x 25 mm - 1 mm
Parafilm MEmbalagem AlcanBRNDPM998
cubo de filtro TX2 FiltroLeica11513851/11513885utilizado para análise de vermelho Congo com uma passagem de banda de 560/40.
Câmera colorida de alta velocidade Software de câmera MicroPublisher 5.0Óculos de cobertura micro

Referências

  1. Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
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