Proteômica quantitativa utilizando redutora dimetilação para Stable Isotope Labeling

Summary

Rotulagem de isótopos estáveis ​​de peptídeos por dimetilação redutora (rotulagem Redi) é uma estratégia rápida e barata para proteômica precisos baseados em espectrometria de massa quantitativos. Aqui demonstramos um método robusto para a preparação e análise de misturas de proteínas, utilizando a abordagem de Redi que pode ser aplicado a quase todos os tipos de amostra.

Abstract

Rotulagem isótopo estável de péptidos por dimetilação redutiva (marcação Redi) é um método para quantificar com precisão as diferenças entre as amostras de expressão de proteínas utilizando espectrometria de massa. Rotulagem Redi é realizada usando regular (luz) ou deuterados formas (pesados) de formaldeído e sódio cianoborohidreto para adicionar dois grupos metil para cada amina livre. Aqui demonstramos um protocolo robusto para a rotulagem Redi e comparação quantitativa de misturas complexas de proteínas. As amostras de proteínas para comparação são digeridas em péptidos, rotuladas para transportar a luz ou etiquetas de metilo pesados, misturados, e co-analisados ​​por LC-MS/MS. Abundância relativa de proteína são quantificados por comparação de áreas de pico do cromatograma de iões de versões marcadas pesadas e leves do péptido constituinte extraído da MS espectro completo. O método descrito aqui inclui a preparação de amostras por extração em fase sólida de fase reversa, Redi rotulagem na coluna de peptídeos, peptídeos fracionamento por rev básico pHfase ersed (BPRP) cromatografia, e StageTip purificação peptídica. Discutimos vantagens e limitações de rotulagem Redi em relação a outros métodos de incorporação de isótopos estáveis. Destacamos novas aplicações usando rotulagem Redi como um método rápido, barato e preciso para comparar a abundância de proteínas em quase qualquer tipo de amostra.

Introduction

Medindo diferenças de concentração de muitas proteínas entre as amostras complexas é um desafio central em proteômica. Cada vez mais, isso é feito através da marcação de proteínas de cada uma das amostras com diferentes marcações isotópicas, combinando as amostras, e por espectrometria de massa para quantificar as diferenças de concentração. Existem vários métodos para a marcação isotópica estável de proteínas e peptídeos. ^15N rotulagem ¹ e ² SILAC introduzir marcadores isotópicos metabolicamente in vivo, ao passo que iCAT ^3, iTRAQ ^4, e redução dimetilação ⁵ adicionar tags de isótopos estáveis....

Protocol

NOTA: Este método foi descrito anteriormente ^12.

1. Isolamento de Proteínas

Prepare 1 mg de proteína celular por lise das células, de preferência, por meio de métodos físicos, tais como a prensa francesa, grânulo batimento, ou de ultra-sons. Evitar a lise celular mediada por lisozima porque a enzima irá confundir medições de espectrometria de massa.

2. Precipitação de TCA de Proteínas

Adicionar 1 volume de ácido tricloroacético (TCA) a proteína de 4 volumes e frio em gelo durante 10 min para precipitar as proteínas. Centrifugar a 12.000 xg durant....

Results

Avaliou-se a exatidão, precisão e reprodutibilidade de rotulagem Redi usando Saccharomyces cerevisiae e Clostridium phytofermentans lisados ​​de células inteiras. Primeiro, quantificou o Redi eficiência de marcação de uma mistura de C. phytofermentans lisados ​​de proteína a partir de celulose (pesado marcado, H) e glicose (rótulo de luz, L) culturas. Quando filtrada para uma taxa de falsa descoberta peptídeo 1%, esta amostra continha 11.194 sequências de peptídeos exclusivos com um 98% de efi.......

Discussion

Vários pontos tornar a rotulagem de isótopos estáveis ​​de peptídeos usando um método atraente para proteômica quantitativa dimetilação redutora (rotulagem Redi): reagentes baratos de rotulagem (reagentes custam menos de US $ 1 por amostra), a taxa de reação rápida (~ 10 min), ausência de produtos secundários, altas reprodutibilidade (Figuras 3, 4), produtos de reacção estáveis, capacidade de usar qualquer protease, e alta eficiência de ionização de peptídeos identificados. Marcação química por Redi tam.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ácido tricloroacético	Sigma-Aldrich	T9159	Precipitação
de 650501	de acetona	Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich
		71736	desnaturar, reduzir a proteína
Hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich	S8045	desnaturar, reduzir a proteína
DL-Ditiotreitol	Sigma-Aldrich	43816	desnaturar, reduzir, alquilar proteína
Inibidor de Protease Mini Cocktail Completo	Roche	4693124001	desnaturar, reduzir a proteína
Iodoacetamida	Sigma-Aldrich	I6125	proteína alquilada
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523	ressuspender, extrair, rotular proteína
Cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich	C5670	ressuspender proteína
Lysyl Endoprotease	Wako Chemicals	129-02541	digestão de proteínas
Tripsina de grau de sequenciamento	Promega	V5111	digestão de proteínas
Ácido acético	Sigma-Aldrich	320099	digestão de proteínas
Ácido trifluoroacético	Sigma-Aldrich	299537	Extração de peptídeos de fase reversa
tC18 Sep-Pak C18 cartuchos	Waters	WAT054960	Extração de peptídeo de fase reversa
Coletor de extração	Águas	WAT200609	Extração de peptídeo de fase reversa
Acetonitrila	Sigma-Aldrich	14261	vários
Formaldeído	Sigma-Aldrich	252549	" luz" marcação de peptídeo
Cianoborohidreto	Sigma-Aldrich	71435	" luz" marcação de peptídeos
Formaldeído deuterado	Sigma-Aldrich	492620	" pesado" marcação de peptídeos
Isótopos CDN	cianobororodeuterídeo sódico	D-1797	" pesado" marcação de peptídeos
MES	Sigma-Aldrich	M3671	coluna de marcação de peptídeos
C18-HPLC (4,6 x 250 mm, 5 µ m tamanho de partícula)	Agilent	770450-902	cromatografia de fase reversa de pH básico
Ácido fórmico	Sigma-Aldrich	399388	vários
discos C18 Empore	3M	14-386-3	Dicas de PALCO
Metanol	Sigma-Aldrich	494437	dicas STAGE