Imagem Limpa Sistemas Biológicos intactas em um nível celular por 3DISCO

Resumo

Para obter imagens de alta resolução de células marcadas com fluorescência dentro de grandes tecidos, idealmente, as amostras biológicas devem ser visualizadas sem seccionamento. 3DISCO é um procedimento simples de limpeza de tecidos baseado na incubação sequencial com solventes orgânicos. Após a limpeza, os órgãos tornam-se transparentes, permitindo uma varredura a laser de ponta a ponta da amostra.

Resumo

A limpeza de tecidos e a subsequente imagem de órgãos transparentes são um método poderoso para analisar células e moléculas marcadas com fluorescência em 3D, em órgãos intactos. Ao contrário dos métodos histológicos tradicionais, em que o tecido de interesse é seccionado para imagens fluorescentes, a imagem 3D do tecido limpo permite o exame de células e moléculas marcadas em toda a amostra. Para este fim, os tecidos opticamente opacos devem ser tornados transparentes, combinando os índices refratários em todo o tecido. Posteriormente, o tecido pode ser visualizado de uma só vez usando microscópios de varredura a laser para obter uma imagem 3D completa de alta resolução da amostra. Uma lista crescente de protocolos de limpeza de tecidos, incluindo 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2 e SeeDB, fornece novas maneiras para os pesquisadores obterem imagens de seus tecidos de interesse como um todo. Entre eles, o 3DISCO é um método altamente reprodutível e direto, que pode limpar diferentes tipos de tecidos e pode ser utilizado com várias técnicas de microscopia. Este protocolo descreve este procedimento simples e apresenta suas várias aplicações. Também discute as limitações e possíveis dificuldades e como superá-las.

Introdução

O exame histológico dos tecidos biológicos é uma abordagem fundamental para a compreensão da natureza das moléculas / células em seu contexto natural. Idealmente, imagens de alta resolução de todo o órgão é mais informativo e desejado. Dado que a luz tem uma profundidade de penetração limitada, devido ao espalhamento ^1, órgãos fixos têm de ser seccionados de forma a realizar de alta resolução de imagem microscópica. Assim, a maioria dos estudos histológicos são realizadas em algumas secções de tecido que representam apenas uma pequena porção do órgão. Em alguns estudos, por exemplo, aqueles com o objetivo de traçar conexões neuronais no cérebro ou na medula espinhal, todos os cortes de tecidos dos órgãos-alvo são coletados e fotografada para uma reconstrução 3D. No entanto, o corte de tecido e de imagem posterior de seções individuais tem várias limitações. Estes incluem a ser demorada e que conduz a uma reconstrução 3D incompleta do tecido, devido às distorções mecânicas e difícils no alinhamento das imagens resultantes.

Recentemente, a compensação de imagem e transparentes órgãos intactos tem sido desenvolvido como uma solução para este inconveniente significativo ^2,3. Após a limpeza, todo o órgão é processado transparente permitindo que a luz de imagens de viajar end-to-end (Figura 1) para produzir imagens de alta resolução do órgão unsectioned usando um microscópio de varredura a laser, como um multi fótons de luz ou folhas microscópio ( Figura 2). Vários grupos de pesquisa têm desenvolvido novos protocolos de limpeza do tecido a ser capaz de imagem seu tecido de interesse para fins diferentes. Estes incluem solvente orgânico ^{2-5, 6,7} água e eletroforese baseado ⁸ protocolos de compensação. Entre eles, a imagiologia 3-dimensional do solvente afastada órgãos ou 3DISCO é um protocolo facilmente aplicável numa variedade de amostras biológicas, incluindo o sistema nervoso central (SNC) de órgãos, órgãos imunes e tumores sólidos. Em additião, pode ser combinada com diferentes técnicas de microscopia, tais como a microscopia de luz de fluorescência folha (LSFM), multi fotão e por microscopia confocal de varrimento laser. 3DISCO baseia-se na compensação de reagentes prontamente disponíveis e baratos, tais como tetrahidrofurano (THF) e o éter dibenzílico (DBE) ^4. O protocolo inteiro pode levar tão curto quanto 3-4 horas. Assim, 3DISCO é uma técnica robusta e rápida em comparação com os métodos histológicos tradicionais que pode levar semanas ou meses a completar ^9.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com IACUC (Comitê Animal Care Institucional e utilização) regulamentos em ratos ~ 3-5 meses de idade. O autor declara não interesses financeiros concorrentes.

1. Perfusão Animal e preparação do tecido

Timing: 30-60 min por mouse + pós-fixação (de algumas horas a noite).

1. Pesa-se o animal e anestesiar usando cetamina (80-200 mg / kg) e xilazina (7-20 mg / kg) ou 2,5% de avertina (0,5 ml/25 g de peso corporal de IP).
2. Aguarde alguns minutos para anestesia fazer efeito completo.
3. Aperte o dedo do pé e cauda do animal para se certificar de que o animal está totalmente anestesiado.
4. Perfundir o primeiro animal à RT, com 0,1 M de tampão fosfato (PB) ou 0,1 M de tampão fosfato salino (PBS) durante 5-10 min, até que o sangue é completamente removido do tecido.
5. Alterne a perfusão de solução fixadora: PFA 4% em 0,1 M PB (ou 0,1 M PBS) e continuar a perfusãocom PFA a 4% durante 30-40 minutos a uma velocidade de 3 ml / min.
6. Dissecar a órgãos / s de interesse cuidadosamente sem danificar, por exemplo, evitar a perfuração e apertando o tecido que está a ser dissecado.
7. Remover o tecido extra em torno dos órgãos (tecido conjuntivo, meninges ou dura-máter) numa placa de Petri com PBS.
8. Pós-corrigir os órgãos em PFA 4% por algumas horas ou durante a noite a 4 º C. Evite longa pós-fixação porque PFA pode saciar o sinal ou aumentar as horas extras autofluorecense ¹⁰ especialmente para o canal GFP (que é um problema menor nos canais vermelho e vermelho agora).
9. Lave os órgãos 2-3x com PBS a RT imediatamente antes de iniciar o procedimento de limpeza.

2. Clearing Tissue

Timing: 2-3 hr para pequenos órgãos e 1-4 dias para os grandes órgãos.

Notas: A rotulagem fluorescente dos tecidos pela expressão do transgene, transfecção viral, traçando corante ou antirotulagem corpo deve ser concluída antes de limpar. Todos os passos de compensação do tecido são realizados à temperatura ambiente. As soluções de compensação de THF, DBE, Babb (1 parte de álcool benzílico e 2 parte benzoato de benzila) e diclorometano são tóxicos e inalação (conduzir experimentos em coifa bem ventilado) e contato direto com a pele deve ser evitado (luvas de borracha nitrílica uso).

1. Prepare a 50% (vol / vol), 70%, 80% e diluições em THF em água destilada em frascos de vidro separados como se segue: Para 50% de THF, por exemplo, misturar 25 mL de THF e 25 ml de água destilada em um frasco de vidro com volume de de maior de 50 ml.
2. Misture soluções agitando a garrafa para um 1-2 min.
3. Identifique claramente a garrafa de vidro.
4. Feche bem as garrafas e manter as soluções de trabalho em um armário escuro. Para obter os melhores resultados, não use as mesmas soluções de trabalho com mais de 1-2 semanas. Portanto, pedir as soluções de compensação como o menor volume disponível para poder utilizar os novos reagentes de ações.
5. Encher os frascos de vidro (por exemplo, 2-3 ml) com a primeira solução de compensação, 50% de THF, e transferir os órgãos de PBS em frascos de vidro para iniciar a limpeza.
6. Feche bem os frascos de vidro com suas tampas e usar um rotador (por exemplo, um agitador roda) para agitar.
7. Use a folha de alumínio para cobrir e manter os frascos de vidro em escuro. Inicie o rotador para agitar as amostras em frascos de vidro durante o tempo indicado (Tabela 1), a uma velocidade constante (aproximadamente 30 rpm).
8. Remover a solução de limpeza e de adicionar o próximo no protocolo, quando o tempo na Tabela 1 é concluída.
9. Recolher o lixo clareira em contentores de lixo de vidro que são mantidos em uma capa.
   Repita o passo anterior para cada solução de limpeza no protocolo até o fim. Use uma nova pipeta pasteur quando uma nova solução de limpeza é adicionado (por exemplo, mudar de THF para DBE).
10. Na etapa final clareira com BABB ou DBE, os tempos de incubação pode ser prorrogado ou shortened até que as amostras se tornar totalmente transparente à luz visível (ou amarelada / transparente, se é um grande tecido como o cérebro).
11. Manter os órgãos compensados ​​na solução final de compensação em todos os momentos, incluindo as etapas de imagem.

3. Preparando Órgãos Cancelado for Imaging

Timing: 5-15 min.

Nota: A imagem dos órgãos apuradas assim que uma compensação completa seja alcançada. Para isso, siga os seguintes passos para preparar as amostras para microscopia de luz folhas (por exemplo, ultramicroscopia) ou confocal / multi-fotão microscopia de imagem.

Nota: órgãos Cancelado vai perder sua força de fluorescência ao longo do tempo (particularmente proteínas fluorescentes, por exemplo, GFP; rotulagem anticorpo é mais resistente e pode até dar melhores resultados com incubações mais longas). Para imagiologia, várias técnicas de microscopia de fluorescência pode ser utilizado, desde que a manipulação adequada dos órgãos na cleasolução anel é conseguida.

1. Para a microscopia de luz folhas
   1. Coloque ou montar a amostra de forma adequada.
   2. Corrigir o órgão cancelou girando manualmente o parafuso do suporte da amostra ^4.
   3. Mergulhar a amostra para a câmara de imagem (de preferência feito de vidro) de microscópio thelight-folha que é cheio com o BABB ou DBE, o que foi utilizado no passo final de limpeza.
2. Para a microscopia de multi fotões / confocal
   1. Montagem da amostra sobre uma corrediça de imagem (ou uma câmara de imagem) com a solução final de imagem para ser capaz de imagem com um multi fotões ou microscopia confocal, que tipicamente utilizam óleo ou água objectivos imerso.
   2. Use cimento dental para fazer uma borda ao redor do tecido.
   3. Encher a piscina com BABB ou DBE pouco antes de cimento dental fica totalmente rígida.
      Nota: O cimento dental solidifica rapidamente; praticar algumas vezes para se familiarizar com ele antes de tentar as amostras reais.
   4. Colocar imediatamentea amostra apuradas no meio da piscina e cubra com uma tampa de vidro.
   5. Pressionar a tampa de vidro até que seja completamente selada com cimento dentário e toca na superfície do órgão limpa, o que permitirá atingir a profundidade máxima de imagiologia por microscopia confocal / multi-fotão.
      Notas: Isso garante que nenhuma solução compensação será derramado durante a imagem. Evitar mergulhando a lente de imagem directamente na solução de compensação, o que pode prejudicar a lente menos que seja resistente à BABB / DBE, ou tem uma capa protectora.

Órgãos 4. Imagem Cancelado

Timing: 15-45 min.

1. Coletar uma varredura z cobrindo todo o tecido limpo (se a lente utilizada permite) com o melhor resolução que o microscópio pode entregar.
2. Amplie as regiões de interesse para coletar imagens de alta resolução.

5. Exame dos dados com o software Amira

1. Carregue a série imagems de software Amira com módulo ResolveRT.
2. Digite os tamanhos de voxel corretos na janela "Imagem Read Parameter" e pressione ok.
3. Selecione o "Multi Planer View" sub-aplicação. Em seguida, use o controle deslizante "espessura" para escolher o limite ideal para os valores de cinza, ajustando os valores 2D e 3D.
4. Visualize a amostra, navegando as fatias em diferentes orientações 2D e usando o módulo de integração lavoura-canto em vista 3D.
   Nota: Um guia de resolução detalhada do protocolo pode ser encontrada em Ertürk et al ^4.

Resultados

Os neurônios são células altamente polarizado com extremamente longa morfologia. Sua função depende das ligações que se formam entre si e com outros tecidos. Assim, o mapeamento da organização estrutural dos neurônios é extremamente importante para entender como eles funcionam na saúde e na doença. No entanto, seguindo essas enormes conexões neuronais em todo o nervoso conectonomia sistema recentemente nomeados ¹¹ - continua a ser um dos desafios mais difíceis na neurociência. Para este fim, tanto da UE ¹² e EUA ¹³ iniciaram grandes projetos para mapear o cérebro humano.

Enquanto 3DISCO podem ser empregues em vários órgãos, tem sido particularmente útil para rastrear ligações neuronais longo da medula espinal e do cérebro. Por exemplo, por meio de varreduras ultramicroscopia segmentos de medula espinal compensados ​​grandes, as ligações axonais pode ser seguida ao longo centímetros na espinal-medula do roedor (Figura 2). De um modo semelhante, a totalidade do cérebro do rato afastada (Figura 3a) e hipocampo (Figura 3b) pode ser trabalhada para seguir as ligações neuronais no cérebro.

Quando microscopia confocal fóton ou múltipla é utilizada em órgãos desmatadas, a resolução de imagem pode ser significativamente melhorada, especialmente na dimensão z. Por exemplo, várias imagens de fotões de medulas espinhais apuradas a partir de ratos da linha de GFP-M (Figura 4a) atinge uma imagem uniforme, ao longo de toda a profundidade (~ 1,5-2 mm) da medula espinal. Microscopia confocal sobre a medula espinal afastada proporciona melhor resolução de uma forma semelhante (Figuras 4b e c). Multi imagens de microscopia de fótons de cérebros desmatadas proporciona imagens muito de alta resolução para visualizar detalhes de estruturas neuronais incluindo espinhas dendríticas (Figura 5). As amostras para 3DISCO pode ser marcado de várias maneiras, incluindo a expressão do transgene, viral transfecção, traçado corante e rotulagem de anticorpos. Por exemplo, é possível marcar toda a vasculatura do cérebro (Figuras 6a e b), e na medula espinhal (Figuras 6c e d) utilizando lectina conjugada marcadores fluorescentes ^4, o qual pode ser utilizado para estudar a-barreira hematoencefálica (BHE ) na saúde e na doença.

Ambas as microglia e astrócitos são altamente implicados na patologia da neurodegeneração, incluindo doenças de Alzheimer e lesões traumáticas ^14,15. Usando 3DISCO, a sua densidade e distribuição na medula espinal (Figura 7) ou do cérebro pode ser estudada.

Tecidos não-neuronais, também pode ser trabalhada. Por exemplo, células Clara em todo os pulmões de roedores pode ser immunolabeled com anticorpos e representado sem o corte em um único nível celular (Figura 8). Da mesma forma, é possível limpar e células de imagem, por exemplo,células alfa no tecido do pâncreas unsectioned (Figura 9).

Figura 1. Compensação tecido 3DISCO torna tecidos unsectioned transparentes para imagens de tecidos profundos. Uncleared (a) e compensados ​​(b) os tecidos da medula espinhal como pode ser visto pela luz visível. Após a compensação, microscopia de varredura a laser-tecido profundo se torna possível. (C) os tecidos da medula espinhal Uncleared e desmatadas foram fotografadas por microscopia de dois fótons. As barras de escala em a, b = 0,5 mm e em c = 100 pm.

Figura 2. 3DISCO imagiologia de medula espinal a seguir extensões axonais. A medula dissecada de Thy-1 de linha de ratinhos transgénicos GFP (GFP-M) é dividida em pedaços mais pequenos (~4 mm). Depois de seguir o protocolo de compensação para pequenos tecidos (Tabela 1) as medulas espinhais transparentes foram visualizados utilizando ultramicroscopia. Reconstruções em 3D de um ~ 4 milímetros segmento da medula espinhal em horizontal (a), coronal (b) e sagital (c). (D) Representante rastreada axônios (vermelho) são mostrados na visão transparente em tons de cinza. (E) Alto ampliação da região indicada em (d). As barras de escala em a, b, c, d = 0,5 mm, e em e = 20 um.

3DISCO imagem do cérebro apagado e hipocampo Figura 3.. Exemplos de cérebros e hipocampo de camundongos GFP-M desmatadas foram fotografadas com um ultramicroscópio. Visualizações 3D de todo o cérebro (a) e hipocampo (b) demonstrar o netwo neuronalrks nos tecidos transparentes com imagens. As barras de escala em um = 2 mm, e em b = 20 ^ m.

Figura 4. Compensação de tecido aumenta a resolução obtida por vários fotões e microscopia confocal. Segmentos da medula espinhal de ratos transparentes GFP-M fotografada por vários fotões (a) ou microscopia confocal (b, c). Note-se que a limpeza substancialmente melhora a resolução e profundidade de imagem revelando a estrutura fina de axônios e dendritos. Barras de escala = 100 um em um e em b, c = 20 um.

Figura 5. 3DISCO imagem das espinhas dendríticas. Tecido cerebral de camundongos Transparente GFP-M fotografada pelo multi fótons. Visualizações 3D da região do córtex digitalizada apresentados em versãoperspectivas Tical (a) e horizontais (b). (C) ~ 50 um de projecção a partir dos níveis indicados em (a, b). (D) alta ampliação da região indicada em (c) demonstrar os detalhes das estruturas neuronais incluindo espinhas dendríticas (setas). As barras de escala em um = 50 mm, em b, c = 25 um, no d = 5 mm.

Figura 6. 3DISCO da vasculatura. Para identificar os vasos sanguíneos em todo os órgãos, corante de lectina-FITC foi utilizada durante a perfusão (antes da compensação) como descrito ^16. É importante mencionar que achamos que a injeção na veia da cauda do traçador dá melhor sinal sobre perfusão cardíaca do marcador. Após a coleta dos cérebros fixos e medula espinhal, eles foram apuradas e imaged por ultramicroscopia. Visualização 3D de toda a vasculatura cerebral do rato em heatmap (a) e em escala de cinza (a). (B) a visualização 3D da vasculatura de um rato segmento da medula espinhal em heatmap (c) e em escala de cinza (d). Os heatmaps foram gerados com base na intensidade de coloração da lectina; azul: baixa intensidade (background) e vermelho: alta intensidade (vascularização). As barras de escala em um = 2 mm, b = 1 mm, e em c, d = 250 um.

Figura 7. 3DISCO de células da glia no tecido CNS apagada. Medula espinhal de camundongos transgênicos expressando GFP em microglia Tgh (CX3CR1-EGFP) ou astrócitos TgN (hGFAP-ECFP) foram apuradas e fotografada por microscopia de multi fótons. Rendição 3D de microglia é mostrado como a visualização do volume de superfície (a) e vista transparente ( (C) Uma projecção óptica (~ 50 mM) é apresentado para mostrar os detalhes da microglia na medula espinal. Rendição 3D de astrócitos é mostrado como a visualização do volume de superfície (a) e vista transparente (b). (F) Uma projecção óptica (~ 50 mM) é apresentado para mostrar os detalhes dos astrócitos na medula espinhal. As barras de escala em a, b, d, e = 100 mm e em c, f = 50 mm.

Figura 8. 3DISCO de um lobo pulmonar inteiro de montagem com coloração de anticorpos de células Clara. Para o anticorpo coloração dos lobos pulmonares todo-mount, 10 semanas de idade camundongos BALB / C fêmeas foram perfundidos através do ventrículo direito com PBS, a fim de remover o sangue dos pulmões. Os pulmões foram subsequentemente inflado com PFA a 4% e fixa S / N a RT em fixador, pelo menos, três vezes o volume de poe tecidos. No dia seguinte, os pulmões foram rapidamente lavadas em PBS e o lóbulo direito foi colocado em 5 ml de 1% de Triton X-100 em PBS, durante a permeabilização durante 48 horas ou até o tecido se afundou. Todas as colorações foram realizadas em 0,2% de Triton X-100 em PBS contendo 5% de FBS e 2% de BSA e lavagens foram em 0,2% de Triton X-100 em PBS. Coloração com anticorpos anti-CC10 foi de 72 horas a 4 ° C, seguido por extensa lavagem de cerca de 6 horas. A microscopia por fluorescência de o anticorpo primário foi realizada com o anticorpo secundário anti-cabra-Alexa Fluor-594 durante a noite a 4 ° C, seguido por lavagens extensas em 6 horas durante a noite. No dia seguinte, os lóbulos coradas foram apuradas através de 50%, 70%, e 80% de THF, durante 30 min cada, seguido por três lavagens de 30 min em 100% de THF, seguidos por 20 min em DCM, seguido de 30 min em DBE. As barras de escala em a e b = 1 mm e em c = 100 pm.

Figura 9. 3DISCO de pâncreas. Após a perfusão de ratos, como descrito acima no protocolo, o pâncreas foi dissecado e liberado com o protocolo curto. A fluorescência é derivado Rosa26 LSL tdTomato recombinação induzida por tratamento com tamoxifeno de ratos portadores de um transgene de BAC de 200 kb abrangendo o rato glucagon locus endógeno com CreERT2 inseridos no ATG do glucagon. As setas marcam algumas das células alfa fluorescentes marcado na ilhota. As barras de escala em a, b e c = 1 mm e em d = 500 mm.

Tabela 1. Protocolos de limpeza de tecidos para vários tecidos. Exemplos de protocolos de limpeza de tecidos para tecidos diferentes. Note-se que o tempo de compensação para cada etapa pode ser encurtado ou estendido conforme a necessidade de melhorar o desempenho de compensação. O peso aproximado de pequenos tecidos é de aproximadamente 20-100 mg e do cérebro é de aproximadamente 300-500 mg.TTP :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.

Discussão

Métodos de compensação Tissue visam reduzir a dispersão da luz de imagem, combinando os índices de refração de diferentes camadas de tecido nos órgãos desmatadas. Como um resultado, a luz de imagem podem penetrar profundamente nos tecidos e estimular as células marcadas / moléculas. Este velho conceito de tecido limpando ¹⁷ ganhou crescente atenção após a primeira aplicação sofisticada da técnica em cérebros intactos rato por Dodt e colegas ^2. Desde então, há uma lista crescente de novos métodos de compensação, incluindo 3DISCO, Sca / e, ClearT2, CLAREZA e SeeDB ^3,4,7,18-20. Em essência, todos eles visam tornar os órgãos transparentes para imagens de tecidos profundos, preservando a etiqueta fluorescente. Entre eles, 3DISCO destaca-se como um dos métodos mais simples e reprodutível. É relativamente rápido em comparação com outros métodos de compensação mencionados acima (1-5 dias vs 2-3 semanas para cérebros adultos, respectivamente) ^21. Ele já foi sucessototalmente aplicado a diferentes órgãos, como o cérebro, medula espinhal, gânglios linfáticos, baço, pulmão, tumores sólidos, pâncreas e glândulas mamárias ^3,4,9. Além disso, várias publicações de grupos de pesquisa independentes já usou esse método para obter imagens resulta ^22,23. No entanto, diferentes procedimentos de limpeza de tecido pode ser vantajoso para as diferentes condições. Por exemplo, enquanto Sca / e e SeeDB são mais aplicáveis ​​em tecidos embrionários ^6,7, são métodos de compensação à base de água, que poderia ser mais fácil de manusear durante o exame. Em contraste, a clareza é um método de compensação complicada e dispendiosa. Mas, pode ser vantajoso no contexto da marcação com anticorpos, especialmente em grandes tecidos, tais como tumores do cérebro ^8.

O passo mais importante para obter os melhores resultados de imagem de 3DISCO é a rotulagem dos tecidos, que é realizado antes da compensação de tecidos. É essencial para começar com o sinal de fluorescência mais forte possível. Isto pode bE conseguida de várias maneiras, incluindo a expressão transgénica de proteínas fluorescentes, detecção por corantes sintéticos, transfecção viral ou marcação de anticorpos. Deve ser mantido em mente que qualquer procedimento de compensação irá reduzir o sinal fluorescente dos tecidos. Assim, se o sinal fluorescente não é forte o suficiente no início - ou seja, não é facilmente detectável antes da compensação por imagem dos tecidos desmatadas vai entregar resultados pobres.

Existem algumas limitações de limpar os métodos que estão à espera de melhorias. Uma limitação fundamental é que uma vez que os reagentes de compensação alteram a estrutura dos órgãos compensados, eles não podem ser utilizados em tecido vivo. Assim, experiências como com mEos2 fotoactivável ²⁴ deve ser realizada antes da fixação e de compensação. Após a limpeza, de super-resolução de imagem do sinal de fluorescência a partir de proteínas brilhantes e fotoestáveis ​​torna-se possível. Além disso, porque o protocolo de compensação diminui ointensidade das proteínas fluorescentes, os órgãos não apuradas pode ser armazenado por períodos prolongados. É importante notar que alguns órgãos são mais difíceis de ser apagadas. Especialmente, se os órgãos dissecados reter grandes quantidades de células de sangue (por exemplo, o baço, o fígado), que são relativamente difíceis de limpar e de imagem. Também é relativamente difícil de conseguir uma eliminação completa de grandes tecidos, tais como cérebro adulto roedor. Tais tecidos podem precisar de tempos de incubação mais longos, o que poderia, por outro lado, reduzir o sinal fluorescente. Além disso, o desenvolvimento de métodos de microscopia que pode imagem de grandes órgãos transparentes de uma só vez em uma alta resolução de uma necessidade aguardando para ser abordado. Outra importante limitação da técnica é a rotulagem tecido. Enquanto um forte sinal de fluorescência através de expressão genética ou vírus é ideal, nem todas as células ou a molécula pode ser etiquetado de forma viral ou geneticamente. Por outro lado, a marcação de anticorpos de tecidos espessos não é um procedimento simples, ou mesmo não possible na maioria dos casos. Ele pode precisar de protocolos especiais permeabilização e longos tempos de incubação (vários dias a algumas semanas) ^3. Também é importante ter em mente que os tecidos encolher cerca de 20% em cada dimensão (medida de tecido da medula espinhal) depois de limpar, principalmente devido à desidratação e delipidação. Este encolhimento ocorre ratiometrically e deve ser corrigida em passos de quantificação. Como pode ser observado nos resultados apresentados, estruturas marcadas com fluorescência permanece intacta, o que é a indicação de integridade de proteínas nos tecidos compensados. Devido à natureza hidrofóbica do final de tecido limpa, ela não pode mais ser coradas com os anticorpos ou incorporados em soluções aquosas contendo, por exemplo, Focusclear-que é usado em clareza e 80% de glicerol. Finalmente, é um desafio para analisar tamanhos enormes de dados de imagem. Por exemplo, quando todo um cérebro murino é digitalizado com uma resolução de celular, que seria muito difícil de rastrear e quantificar str desejadouctures (por exemplo, redes neuronais ou glia) e comparar em diferentes amostras de forma automatizada. Em resumo, enquanto pesquisadores pretendem descobrir novos métodos de compensação, os vários desafios acima (dificuldade de limpar diversos tecidos, imagens em alta resolução de áreas maiores, e análise de dados complicado) deve ser melhorado em paralelo.

Em conclusão, técnicas de limpeza de tecidos recentemente desenvolvidos, incluindo 3DISCO, elegantemente demonstram que imagens de alta resolução 3D de órgãos intactos agora é possível. Usando esses métodos, os cientistas podem obter informações anatômicas das células e moléculas no órgão intacto. Estes estudos de imagem 3D pioneiras em órgãos transparentes inspirar um número crescente de pesquisadores de decifrar anatômica complexa e organizações moleculares de tecidos / órgãos de saúde e doença.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Thy-1 GFP (GFP-M) mouse			Pode ser obtido de Jackson.
		CX3CR1 GFP	Pode ser obtido no laboratório Littman da NYU.
		TgN (hGFAP-ECFP)	Pode ser obtido de Jackson.
Paraformaldeído	Sigma	P6148
Na2HPO4	Mallinckrodt	7917-16
NaH2PO4	Mallinckrodt	7892-04
2-2-2 Tribromoetanol	Sigma	T48402
2-Metil-2-butanol	Sigma	152463	Usado para preparar a solução de Avertin.
Sigma Sigma	270997-12X100ML Diclorometano Sigma 270997-12X100ML
Sigma do éter Dibenzyl
Benzyl	Sigma	305197-100ML
Sigma		B6630-250ML
Lectin FITC	Sigma	L0401-1MG
anti-CC10	Santa Cruz	SC-9772	0,388888889
Heparina	APP produtos farmacêuticos	504001	Usado na perfusão.
Frascos de vidro	VWR	548-0554
Fórceps	FST	11251-10
Mini Rotator	VWR	100498-878
Folha de alumínio	Fisherbrand	01-213-104
Garrafas de armazenamento de mídia de 100 ml	Garrafas de mídia Kimax	EW-34523-00
Bomba de perfusão Minipuls evolution com cabeça de bomba de fluxo médio MF4*	Gilson, Inc	F110701 e F117606
Lâmina de microscopia	VWR	48311-703
FastWell	Grace Bio-Labs	FW20
Lamínula	Corning	2940-245
Placa de Petri de vidro	Corning Pyrex	3160-101
Cimento dentário	Lang Dental	1223PNK
Teste de peróxido Quantofix Tiras	Sigma	37206
Amira com RT resolver módulo de microscopia	Visage Imaging		de análise de imagem
Imaris	Bitplane	software
de imagem ImageJ	NIH	freeware