Métodos são descritos para-cromatografia em camada delgada (TLC) separação de extratos de plantas e contatar bioautografia para identificar metabólitos antibacterianos. Os métodos são aplicados para o rastreio de compostos fenólicos de trevo vermelho que inibem bactérias produtoras de amoníaco hiper (HAB) nativas para o rúmen de bovinos.
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Artigo de método
Cromatográfica em camada delgada (TLC) Separações e Bioensaios de extratos de plantas para identificar compostos antimicrobianos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Um ecrã comum para compostos anti-microbianos de plantas consiste na separação dos extractos de plantas por papel ou por cromatografia em camada fina (TLC ou PC), expondo os cromatogramas para as suspensões microbianas (por exemplo, fungos e bactérias em caldo ou ágar), dando tempo para que os micróbios a crescer em um ambiente úmido e visualizar zonas sem crescimento microbiano. A eficácia deste método de rastreio, conhecido como bioautografia, depende tanto da qualidade da separação cromatográfica e os cuidados com as condições de cultura microbiana. Este artigo descreve os protocolos padrão para TLC e bioautografia contato com uma nova aplicação de aminoácidos bactérias fermentadoras de ácido. O extrato é separado em flexíveis (lastreados em alumínio) placas de sílica TLC, e bandas são visualizados sob luz ultravioleta (UV). As zonas são cortadas e incubadas a face para baixo em ágar inoculado com o microrganismo teste. Bandas de inibição são visualizadas por coloração da placa de ágars com tetrazólio vermelho. O método é aplicado para a separação de trevo vermelho (Trifolium pratense cv. Kenland) compostos fenólicos e seu rastreio quanto à actividade contra Clostridium sticklandii, uma bactéria produtora de amoníaco hiper (HAB) que é nativo ao rúmen de bovinos. Os métodos de TLC aplicar a vários tipos de extractos de plantas e outras espécies bacterianas (aeróbicas ou anaeróbicas), bem como fungos, podem ser usados como organismos de teste, se as condições de cultura são modificados para se ajustar aos requisitos de crescimento das espécies.
Introdução
Ensaio para compostos anti-microbianos em plantas requer a separação dos componentes de um extracto de planta, a exposição de um microorganismo de teste para os componentes, e determinar se o crescimento do microorganismo é inibida por qualquer um dos compostos. Separações por papel ou por cromatografia em camada fina (TLC ou PC) é conveniente, porque muitos compostos podem ser separados sobre uma superfície plana. A separação baseia-se na polaridade, com a ligação de alguns compostos estreitamente ao adsorvente (celulose, no caso de PC, e uma variedade de adsorventes em caso de TLC) e a migração de menos do que os outros 1. Figura 1 forne....
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Protocolo
1. Preparação de Extrato vegetal
- Veja Kagan e Flythe 10 para a extração de compostos fenólicos de Trifolium pratense cv. Kenland.
- Para extrair outros compostos em outras plantas, veja a literatura análise fitoquímico por métodos de extracção de plantas ou específica do metabolito (muitos estão descritos), ou olhar para protocolos, tais como aqueles de Khurram et al. 7,8 que isolam diversos compostos com uma vasta gama de polaridades.
2. Preparação das placas de camada fina
- Limpo placas de TLC de desenvolver em um ou mais solventes polares, neutras, a fim de move....
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Resultados
Representante separações sílica TLC de trevo vermelho (Trifolium pratense cv. Kenland) extratos contendo compostos fenólicos, são mostrados na Figura 2. Separação do extracto de trevo vermelho em acetato de etilo-hexano (9:1, v / v), mais de 8,5 centímetros, resultou em cinco bandas, uma incompletamente resolvidos a partir da origem (Figura 2A). No entanto, a Figura 2B mostra que cerca de duas vezes mais bandas foram revelados quando uma amostra diferente de ex.......
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Discussão
Este protocolo descreve um método simples para a separação de um extrato em subconjuntos de compostos e ensaiando esses subconjuntos por contato bioautografia. O método é bastante semelhante ao utilizado por 15 Chomnawang et al. Seleccionar para os metabolitos de plantas inibidoras para as bactérias causadoras de gonorreia. O tipo de bioautografia empregues para o rastreio de compostos anti-microbianos de plantas depende de muitos factores, incluindo o microorganismo de teste, a configuração de labor.......
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Divulgações
A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais no artigo é apenas para a finalidade de fornecer informações específicas e não implica recomendação ou endosso pelo USDA. Os autores declaram que não há interesse financeiro concorrente.
Agradecimentos
Agradecemos ao falecido Dr. Norm Taylor, Departamento de Plantas e Ciência do Solo da Universidade de Kentucky, por nos permitir usar amostras de suas tramas trevo vermelho para este estudo. Este projeto foi financiado pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placas de sílica F254 TLC, com suporte de alumínio, espessura de 0,2 mm, 20 cm x 20 cm | EMD Chemicals | 5554/7 | Estas placas são revestidas com sílica que contém um indicador fluorescente a 254 nm. Os compostos que absorvem nesse comprimento de onda aparecem escuros em um fundo verde fluorescente. Fontes alternativas incluem Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Podem ser necessários outros adsorventes além da sílica. Placas com suporte de plástico podem ser adequadas, dependendo dos solventes a serem usados. |
| Tesouras afiadas e pesadas | qualquer empresa de suprimentos de costura | semelhante à Fiskars 175800-1002 | Para cortar chapas TLC. Um cortador de papel com uma lâmina afiada também pode ser usado. Não inale pó de sílica. |
| Estufa de secagem a 100 > C (convecção mecânica) | Thermo Scientific | PR305225M | Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com) |
| TLC chamber | Kimble Chase | 416180-0000 | Fontes alternativas: Aldrich. Copos de pirex ou potes de preservação podem ser usados para pratos pequenos (ou seja, 5 cm x 10 cm). Cubra com papel alumínio (as tampas dos frascos podem conter material extraível por vapores de solvente). |
| 50 µ l Seringa com ponta de agulha plana | Hamilton | 80965 | Para carregar quantidades de padrão ou amostra superiores a 5-10 µl. Fontes alternativas são equivalentes. |
| Micropipetas | Drummond | 2-000-001 | Para carregar pequenas quantidades de padrões ou amostras. Fontes alternativas: VWR. Além disso, as pipetas Pasteur podem ser esticadas para um diâmetro mais fino com uma tocha de butano. |
| Papel de filtro (grau #1) | Whatman | 1001 917 | Serve como um pavio de câmara. Outros tipos de papel de filtro são OK. Este tamanho pode ser cortado para as câmaras que comportam placas de 20 cm x 20 cm. |
| Pinças de copo | Fisher Scientific | 15-186 | Para colocar placas dentro e fora de uma grande câmara TLC. Fontes alternativas: VWR |
| Pinça de borda plana | Fisher Scientific | 10-275 | Para colocar placas dentro e fora de uma pequena câmara. Fontes alternativas: VWR |
| Lâmpada UV portátil pequena com lâmpadas de 4 W ou 6 W para iluminação de luz UV de ondas curtas e longas (254 e 365 nm, respetivamente) | Produtos ultravioleta | 95-0271-01 | Fontes alternativas: Spectronics Corporation (www.spectroline.net) |
| Armário de visualização para utilização com lâmpada UV portátil | Produtos Ultravioleta | Chromato-Vue C-10E | As bandas ativas de UV são mais facilmente circuladas se as placas puderem ser colocadas aqui. Fontes alternativas: Spectronics Corporation. |
| Sistema de fotodocumentação com lâmpada UV suspensa e lâmpada visível | Kodak | Gel Logic 200 | Fontes alternativas: Produtos Ultravioleta (www.uvp.com). Veja o protocolo para alternativa caseira. |
| Câmara Anaeróbica, Tipo A, Vinil | Coy | 7150000 | Esta câmara é apropriada para bactérias anaeróbicas, como Clostridium sticklandii, conforme descrito. No entanto, as condições de crescimento devem ser adaptadas ao organismo usado no ensaio. Um gabinete de biossegurança e outras precauções devem ser tomadas se forem usados organismos patogênicos. Fontes alternativas: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, outros |
| Vermelho de tetrazólio | Sigma-Aldrich | T8877 | Fontes alternativas: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar |
| Ingredientes para meio HAB | |||
| Pyridoxamine · 2HCl | Sigma-Aldrich | P9380 | Para este e para todos os outros reagentes nesta tabela, fontes alternativas são equivalentes. |
| Riboflavina | Sigma-Aldrich | R4500 | |
| Tiamina HCl | Sigma-Aldrich | T3902 | |
| Nicotinamida | Sigma-Aldrich | N3376 | |
| D-pantotenato de cálcio | Sigma-Aldrich | C8731 | |
| Ácido Lipóico | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| ácido p-aminobenzóico | Sigma-Aldrich | A9878 | |
| Ácido fólico | Sigma-Aldrich | F8798 | |
| Biotina | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Cobalamina | Sigma-Aldrich | C3607 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P9130 | |
| Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P5669 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Sulfato de ferro · 7H2O | Sigma-Aldrich | F8263 | |
| Sulfato de zinco · 7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| Cloreto de manganês · 4H2O | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| Ácido bórico | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cloreto de cobalto · 6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Cloreto de cobre · 2H2O | Sigma-Aldrich | ||
| Cloreto de níquel · 6H2O | Sigma-Aldrich | 203866 | |
| Molibdato de sódio · 2H2O | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Tripticase (digestão pancreática da caseína) | Thermo Fisher | B11921 | |
| Fosfato de potássio monobásico anidro | Thermo Fisher | P284 | |
| Carbonato de sódio & middot; H2O | Thermo Fisher | S636 | |
| Agar | Thermo Fisher | 50841063 | |
| Sulfato de magnésio & 6H2O | Thermo Fisher | 7791-18-6 | |
| Cloreto de cálcio · 2H2O | Thermo Fisher | BP510 | |
| Cisteína HCl | Thermo Fisher | 19464780 | |
| Potássio fosfato dibásico anidro | Thermo Fisher | P290 | |
| Cloreto de sódio | Thermo Fisher | BP358 |
Referências
- Stahl, E., Ashworth, M. R. F. Thin-layer chromatography. , Springer. (1969).
- Marston, A. Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry. J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 Forthcoming.
- Homans, A. L., Fuchs, A.
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Reimpressões e permissões
