Transcrição e Metabolite Profiling de Avaliação dos Árvore Tabaco e Poplar como matéria-prima para a indústria baseada em Bio

Resumo

Biomassa da planta oferece um recurso renovável para vários produtos, incluindo combustível, alimentação, alimentação e uma variedade de materiais. Neste trabalho, investigar as propriedades de árvore de tabaco (Nicotiana glauca) e álamo como fontes adequadas para um gasoduto biorrefinaria.

Resumo

A demanda global por alimentos, ração, energia e água coloca desafios extraordinários para as gerações futuras. É evidente que as plataformas robustas para a exploração de recursos renováveis ​​são necessárias para superar esses desafios. No âmbito multinacional MultiBioPro estamos desenvolvendo pipelines biorrefinaria para maximizar a utilização da biomassa da planta. Mais especificamente, nós usamos álamo e árvore de tabaco (Nicotiana glauca), como espécies de culturas alvo para melhorar a sacarificação, isoprenoid, conteúdos longa cadeia de hidrocarbonetos, a qualidade da fibra, e conteúdo suberina e lignina. Os métodos utilizados para a obtenção desses resultados incluem GC-MS, LC-MS e plataformas de seqüenciamento de RNA. Os oleodutos metabólitos são ferramentas bem estabelecida para gerar esses tipos de dados, mas também tem as limitações em que metabólitos só bem caracterizados podem ser usados. O seqüenciamento de profundidade nos permitirá incluir todas as transcrições presentes durante as fases de desenvolvimento da folha da árvore de tabaco, mas ha ser mapeada de volta para a sequência de Nicotiana tabacum. Com esses set-ups, buscamos um entendimento básico para os processos subjacentes e no estabelecimento de um quadro industrial para explorar os resultados. Numa perspectiva de mais longo prazo, acreditamos que os dados gerados aqui vai fornecer os meios para um processo de biorrefinaria sustentável usando álamo e tabaco como matéria-prima. Até à data, o nível basal de metabólitos nas amostras foram analisadas e os protocolos utilizados são fornecidos neste artigo.

Introdução

População e crescimento econômico ter causado uma crescente demanda por alimentos, água e combustíveis. Grande parte desses suprimentos são produzidos, processados ​​e transportados através de meios fósseis finitos, como o petróleo. É, no entanto, claro que essa prática não é sustentável, eo desenvolvimento de recursos alternativos será, portanto, de grande importância ^1. Muitos recursos renováveis ​​são, em graus variados, sendo explorada atualmente, incluindo vento, movimento da água, solar, geotérmica, das ondas e as fontes de energia com base. Outro recurso sustentável e largamente inexplorado é a biomassa das plantas. Este recurso também oferece uma eficiente maneira muito para converter energia solar em combustíveis derivados ^2. Além de fornecer combustível de base biológica, a biomassa vegetal também oferece oportunidades únicas para produtos alternativos, incluindo plásticos, detergentes e produtos químicos valiosos.

A parede celular da planta, que consiste em grande parte de polímeros baseados em açúcar, MAKes-se o grosso da biomassa da planta e muito esforço está sendo investido na sua conversão eficiente em bioetanol. A biomassa restante pode ser posteriormente transformado em biogás e produtos relacionados ao petróleo ^3. Grande parte das espécies de plantas perenes, incluindo gramíneas e árvores, que produzem grandes quantidades de biomassa celulósica normalmente crescem melhor em zonas temperadas. No entanto, aproximadamente 20% da área do terreno é semi-árido, e é, portanto, também propensas a secas ^4. Obviamente, seria de interesse para também cultivar essas terras áridas com plantas que podem contribuir de forma eficaz para a produção sustentável de energia e material. Estas plantas precisam ter uma eficiência de uso da água ideal e resistência à seca e que incluem a árvore de tabaco (Nicotiana glauca) e espécies do gênero Agave.

O consórcio MultiBioPro visa a implementação de um pipeline de biorrefinaria integrada, usando a dois importantes crespécies op, álamo e árvore de tabaco. Poplar surgiu como uma colheita de biocombustível promissor, uma vez que está em rápido crescimento, facilmente propagada por clonagem e altamente adaptável a uma ampla gama de condições climáticas e de solo. Também proporciona uma ampla gama de madeira, fibra, madeira de combustível, e de outros produtos florestais ^5. A árvore de tabaco também surgiu como uma planta adequada para fins de biocombustíveis e biorrefinaria. Ele normalmente produz quantidades substanciais de biomassa, contém grandes quantidades de hidratos de carbono não estruturais ^6, e também tem a capacidade rara para acumular grandes quantidades de óleos não alimentares facilmente extraíveis (incluindo cadeia longa C _{29-C 31} hidrocarbonetos saturados e triterpenóides) que são adequados para o biodiesel produção. A árvore do tabaco é, aliás, passíveis de melhoramento genético, tem alta capacidade de brotação, e cresce em solos feliz semi-áridas não utilizados para a produção de alimentos. Parece, portanto, que tanto álamo e árvore de tabaco têm um potencial intrínseco para multipculturas INALIDADE, ou seja, novas matérias-primas de alto valor para uma indústria de base biológica integrativa. Neste artigo vamos nos concentrar no conjunto diversificado de abordagens para discernir hidrocarbonetos de cadeia como depósitos de árvore de tabaco de comprimento.

Na tentativa de identificar o mecanismo molecular subjacente responsável pela produção e secreção de hidrocarbonetos saturados de cadeia longa nas folhas de tabaco, aplicamos modernos "ômicas" tecnologias baseadas. Isto inclui RNA seq de uma série folha desenvolvimento (dez etapas) e multiplataforma profiling metabólito aproxima usando LC-e GC-MS (para metabolitos polares e não-polares e lipidomics). Estes dados são utilizados para extrair para a expressão do gene que se correlaciona com, ou precede, o início da biossíntese das moléculas acima referidas. Genes e caminhos que parecem promissoras destes empreendimentos será usado para testes funcionais no modelo Arabidopsis espécies e poderia finalmente ser favorável para a engenharia biotecnológica em tobárvore acomodação.

Protocolo

1. Material vegetal

Cultive plantas Nicotiana glauca em vasos 30 centímetros de diâmetro, contendo meio de cultura M2 profissional. Cultivar plantas em estufa, com uma temperatura diurna de 20-25 ° C e a temperatura nocturna de 15 ° C. Use uma luz de 16 horas e ciclo de escuridão 8 horas como regime de luz suplementar.

2. Preparação de Amostras

1. Para metabólitos primários:
   1. Materiais de colheita de plantas (folhas e caules de N. glauca) e material de congelar imediatamente.
   2. Liofiliza materiais vegetais congelados por liofilização durante três dias.
   3. Moer amostras liofilizadas pelo misturador moinho com bolas de metal.
   4. Aliquota solo fino materiais secos para um tubo de centrífuga de 2 ml ou frasco de vidro.
2. Para metabólitos secundários:
   1. Tecidos de plantas de colheita e o material congelar imediatamente.
   2. Moer tecidos vegetais congelados por mmoinho ixer com esfera de aço inoxidável ou almofariz e pilão.
   3. Alíquota finos tecidos moída em 2 ml tubo de ensaio (aproximadamente 20 mg de peso fresco).

3. Protocolo de Extração para Metabolite Profiling para primárias metabolitos por GC-MS

1. Terreno alíquota material vegetal seco (10 mg de folhas e 20 mg de materiais tronco) em 2 ml, tampa de rosca, tubos de fundo redondo.
2. Adicionar 1400 mL de metanol a 100% e de vórtice durante 10 seg.
3. Adicionar 60 ul de Ribitol (0,2 mg imagens / ml em _H2O) como um padrão interno e quantitativa de vórtice durante 10 seg.
4. Adicionar um aço inoxidável (ou zircónio) bola e homogeneizar o material com um moinho misturador durante 2 minutos a 25 Hz.
5. Centrifugar a mistura durante 10 min a 11.000 x g.
6. Transferir o sobrenadante para um frasco de vidro.
7. Adicionar 750 ul de clorofórmio.
8. Adicionar 1500 mL de _H2O e a mistura vortex durante 10 seg.
9. Transferir 150 ul dafase superior (fase polar) em um tubo de 1,5 ml fresco centrífuga.
10. As amostras secas usando uma velocidade vac. É imperativo que as amostras são reduzidas a secura para entre 3 e 24 horas, até que nenhum líquido residual está presente.
11. Adicionar 40 ul de cloridrato de metoxiamina (20 mg / ml em piridina).
12. Agitar a mistura em um bloco agitador horizontal calor durante 2 horas a 37 ° C.
13. Adicionar 70 uL de N-metil-N - (trimetilsilil)-trifluoroacetamida MSTFA mistura.
14. Agitar a mistura durante 2 horas a 37 ° C.
15. Girar as gotas na tampa de uma breve centrifugação ~ 1 min a 11.000 x g.
16. Transferir o líquido em frascos de vidro adequados para a análise de GC-MS.

4. Extraction para o metabolito Profiling para Secundária metabólitos por LC-MS

1. Adicionar 500 mL de metanol para as amostras de solo congelado.
2. Agitar com um termomisturador durante 15 min a 70 ° C (1,000 seg ^-1).
3. Centrifugar as amostras (5 miN, 20.000 xg) e a fase líquida transferida para um tubo de centrífuga de 1,5 ml.
4. Liofiliza-se a fase líquida com um evaporador centrífugo (Speedvac).
5. Adicionar 100 ul de ciclo-hexano e 100 mL de água MilliQ ao sedimento seco.
6. Agitar as amostras durante 5 min a temperatura ambiente (uso de vórtice).
7. Centrifugar as amostras (5 minutos, 20.000 xg).
8. Transferir 80 uL da fase aquosa (fase inferior) para LC-MS frascos de injecção com o fundo cónico para análise por LC-MS.

5. Análise de Dados

1. Configure Xcalibur, MarkerLynx, Metalign ⁷ ou ⁸ XCMS e selecione a análise dos dados a serem processados.
2. Prepara-se uma tabela de picos detectados de seu interesse, de acordo com a classe de compostos na Tabela 1.
3. Identificar picos de co-eluição de compostos padrão.
4. Posteriormente anotar picos detectados através da análise de MSN, algoritmos de caracterização estrutural ^9,10, literatura survey e do metabolito de pesquisa de banco de dados ^11,12.

6. Hidrocarbonetos Extraction ¹³

1. Submergir N. recém-colhida folhas glauca (~ 200 mg) em solvente (metanol, etanol, clorofórmio, hexano ou éter de petróleo (ponto de ebulição 40-60 ° C ou de 60-80 ° C) (5 ml; grau HPLC) de 2 a 20 min.
2. Retire as folhas e secar completamente solventes por evaporação rotativa.
3. Suspenda as amostras em hexano (1 ml; grau HPLC).
4. Realizar análise de GC-MS utilizando cromatografia gasosa e com hífen a um 5973MSD. Condições de funcionamento deve ser a seguinte; gás veículo, hélio com uma velocidade de fluxo de 0,9 ml min ^-1 / 11 psi. Injetar amostras (1 mL) com um injetor splitless a 280 ° C. Segurar o forno de cromatografia gasosa, a 70 ° C durante 5 min antes de acelerar a 4 ° C / min até 320 ° C. Mantenha a temperatura final durante mais 10 minutos, perfazendo um tempo total de 67,5 minutos. Definir a interface com a MS a 280 ° C e perform MS no modo de varredura completa usando 70 eV EI + e digitalizados 10-800 D.
5. Inicialmente processar os componentes cromatograma deconvolution MS automatizado e sistema de identificação, e aqueles que são identificados usando a biblioteca NIST 98 MS.
6. Confirmar a identificação de hidrocarbonetos saturados de comprimento de cadeia de alcano (hexacosenol, nonacosano, triacontano, octacosenol, nonacosonal, hentriacontano, dotriacontane e tritriacontane) por comparação dos tempos de retenção e os padrões de fragmentação clássicos de padrões autênticos conhecidos.
7. Determinar hidrocarbonetos quantitativamente por comparação das áreas de pico integradas, com curvas de resposta à dose (0,07-2,5 mg), construída a partir de padrões autênticos.
8. Calcular médias e erro padrão da média (SEM) utilizando o programa Excel.

7. Análise de isoprenóides ¹⁴

1. Realize homogeneização como descrito na seção 2. Pesar em 10 mg de congelamento homogeneizado pó seco em um tubo de centrífuga.
2. Adicionar sequencialmente 250 ml de metanol para o pó, misture, em seguida, adicione 500 ml de clorofórmio (laboratório de grau reagente), e misture por vórtex.
3. Deixar as amostras em gelo no escuro durante 20 min.
4. Adicionar 250 ml de tampão Tris-HCl (100 mM, pH 7,5) ou água (qualidade HPLC) para a suspensão e misturar por vortex.
5. Centrifugar a mistura a 12.000 rpm (13.523 x g) durante 5 minutos para separar o apolar de fases aquosas. A fase de clorofórmio contendo extractos de isoprenóides não polar é na parte inferior.
6. Transferir a fase para um novo tubo de centrífuga.
7. Adicionar mais 500 mL de clorofórmio adicional para a fase aquosa, e proceder a uma segunda extracção por vórtice e centrifugação como descrito acima.
8. Combinar os extractos de clorofórmio e trazer as amostras até à secura utilizando o evaporador e armazenar a -20 ° C até à análise.
9. Adicionar 50 ml de acetato de etilo (qualidade para HPLC) para o extracto de isoprenóide seco para dissolver o material.
10. Injectar 3 ml num C18coluna, utilizando um módulo de separação de UPLC Acquity. O gradiente utilizado para separar os pigmentos devem incluir; A: metanol / H ₂ 0 (50:50) e B: acetonitrilo / acetato de etilo (75:25), e as condições iniciais deve ser um 30% (v / v) e B de 70% (v / v), indo a 100 % B durante 6 min. Use uma taxa de fluxo de 0,6 ml / min.
11. Monitore o fluido continuamente com uma matriz Foto Diode (PDA) detector 250-600 nm.
12. Identificar os componentes por co-cromatografia e comparações espectrais entre padrões autênticos, betacaroteno (provitamina A), fitoeno, licopeno, luteína e zeaxantina.
13. Realizar a quantificação das curvas de resposta à dose.
14. Confirme compostos utilizando LC-MS; usar condições cromatográficas similares. Detecção deve ser feito utilizando APCI no modo de ionização positiva com um instrumento Q-TOF.
15. Fazer as modificações para a determinação de tocoferol com material seco de 25 mg de congelação que tenha sido extraído e saponificação em 6% de KOH a 50 ° C durante 1,5 horas.

8. Extração de RNA para RNA Seq

Este protocolo combina extração de RNA Trizol com um Kit RNeasy obter RNA de alta qualidade.

1. Moer 100 mg de material vegetal congelado em 2 ml de tubos de centrífuga com uma bola de metal por um moinho misturador.
2. Adicione 1 ml de Trizol.
3. Centrifugar o material durante 10 minutos a 12.000 xg, a 4 ° C.
4. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de reacção.
5. Adicionar 200 ul de clorofórmio, inverter o tubo várias vezes, e incubar 3 minutos à temperatura ambiente.
6. Centrifugar a mistura durante 15 minutos a 12.000 xg, a 4 ° C.
7. Transferir a fase aquosa superior (aproximadamente 700 ul) para um novo tubo de reacção.
8. Adicionar cerca de 2,5 volumes de etanol (100%), inverter o tubo várias vezes, e incubar durante 30 min a -80 ° C.
9. Mova a amostra incluindo qualquer precipitado para a coluna de spin do kit.
10. Centrifugar a coluna por 15 segundos a 8.000 xg, e descartar o fbaixo completamente.
11. Adicionar 700 mL de buffer RW1 à coluna de spin e centrifugar por 15 segundos a 8.000 x g. Descartar o fluxo através.
12. Adicionar 500 mL de buffer RPE para a coluna de rotação e centrifugar a coluna por 15 segundos a 8.000 x g. Descartar o fluxo através.
13. Adicionar 500 ul de tampão de RPE para a coluna de centrifugação e centrifugar durante 2 minutos a 8.000 x g.
14. Colocar a coluna de centrifugação para um novo tubo de reacção de 1,5 mL e adicionar 50 mL de água isenta de RNase.
15. Centrifugar a coluna durante 1 min a 8000 xg para eluir o ARN.
16. Remover DNA residual usando um Kit de free-DNA Ambion acordo com as instruções do fabricante.
17. Determinar a qualidade do RNA. O ARN devem ter números de integridade do RNA (NIR) acima 8.
18. Envie fora do RNA para o sequenciamento de próxima geração.

Resultados

O perfil de HPLC na Figura 1 mostra um resultado representativo da análise isoprenóide de N. extratos de folhas glauca. Os diferentes isoprenóides de C40 e superiores foram detectadas utilizando uma matriz Foto Diode (PDA) detector. Os picos foram anotados com base na co-cromatografia e comparação espectral entre padrões autênticos, betacaroteno (provitamina A), fitoeno, licopeno, luteína e zeaxantina. Os dois cromatogramas MS na Figura 2 mostram o resultado da análise de metabolitos primários de N. folha glauca e caule material, respectivamente. O espectro de MS do pico correspondente a serina (indicado por uma seta) também é dado como um exemplo. Figura 3 mostra o Bioanalyzer usado para determinar a qualidade do RNA e uma saída representativa do dispositivo. Os dois picos principais no cromatograma correspondente a 18 S e 25 S do RNA ribossómico, indicando RNA intacto na amostra. Picos adicionais de costela fragmentadoosomal ARN iria aparecer no caso de ARN parcialmente ou fortemente degradada.

Figura 1. Perfil HPLC mostrando isoprenóides presentes em extratos de folhas de N. glauca. maioria dos isoprenóides de C40 e acima não são passíveis de análise GC-MS. Nós, portanto, utilizados separações por HPLC com detecção por arranjo de diodos. Um cromatograma típico registada a 450 nm é mostrado. Os pigmentos carotenóides são típicas de tecidos fotossintetizantes com luteína predominante. Também presente está a zeaxantina, que raramente é encontrado em tecidos foliares, a menos sob alto estresse luz. Os níveis de zeaxantina torná-lo uma boa fonte deste composto de alto valor. Clique aqui para ver uma maior versão desta figura.

Figura 2. Cromatograma MS e espectro de N. extratos de tecidos glauca. total de íons MS cromatograma (TIC) de folhas e caule extratos medidos por GC-MS é apresentada (70-600 m / z). A análise de GC-MS foi realizada como descrito anteriormente, em ^15. Picos detectados foram anotados utilizando a biblioteca de etiquetas espectrais de massa. Espectro de massa de serina (2TMS) é mostrada como um exemplo. MS cromatograma: eixo X e eixo Y indica o tempo de retenção (min) e da intensidade (abundância) do sinal, o espectro de MS: eixo X e eixo Y indicam as proporções M / Z ea intensidade (abundância) do sinal, respectivamente. Clique aqui para ampliarimagem.

Figura 3. Medição Bioanalyzer de ARN preparado para RNA de N. SEQ material de folhas de glauca. Para obter o RNA altamente pura necessária para o RNA extraído nos seguintes ARN usando reagente Trizol e depois purificou-se o ARN utilizando as colunas do RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha). Determinou-se a qualidade do RNA utilizando o Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Alemanha) apresentada à esquerda. Um exemplo de uma saída Bioanalyzer é dada na direita. Os dois picos principais da amostra representam 18 S e 25 S ribossomal RNA. A nossa amostra apresentou um número de integridade do RNA (RIN) de 9,2, o que é bem acima do valor exigido de 8. Clique delaE para ver imagem ampliada.

Discussão

Os protocolos apresentados aqui fornecem um quadro global para analisar as folhas da árvore de tabaco para metabolitos e transcrições. Prevê-se que estes esforços combinados devem nos fornecer novas perspectivas sobre os processos subjacentes à síntese e extrusão de hidrocarbonetos e de compostos de elevado valor presentes neste tecido. Essas abordagens devem, portanto, dar-nos uma melhor compreensão de como os compostos estão sendo sintetizados. Além dos aspectos de árvore de tabaco do trabalho, também tem como objetivo melhorar a biomassa álamo, especialmente dirigidas lignificação da estrutura da parede secundária, mas também para explorar se podemos usar a casca para a extração de compostos valiosos.

Os métodos apresentados neste trabalho são pequenas modificações de métodos padronizados para metabólito perfil. Estes métodos são, naturalmente, limitado a perfis metabólicos conhecidos, e é possível que vários picos novos metabólicos pode ser obtido por which nenhum composto é conhecido. Esperamos colocar esses compostos no contexto de outros metabolitos, combinando o comportamento dos metabólitos e transcrições sobre a série de tempo de desenvolvimento.

Nenhum dos métodos aqui apresentados são significativamente alterada de métodos geralmente utilizados para materiais de origem vegetal. O aspecto interessante é a combinação de métodos de compreender a estrutura subjacente para a produção de uma cadeia de hidrocarboneto longa e, principalmente, a modificação nas folhas da árvore de tabaco. Um dos passos fundamentais para a obtenção dessas informações é a combinação posterior dos diferentes tipos de dados. Nós prevemos que os dados como uma primeira avaliação será dividida em diferentes grupos com base no comportamento dos metabolitos / transcrições sobre o desenvolvimento e que esses dados serão utilizados para inferir transcrição vs comportamentos metabólitos, e também para atribuir potencialmente certos metabólitos de vias . Além disso, as análises baseadas em rede mais elaborados são, então, imaginou to explorar relações causais.

Os protocolos analíticos aqui apresentados também irá fornecer uma base para o campo de ensaios e de exploração industrial da biomassa. Para conseguir isso, o consórcio MultiBioPro contém vários parceiros industriais que têm as habilidades para continuar a explorar a biomassa, com o objetivo de entregar o biodiesel, o bioetanol e de outros compostos de alto valor. Estes tipos de exploração da biomassa será avaliada com base em; (1) testar a robustez e qualidade dos produtos biológicos produzidos (testes padrão da indústria típicas serão realizadas para garantir que os produtos gerados têm um bom valor de mercado), (2), uma avaliação econômica, social e ambiental das tecnologias será realizada utilizando fontes bibliográficas, entrevistas e material que é gerado durante os ensaios de campo e avaliações de biorrefinaria de plantas piloto. Estas actividades incluem o custo benefício e análise do ciclo de vida, a geração de um dossiê ambiental e de mercado e Busineestratégias ss. Acreditamos que este gasoduto vai se tornar uma mistura útil de academia, ciência aplicada e da exploração industrial de mais biomassa álamo e tabaco para produtos finais de consumo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente Trizol	Invitrogen	15596-026
Clorofórmio	Merck	102445
Etanol	Merck	101986
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
TURBO Dnase	Invitrogen	AM2238
RNA 6000 Nano Kit	Agilent	G2938-90034
2100 Bioanalisador de eletroforese	Agilent	G2939AA
tubos de trava segura de 1,5 ml e 2 ml	Eppendorf	0030 120.086, 0030 120.094
Esferas de aço	Geyer Berlin GmbH	VA2mm
Moinho misturador MM 300	Retsch	YO-04182-09
Microcentrífuga	Eppendorf	5424