A composição da parede celular vegetal varia entre os tipos de tecido e pode incluir lignina, celulose, hemiceluloses e pectina. Várias técnicas de coloração foram desenvolvidas para visualizar as diferenças no nível do tipo de célula. Este artigo é uma compilação de técnicas de coloração da parede celular comumente usadas.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Arabidopsis thaliana é um organismo modelo comumente usado para entender e manipular vários processos celulares em plantas, e tem sido amplamente utilizado no estudo da formação de paredes celulares secundárias. A deposição da parede celular secundária ocorre após a fixação da parede celular primária, um processo realizado exclusivamente por células especializadas, como as que formam vasos e tecidos fibrosos. A maioria das paredes celulares secundárias é composta de celulose (40-50%), hemicelulose (25-30%) e lignina (20-30%). Várias mutações que afetam a biossíntese da parede celular secundária foram isoladas, e os mutantes correspondentes podem ou não exibir mudanças óbvias na composição bioquímica ou fenótipos visuais, uma vez que essas mutações podem ser mascaradas por respostas compensatórias. Os procedimentos de coloração têm sido historicamente usados para mostrar diferenças em uma base celular. Esses métodos são meios exclusivamente visuais de análise; no entanto, seu papel na análise rápida e crítica é de grande importância. O vermelho Congo e o branco calcofluor são corantes usados para detectar polissacarídeos, enquanto o Mäule e o floroglucinol são comumente usados para determinar diferenças na lignina, e o azul de toluidina O é usado para corar diferencialmente polissacarídeos e lignina. As técnicas aparentemente simples de seccionamento, coloração e imagem podem ser um desafio para iniciantes. Começando com a preparação de amostras usando o modelo de A. thaliana, este estudo detalha os protocolos de uma variedade de metodologias de coloração que podem ser facilmente implementadas para observação da organização celular e tecidual nas paredes celulares secundárias das plantas.
Introdução
A parede celular da planta tem uma infinidade de informações dentro de seus vários componentes: lignina, celulose, hemicelulose (xilana, glucuronoxylan, xiloglucano, arabinoxilano, ligação mista glucana, ou glucomanana) e pectina. Técnicas histológicas fornecer dicas visuais importantes no estudo das diferenças dentro das paredes celulares secundárias a nível da organização e celulares. Várias técnicas histológicas foram desenvolvidos e podem ser encontrados na literatura, mas estas técnicas pode ser um desafio para principiantes e demorada porque os protocolos muito detalhado com instruções visuais simples são raramente, se alguma vez disponível. O objetivo deste es....
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Protocolo
1. Tronco Embedding
- Adicione uma solução de agarose a 7% em água (7 g de agarose de electroforese em série, em 100 ml de água destilada). Dissolve-se a agarose por autoclavagem durante 20 minutos ou por microondas durante 20 minutos à menor intensidade (por exemplo, intensidade de 10% de um forno de microondas de 1.250 watts).
- Prepare um molde caseiro para a incorporação das hastes utilizando frascos de plástico.
- Usando uma lâmina de barbear, cortar o fundo cônico de 2 ml com tampa de rosca tubo de microcentrífuga (Parte A). Com uma agulha de seringa, perfurar um furo na tampa do tubo um pouco maior do que o diâmetro da haste pa....
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Resultados
Stem Embedding e Seccionamento:
A utilização do molde de plástico caseiro para incorporar os caules em 7% de agarose revelou-se fácil e rapidamente (Figura 1). As duas partes (A e B; Figura 1) do sistema de frasco incorporado torná-lo simples para liberar facilmente a haste incorporado em agarose como a agarose não se ater às partes dos frascos que são inertes, mantendo o sistema limpo. Os frascos podem ser reutilizados várias vezes durante anos. A conveniência de armazenamento a.......
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Discussão
Secções tronco de A. thaliana são amplamente usados para o estudo da organização das células da parede celular secundária e para examinar qualitativamente as diferenças entre o tipo selvagem e plantas transgénicas. As técnicas comumente utilizadas para a secção dos espécimes são corte manual direta; ou quando as amostras são incorporados em agarose ou fixador, o seccionamento pode ser feito com um vibratome ou micrótomo. Em contraste com o lado de corte, os dois últimos permitem reduzir o risco de produzir di.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos financeiros a divulgar.
Agradecimentos
Somos gratos a Sabin Russell para a assistência edição. Este trabalho fez parte do Instituto Joint BioEnergy DOE (http://www.jbei.org), apoiado pelo Departamento de Energia dos EUA, Escritório de Ciência, Instituto de Pesquisa Ambiental e Biológica, por meio do contrato DE-AC02-05CH11231 entre Lawrence Berkeley Laboratório Nacional e do Departamento de Energia dos EUA.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agarose | EMD | MERC2125 | Número CAS: 9012-36-6 |
| Cloroglucinol | Sigma | P 3502 | 1,3,5-trihidroxibenzeno [Número CAS: 108-73-6] |
| Ácido clorídrico | EMD | HX0603-75 | Número CAS: 7647-01-0 |
| Hidróxido de amônio | EMD | AX1303-6 | Número CAS: 1336-21-6 |
| Toulidine Blue O | Sigma | T3260 | Cloreto de Blutene, Cloreto de Tolônio [Número CAS 92-31-9] |
| Permanganato de potássio | Sigma | 223468 | Número CAS 7722-64-7 |
| Etanol 190 prova | KOPTEC | V1401 | Número CAS: 64-17-5 |
| Congo Red | Sigma | C6277 | 3,3'-[[1,1'-bifenil]-4,4'-diilbis(azo)]bis(4-aminonaftaleno 1-sulfonato) [Número CAS 573-58-0] |
| Branqueador Fluorescente 28/ Calcofluor White Stain | Sigma F3543 | Ácido 4,4'-bis[[4-[bis(2-hidroxietil)amino]-6-anilino-1,3,5-triazina-2-il]amino]estilbeno-2,2'-dissulfônico [Número CAS 4404-43-7] | |
| Vibratome | Leica | Leica Lâmina vibratória micrótomo VT1000S | http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/ |
| Navalha | American Safety razor company | Item # 60-0139-0000 | Lâmina de borda dupla de aço inoxidável (Personna Super) |
| Tubos de Microcentrífuga com Tampa de Rosca (2 ml) | VWR | 16466-044 | |
| Tubos de Microcentrífuga (0.6 ml) | Axygen Scientific | MCT-060-C | |
| Mitt | Bel-Art | 380000000 | SCIENCEWARE Protetor de Mão Quente Mitt |
| Adesivo de Tecido | Ted Pella Inc | 10033 | Loja em 4 ° C ou 20 & C para armazenamento de 3 meses ou mais |
| Microondas | Panasonic | NN-SD762S | PELCO Pro CA 44 Adesivo de tecido instantâneo |
| Câmera com chip CCD sem obturador mecânico | Hamamatsu | C4742-95 | |
| RTV | QImaging | ||
| Molecular Devices | MetaMorph versão 7.7.0.0 | ||
| Imagining anaylsis | Adobe | Photoshop CS4 | |
| , quadrados, nº 1 | VWR | 48366-067 | 22 x 22 mm (7/8 x 7/8") - Os óculos de cobertura são resistentes à corrosão e uniformemente espessos e planos. A espessura nº 1 é de 0,13 a 0,17 mm. |
| Micro lâminas foscas, 1 mm | VWR | 48312-003 | 75 x 25 mm - 1 mm |
| Parafilm M | Embalagem Alcan | BRNDPM998 | |
| cubo de filtro TX2 Filtro | Leica | 11513851/11513885 | utilizado para análise de vermelho Congo com uma passagem de banda de 560/40. |
Referências
- Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
- Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin biosynthesis and structure. Plant physiology. 153, 895-905 (2010).
- Humphreys, J. M., Chapple, C.
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Reimpressões e permissões
