Segmentação células cerebrais residente linhagem-reprogramação direta oferece novas perspectivas de reparação do cérebro. Aqui nós descrevemos um protocolo de como preparar culturas enriquecido para pericitos cerebrais residente do córtex cerebral humano adulto e convertê-las em neurônios induzidos pela expressão mediada por retrovírus de fatores de transcrição Sox2 e Ascl1.
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Artigo de método
Lineage-reprogramação de células pericyte derivados do Adulto Cérebro Humano em neurônios induzidos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Direto linhagem-reprogramação de células não-neuronais em neurônios induzidos (INS) pode fornecer insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes a neurogênese e permitir novas estratégias de modelagem in vitro ou a reparar o cérebro doente. Identificar os tipos de células não-neuronais do cérebro residente passíveis de conversão direta em iNs pode permitir o lançamento de uma tal abordagem in situ, ou seja, dentro do tecido cerebral danificado. Aqui, descrevemos um protocolo desenvolvido na tentativa de identificar células derivadas de cérebro humano adulto que cumprir esta premissa. Este protocolo envolve: (1) a cultura de células humanas a partir do córtex cerebral obtido a partir de biópsias de cérebro humano adulto; (2) a expansão in vitro (aproximadamente exigindo 2-4 semanas) e a caracterização da cultura, por imunocitoquímica e citometria de fluxo; (3) o enriquecimento de células activadas por fluorescência (FACS) utilizando anticorpos anti-PDGF receptor β e os anticorpos anti-CD146;(4) a transdução mediada por retrovírus com a transcrição neurogénica factores sox2 e ascl1; (5) e, finalmente, a caracterização dos neurónios resultantes derivados de pericitos induzidas (PdiNs) por imunocitoquímica (14 dias a 8 semanas após a transdução retroviral). Nesta fase, ins podem ser sondado por suas propriedades elétricas por gravação patch-clamp. Este protocolo fornece um procedimento altamente reprodutível para a conversão linhagem in vitro de pericitos cerebrais residente em iNs humanos funcionais.
Introdução
Ao contrário de reprogramação de células somáticas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), que por sua vez são dotados de uma infinidade de potenciais de diferenciação, reprogramação direta visa a conversão direta de um tipo específico de célula para outra. No que diz respeito à sua aplicação no contexto de modelagem de doenças e terapias baseadas em células potenciais, ambas as abordagens de reprogramação têm vantagens e desvantagens específicas. Reprogramação em iPSCs (i) fornece uma fonte virtualmente infinita de células; (Ii) permite a engenharia genética; (Iii) dota com um potencial de diferenciação quase ilimitada. No entanto, as principais desvantagens de iPSCs implicar o risco de tumorigenicidade das células indiferenciadas (formação de teratoma, in vivo) e a necessidade de cultivo ex vivo e subsequente transplante se estas células são para ser utilizadas para as terapias à base de células. Por outro lado, a linhagem-reprogramação directa é limitada pelo baixo rendimento das células desejadaso que se correlaciona directamente com o número de células alvo a partir da população, mas possui a vantagem de que as células da linhagem reprogramado parecem apresentar qualquer risco tumorigénico mediante transplante 1,2; Além disso, a reprogramação directa pode mesmo ser alcançado in situ, ou seja, dentro do órgão onde seriam necessários estas células, evitando assim a necessidade de transplante.
Com isto em mente, o nosso laboratório tem buscado a possibilidade de células cerebrais residente reprogramação de linhagem em iNs como uma nova abordagem para terapias à base de células de doenças neurodegenerativas. As células do cérebro residente que pode ser potencialmente considerados alvos celulares para linhagem-reprogramação compreendem diferentes tipos de macroglia (astrócitos, células NG2 e oligodendrócitos), microglia e células-associados microvasos (células endoteliais e pericitos). Temos estudado extensivamente o potencial de reprogramação in vitro de astroglia da cor cerebraltex de início de ratos pós-natal 3-5. Em busca de fontes de células semelhante adequados para linhagem-reprogramação direta no cérebro humano adulto, encontramos uma população de células que podem ser reprogramadas com sucesso em ins e marcas de exposição de pericitos. Aqui, descrevemos um protocolo de como a colheita destas células a partir de biópsias de cérebro de seres humanos adultos, para expandir e enriquecer as células, in vitro, e, finalmente, reprogramar com êxito uma fração substancial destas células in vitro expandido (no intervalo de 25-30%) em ins. A reprogramação pode ser alcançado por co-expressão simultânea mediada por retrovírus de dois factores de transcrição, e sox2 ascl1. Estes PdiNs foram encontrados para adquirir a capacidade de ação repetitiva potencial de queima e de servir como alvos sinápticas para outros neurônios, indicando a sua capacidade de integração em redes neurais. Nosso protocolo fornece um procedimento simples para a conversão de isolamento e linhagem de pericitos cerebrais humanas adultas em Ins.
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Protocolo
1. Isolamento e cultura de células adultas do cérebro humano
Experimentos envolvendo tecido humano deve ser realizado em conformidade com todas as regulamentações governamentais e institucionais relevantes em relação ao uso de material humano para fins de pesquisa. O presente protocolo foi desenvolvido de acordo com a aprovação do comitê de ética da Faculdade de Medicina da LMU de Munique e consentimento informado por escrito de todos os pacientes.
Este protocolo de preparação de culturas do adulto córtex cerebral humano foi estabelecida utilizando amostras de pacientes de ambos os sexos que sofrem de epilepsia do lobo temporal ou outras lesões profundas não traumáticas, não-malignas. O tecido obtido a partir da sala de cirurgia, composto exclusivamente o canal de acesso à lesão cerebral e, portanto, é considerado saudável. A faixa etária dos pacientes foi de 19-70 anos.
- Preparar o meio de crescimento por adição de soro fetal de vitelo inactivado pelo calor(FCS) para DMEM de alto teor de glucose com GlutaMAX para obter uma concentração final de 20% de FCS. Adicionar 5 mL de penicilina / estreptomicina a um total de 500 ml de meio de crescimento. Realize esta e todas as etapas subseqüentes que requerem condições de cultura estéreis em uma capela de fluxo laminar adequada.
- Manter a biópsia do cérebro humano adulto obtido a partir da sala de operações, em solução salina equilibrada de Hanks com CaCl 2 e MgCl 2 (HBSS) médio incluindo HEPES (10 mM, concentração final) em gelo, até que o processamento. Iniciar o processamento, logo que possível.
- Para iniciar a dissociação em células individuais, a transferência do tecido para dentro de uma placa de petri de 65 milímetros e mediu-se em pequenos pedaços, utilizando dois bisturis estéreis de uso único. Para a digestão enzimática usar 3-6 ml TrypLE em um tubo de 15 ml e incubar durante 15-30 minutos a 37 ° C em um banho de água.
- Adicionar 1 volume de meio de crescimento pré-aquecido para facilitar a dissociação e tritura-se suavemente a solução contendo pedaços de tecido para cima e para baixo usando primeiro5 uma pipeta descartável ml, seguido usando uma pipeta de Pasteur de vidro, até a homogeneização da suspensão de células. Tipicamente, alguns pedaços de tecido residual, que consistem principalmente de matéria branca, irá permanecer em suspensão.
- Girar a 157 xg durante 5 min e ressuspender o sedimento na quantidade apropriada de meio de crescimento (10 ml por frasco de cultura T75 não revestido). Use uma garrafa de cultura T75 para uma biópsia de 5-10 mm de diâmetro em tamanho e extrapolar isso no caso de espécimes maiores.
- Colocar as células em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO2 e 5% de O2.
- Substituir metade do meio em cada 3-4 dias até que as células atingiram a confluência. Isso normalmente leva até duas semanas (chamados de passagem 0 [P0]).
2. Expansão in vitro e caracterização de células adultas do cérebro humano
- Em expansão in vitro:
- Aspirar o meio de cultura e lava-se com solução salina tamponada com fosfato (PBS), mantidas à temperatura temperature, antes de acrescentar 3 ml TrypLE.
- Incubar a 37 ° C, durante 5-10 min, até que a maioria das células independente. Bata levemente os frascos para facilitar o levantamento das células; após a adição de 3 volumes de meio de crescimento, a transferência das células para um tubo de 15 ml e girar a 157 xg durante 5 minutos e voltar a suspender as células na quantidade apropriada de meio de crescimento.
- Passagem das células a uma razão de 1:3 para o rendimento óptimo em novos frascos de cultura de células T75.
Nota: Nós passadas estas células até P5 sem quaisquer sinais de redução da eficiência de reprogramação. Enquanto no P0 a cultura contém uma fracção considerável de células endoteliais (como avaliado por expressão de CD34), em passagens subsequentes o seu número torna-se insignificante.
- Caracterização de culturas de cérebro de seres humanos adultos:
- Imunocitoquímica:
- Para caracterização das células, sementes ~ 60.000 células em poli D-revestido-lisina-tampa de vidro desliza em 500 mL fresco mediu o crescimentom em placas de 24 cavidades de cultura de tecidos e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 e 5% de O2.
- Para análise imunocitoquímica das células cerebrais humanas cultivadas remover o meio e lava-3x com 1 ml de PBS.
- Fixar as células por adição de 500 uL de paraformaldeído a 4% em PBS durante 15 min à temperatura ambiente.
- Transferir a tampa de vidro desliza numa câmara humidificada a coloração adequada e bloquear com 80 ul de PBS contendo 3% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,5% de Triton X-100 durante 1 hora à temperatura ambiente.
- Adicionar anticorpos primários diluídos na mesma solução para os factores de diluição (ver tabela de reagentes e equipamentos específicos) e incubar durante a noite a 4 ° C ou 1 hora a temperatura ambiente.
Nota: Uma fração substancial mas variando de células na sua fase de cultivo são imunorreactivos para crescimento β receptor do factor derivado das plaquetas (PDGFRβ), aglomerado de diferenciação 146 (CD146), NG2 sulfato de condroitina proteoglicanos e actina de músculo liso (SMA), ou seja, marcadores característicos de pericitos associados-microvasos. Apenas uma minoria (<1%) expressam os marcadores astrogliais proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e S100β. Além disso, nesta fase, a cultura deve ser desprovida de quaisquer células que expressam o marcador neuronal βIII-tubulina. Use várias combinações de anticorpos primário para co-rotulagem de marcadores diferentes. Outra confirmação da expressão de marcadores gliais, neuronais, endoteliais e pericitos pode ser obtido por transcrição reversa e em tempo real da reacção em cadeia da polimerase quantitativa (não descritas neste protocolo). - Após a incubação com os anticorpos primários lavar três vezes com 1 ml de PBS e adicionar os anticorpos secundários correspondentes (em diluições apropriadas) para a solução de coloração e incubar 1 hora à temperatura ambiente no escuro. Lave as células 3x com PBS. Se necessário, antes da montagem incluir a coloração com DAPI, durante 5 min a salatemperatura.
- Use antifading meio de montagem e analisar as lamínulas usando um microscópio de epifluorescência ou um microscópio confocal.
- Citometria de fluxo:
- Para análise de expressão do marcador de superfície utilizando citometria de fluxo, as células crescer até à confluência em T25 T75 não revestidos ou frascos de cultura de células.
- Separar as células usando TrypLE como descrito antes e ressuspender em solução de coloração que consiste em PBS + BSA a 0,5%. Por reacção de coloração, ressuspender 100.000-200.000 células em 100 ul de solução de coloração. Prepare reações de coloração individuais por anticorpo utilizado (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, os anticorpos isotipo controle respectivas).
- Adicionar anticorpos fluorocromo-conjugados com cada solução de coloração (por diluições ver tabela de reagentes e equipamentos específicos) directamente para a suspensão de células e incubar a 4 ° C durante 30 minutos no escuro.
- Lave as células três vezes com 500 mL PBS e girar entre cadapasso de lavagem a 157 g durante 5 min.
- Ressuspender o sedimento celular em 0,5-1 ml de solução de coloração e de transferência de células através de um coador de células (70 mM) para tubos FACS. Proteger a amostra da exposição à luz.
- Amostras Vortex antes de colocá-los no instrumento FACS.
- Para analisar as células vivas e excluir detritos celulares e agregados, portão para FSC-A e SSC-A. Dupletos celulares são especificamente fechado pelo FSC-A e FSC-W. Para determinar as condições de propagação certas para os marcadores de superfície celular estabelecidos os portões com controle de anticorpo de isotipo conjugado com o respectivo fluorocromo. Em seguida, determinar a proporção de células ligadas a anticorpos.
- Imunocitoquímica:
3. Enriquecimento de células pericyte derivados por fluorescência celular ativado Classificando
- Purifica-se a população de células pericitos (ressuspensas em meio de crescimento), antes de transdução através de separação FACS usando um bico de 70 um. Use CD34-APC, em combinação com o CD140b-PE e CD146-FITC selecionar para pericitos. Classificar por, células-CD140b e CD146-CD34 positivo-negativo.
- Recolher as células seleccionadas em meio de crescimento e placa sobre poli-D-lisina-revestidas tampa de vidro desliza em placas de cultura de tecidos de 24 poços e incuba-se a 37 ° C com 5% de CO2 e 5% de O2.
- 48 h após triagem substituir o meio com meio de crescimento fresco e realizar a transdução, conforme descrito no Protocolo no 4.
4. Retroviral transdução de células pericyte derivados e Reprogramação em neurônios induzidos
Nota: Consulte as diretrizes de biossegurança locais ao manipular partículas retrovirais. Na Alemanha, o uso dos retrovírus empregadas aqui requerem nível de biossegurança 2. Para a produção de partículas retrovirais consulte protocolo 6. Para construções retrovirais utilizados para a reprogramação, referem-se a Karow et al. (2012). Os retrovírus foram pseudotipados com VSV-G (vírus da estomatite vesicular-glicoproteína) 5. Para a produção consulte Gavrilescu et al 6.
- 24 h antes da semente de transdução retroviral ~ 60.000 células nas poli-D-lisina-revestidas tampa de vidro desliza em 500 ul de meio de crescimento fresco, em placas de 24 poços de cultura de tecidos e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 e 5% de O2 .
- No dia seguinte, substituir o meio de crescimento com 500 mL fresco, meio de crescimento pré-aquecido e adicionar 1 ml dos respectivos sobrenadantes concentrados contendo partículas retrovirais (pCAG-IRES-DsRed para o controle, especialmente durante o estabelecimento do protocolo no laboratório), pCAG-ascl1 -IRES-DsRed, pCAG-sox2-IRES-GFP.
- Um dia mais tarde, remover o meio, incluindo as partículas virais a partir das células e adicionar 1 ml de fresco, pré-aquecido de meio B27-diferenciação, composta por 49 ml de DMEM com alto teor de glucose GlutaMAX e 1 ml de suplemento de B27 isento de soro. Manter as células em cultura a 37 ° C em 5% De CO2 e 5% de O 2 durante 4-8 semanas, sem alterar o meio como as mudanças de meio repetitivas tornar prejudiciais como iNs amadurecer.
5. Caracterização de neurónios induzida por imunocitoquímica
- Para determinar a identidade celular das células transduzidas, em particular, para demonstrar a aquisição do fenótipo neuronal, realizar imunocitoquímica contra antigénios neuronais, tais como BIII-tubulina, MAP2, e NeuN (para os anticorpos e as respectivas diluições, ver tabela de reagentes específicos e Equipamento; seguem o mesmo procedimento como indicado em 2.2.1).
- Para melhorar a maturação de PdiNs, co-cultura destas células com os neurônios derivados de E14 rato córtex cerebral. Para este fim, dissecar o córtex cerebral e dissociar o tecido mecanicamente com uma pipeta Pasteur de vidro polido ao fogo. Adicionar 10,000-50,000 neurónios murino para as culturas de células derivadas de pericitos 2-3 semanas a seguir a transdução com SOX2 e ascl1 codificam retroviruses e continuar cultivo. As células transduzidas podem ser distinguidas a partir de neurónios de murino por sua repórter (GFP e dsRed) expressão, quer por epifluorescência vivo ou após a imunocitoquímica para GFP e dsRed.
- Para avaliar a formação de sinapses para PdiNs por neurônios murino, realizar imunocitoquímica contra receptores de neurotransmissores vesiculares, como glutamato vesicular transportador 1 (VGLUT1).
- Sonda células transduzidas para suas propriedades elétricas (ou seja, a capacidade de gerar potenciais de ação) eo estabelecimento de sinapses funcionais por patch-clamp eletrofisiologia. Para mais informações sobre o procedimento de ver Heinrich et al. (2011).
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Resultados
O primeiro resultado deste protocolo após o estabelecimento com sucesso de uma cultura a partir de um espécime de adulto humano córtex cerebral consiste na identificação da composição da cultura celular. Imunocitoquímica para as proteínas específicas do tipo de célula, revela um elevado grau de heterogeneidade entre as culturas derivadas de uma amostra de pacientes diferentes (Figura 1A). Quantificada por citometria de fluxo, há sempre uma fracção substancial de células que expressam PDGFRβ (em média ~ ...
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Discussão
O presente protocolo descreve a expansão in vitro e de enriquecimento de células derivadas de pericitos após isolamento a partir do córtex cerebral humano adulto e a posterior conversão em iNs por expressão mediada por retrovirus da transcrição neurogénica factores Sox2 e Ascl1. Tal proporciona um protocolo experimental de sistema in vitro para estudar a linhagem de conversão das células cerebrais residente em neurónios e células gliais, também, potencialmente, com o objectivo em mente que em última an...
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Divulgações
Autores têm nada a revelar.
Agradecimentos
Somos gratos ao Dr. Magdalena Götz para ela de entrada durante o desenvolvimento deste protocolo. Agradecemos ao Dr. Marius Wernig (Universidade de Stanford) para generosamente nos fornecer a sequência codificante sox2. Estamos também muito gratos ao Dr. Alexandra Lepier para a produção de vírus. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) eo BMBF (01GN1009A) para BB, eo Estado Ministério de Ciências da Baviera, Investigação e das Artes para MK e BBCS recebeu financiamento da binacional SYSTHER- Instituto Virtual INREMOS (Ministérios Federal alemão e esloveno de Educação e Pesquisa) e da DFG (SFB 824).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | uso 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | uso 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | uso 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | uso 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Sinalização celular | 3169S | usa 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | usa 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | usa 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | usa 1:400 |
| anti-β III-tubulina | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1.000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | usa 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | usa 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | usa 1:500 |
| anti-Calretinina | Millipore | AB5054 | usa 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | usam 1:1.000 |
| Controle de isotipo Rat IgG1 FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 controle de isotipo PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 controle de isotipo APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, glicose alta, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 suplemento sem soro | Invitrogen | ||
| soro fetal de bezerro | Invitrogen | 10106-169 | realiza inativação de calor por incubação a 56 &graus; C por 30 min |
| Penicilina-estreptomicina | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| PBS de Dulbecco sem CaCl2 e MgCl2 (D-PBS, 1x) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poli-D-lisina bromidrato (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldeído) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Albumina de soro bovino | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-fenilindol) dilactato | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/ Tubos | Polysciences | 18606-20 | |
| BD Biosciences | 352063 | ||
| Tubos de fundo redondo de poliestireno com tampa de filtro de células | BD Biosciences | 352235 | |
| Placas de 24 poços | Orange Scientific | 5530305 | |
| Frascos de cultura de 75 cm2 | Greiner Bio-One | 658175 | |
| frascos de cultura de 25 cm2 | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Pipetas descartáveis 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Glass Pasteur pipetas (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverss 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Bisturis cirúrgicos descartáveis | de cultura de | B. Braun | |
| Greiner Bio-One | 633180 | ||
| Tubos cônicos 15 ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Capuz | |||
| Centrífuga e rotor basculante com adaptadores para tubos de 15 ml e 50 ml | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Classificador de células de citometria de fluxo: FACSAria l com software FACSDiva | BD Biosciences | ||
| Incubadora de cultura de células humificadas | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Banho de água a 37 ° C | |||
| FACSFado da bainha de baixo | BD Biosciences | 342003 | |
| Microscópio de epifluorescência BX61 | Microscópio confocal Olympus | ||
| LSM710 | Zeiss |
Referências
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Reimpressões e permissões
