A resposta imune do hospedeiro à infecção do agente patogénico é um processo fortemente regulado. Utilizando um modelo de exposição do pulmão lipopolissacarídeo em ratos, é possível realizar avaliações de alta resolução dos complexos mecanismos associados à patogênese da doença.
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Artigo de método
A utilização de orofaringe Intratraqueal Administração PAMP e Lavagem Broncoalveolar para avaliar a resposta imune do hospedeiro em camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A resposta imune do hospedeiro contra patógenos é um processo biológico complexo. A maioria dos estudos in vivo classicamente utilizada para caracterizar as interações patógeno-hospedeiro tirar proveito de injeções intraperitoneais de selecionar bactérias ou padrões moleculares de patógenos associados (PAMPs) em camundongos. Embora essas técnicas têm rendido dados tremendos associados pathobiology doença infecciosa, os modelos de injeção intraperitoneal nem sempre são adequados para estudos de interação patógeno-hospedeiro no pulmão. Utilizando um modelo de inflamação pulmonar aguda em ratos, é possível realizar uma análise de alta resolução do anfitrião resposta imune inata utilizando lipopolissacarídeo (LPS). Aqui, descrevemos os métodos para administrar LPS usando administração intratraqueal orofaríngea não cirúrgico, monitorar parâmetros clínicos associados com a patogênese da doença, e utilizar lavado broncoalveolar para avaliar a resposta imune do hospedeiro. As técnicas que estão descritassão amplamente aplicáveis para o estudo da resposta imune do hospedeiro inata de uma gama diversificada de PAMPs e patógenos. Da mesma forma, com pequenas modificações, estas técnicas também podem ser aplicados em estudos que avaliam a inflamação alérgica das vias aéreas e em aplicações farmacológicas.
Introdução
As infecções pulmonares associadas com espécies de bactérias patogênicas são uma causa comum de morbidade e mortalidade global. Determinar os mecanismos que impulsionam a resposta imune do hospedeiro para estes patógenos vai promover o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção e agentes terapêuticos que atenuam o impacto destas infecções. O objetivo geral do protocolo descrito aqui é fornecer ao usuário um método flexível para avaliar o anfitrião resposta imune inata à infecção do patógeno usando um associado padrão molecular de patógenos (PAMP) como um substituto para bactérias vivas. A maioria dos estudos anteriores que avaliaram a resposta imune do hospede....
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Protocolo
Todos os estudos foram realizados no âmbito da aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso (IACUC) para Virginia Tech e de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Intratraqueal (IT) A inoculação de LPS usando a administração orofaríngea
- Certifique-se de que cada animal é identificado exclusivamente usando um soco ouvido, marca auricular, ou outro método aprovado institucionalmente.
- Registe o peso do corpo de linha de base e da temperatura corporal de cada animal.
- Prepare o estoque de trabalho de LPS. Cada ratinho recebe uma dose de 50 ....
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Resultados
As paredes celulares de bactérias gram-negativas são compostos de LPS, o que é muito abundante no ambiente. A inalação de LPS em populações humanas sensíveis exacerba a reactividade das vias aéreas e que é capaz de desencadear uma response11 imune robusta. LPS é também um PAMP comum utilizado em modelos de ratinho para induzir uma resposta imune inata robusta. No protocolo aqui descrito, os ratos receberam uma dose que de LPS isolado a partir de E. coli (sorotipo 0111: B4) usando-administração orofaríngea. Em m.......
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Discussão
Os passos mais críticos para avaliar com sucesso a resposta imune do hospedeiro no pulmão do rato é a seguinte: 1) escolher a tensão do mouse apropriado e sexo para o modelo que está sendo avaliado; 2) otimizar a entrega PAMP para os pulmões; 3) coletar e processar corretamente o LBA; e 4) devidamente corrigir e preparar os pulmões para avaliações histopatológicas.
A escolha do rato tensão é um fator importante na avaliação da resposta imune do hospedeiro. C57BL / 6 são tipicamente considera.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Faculdade Regional VA-MD da medicina veterinária para a prestação de núcleo e suporte técnico para este projeto. Este trabalho é apoiado por uma NIH Career Award Desenvolvimento (K01DK092355).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| C57Bl/6J | The Jackson Laboratory | Stock 000664 | |
| Compact Scale | Ohaus Scale Corporation | 71142845 | |
| Termômetro Retal para Pequenos Animais | Braintree Scientific | TH 5 | |
| Sonda Retal para Roedores | Braintree Scientific | RET 3 | |
| Perfurador de Orelha | Braintree Scientific | EP-S 901 | |
| Lipopolissacarídeo de E. coli 0111:B4 | InvivoGen | LPS-EB | |
| 1x Tampão de fosfato Salino | Life Technologies | 10010-023 | |
| Isoflurano | Baxter | 40032609 | |
| Administração Intratraqueal e Suporte de Insuflação Pulmonar | ICAP Manufacturing | n/a | |
| Suporte de Intubação de Roedores | Braintree Scientific | Tesoura RIS 100 | |
| (romba/afiada) | Fisher Scientific | 13-806-2 | |
| (reta) | Fisher Scientific | 22-327-379 | |
| (45º, curvada) | Tesoura Fisher Scientific | 10-275 | |
| (romba/romba) | Pipeta Fisher Scientific | 08-940 | |
| (200 µ l Capacidade) | Gilson | F123601 | |
| Etanol | Sigma | 459844 | |
| Seringa de 1 ml | BD Medical | 301025 | |
| Seringa de 10 ml | BD Medical | 301604 | |
| 27 G x 0.5 in Agulha | BD Medical | 305109 | |
| Microcentrífuga Refrigerada | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| Cânulas Traqueais de 1,2 mm com adaptador Luer | Aparelho Harvard | 732836 | |
| Solução Salinal Balanceada de Hank | Life Technologies | 14025-076 | |
| 4-0 Sutura Cirúrgica Trançada de Seda | Ethicon | A183 | |
| Kits de Conector Luer para Tubo Aparelho | Harvard | 721406 | |
| Kit de Torneira Luer | Aparelho Harvard 721664 | ||
| Tubulação de Laboratório Tygon formula E-3603 | Sigma | R-3603 | |
| Solução de Formalina, tamponado neutro, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Mouse IL-1β Kit OptEIA ELISA | BD Biosciences | 559603 | |
| Mouse IL-6 Kit OptEIA ELISA | BD Biosciences | 550950 | |
| Mouse TNF-α Kit OptEIA ELISA | BD Biosciences | 560478 | |
| Hemocitômetro | Hausser Scientific | 3520 | |
| Óculos de Cobertura para Hemocitômetro | Thermo Scientific | 22-021-801 | |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV3008401 | |
| Clipes de Funil de Citologia | Fisher Scientific | 10-357 | |
| Funis de Citologia | Fisher Cartões | 10-354 | |
| Fisher Scientific | 22-030-410 | ||
| Fisher Scientific | 12-544-1 | ||
| Fisher | Scientific | 12-540A | |
| Cytospin Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Diff Kit de Coloração Rápida | Fisher Scientific | ||
| Montagem Permount Medium | Fisher Scientific | SP15-500 |
Referências
- Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).
- Egger, C., et al.
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Reimpressões e permissões
