Um protocolo simples para determinar o teor de lípidos neutros de células de algas com um procedimento de coloração com Vermelho do Nilo é descrito. Esta técnica de poupança de tempo, oferece uma alternativa aos protocolos de quantificação de lípidos tradicionais à base gravimétrica. Ele foi projetado para a aplicação específica do desempenho do monitoramento de bioprocessos.
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Artigo de método
Um simples e rápido protocolo para medir lipídios neutros em algas células usando fluorescência
Neste artigo
Resumo
Resumo
As algas são consideradas excelentes candidatos para as fontes de combustível renováveis, devido às suas capacidades de armazenamento de lipídios naturais. Monitoramento robusto de processos de fermentação de algas e de triagem para novas linhagens ricas em petróleo requer um protocolo rápido e confiável para a determinação do teor de lipídios intracelulares. As práticas atuais dependem em grande parte de métodos gravimétricos para determinar o teor de óleo, técnicas desenvolvidas décadas atrás, que são demoradas e exigem grandes volumes de amostra. Neste papel, Vermelho do Nilo, um corante fluorescente que foi usado para identificar a presença de corpos de lípidos em vários tipos de organismos, é incorporado um protocolo simples, rápido e fiável para a medição do teor de lípidos neutros de protothecoides Auxenochlorella, um verde alga. O método utiliza o etanol, um solvente relativamente suave, para permeabilizar a membrana da célula, antes da coloração e uma de 96 cavidades de micro-placa para aumentar a capacidade da amostra durante as medições da intensidade de fluorescência. Ele foi projetoed com a aplicação específica do desempenho do monitoramento de bioprocessos. As amostras previamente secas ou amostras vivas de uma cultura de crescimento pode ser utilizado no ensaio.
Introdução
Devido à sua capacidade de armazenar corpos lipídicos sob certas condições de estresse, as algas têm recebido uma grande atenção nos últimos anos como uma potencial fonte de combustível renovável 1,2. Lípidos neutros pode representar mais de 60% do peso seco da célula sob condições de crescimento apropriadas 3. No entanto, a indústria não tem um protocolo padronizado simples, limpo, rápido e confiável para quantificar o conteúdo lipídico de células de algas, a fim de monitorar adequadamente o desempenho de bioprocessos, analisar as culturas, e na tela de novas linhagens.
O método gravimétrico Bligh-Dyer desenvolvid....
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Protocolo
1. Isolamento de seco de algas biomassa a ser utilizadas como padrões de fluorescência Leituras
- Retirar um volume de amostra a partir da cultura de crescimento de algas que vai proporcionar, pelo menos, 200 mg de biomassa seca, 400-600 mg é preferível.
- Amostra Centrifugar a 4 ° C durante 10 min a 10.000 x g. Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com um volume igual de tampão fosfato formulado para o mesmo pH que o meio de crescimento.
- Repita o passo 1.2 para um total de 3 etapas de lavagem.
- Re-suspender a pelete em água desionizada e transferir para um prato pré-pesado pesar. Deixar secar a 50 ° C durante 48 hr. NOTA: A....
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Resultados
Células de algas representativos coradas com o corante Vermelho do Nilo estão representados na Figura 1. Partes A e B da Figura imagens de A. um visor protothecoides crescido em excesso de nitrogênio, o que leva ao acúmulo de lipídios intracelulares muito baixo. Em partes C e D, as amostras de A. protothecoides cultivadas sob limitação de nitrogênio são mostradas. Sob iluminaç.......
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Discussão
As algas utilizadas na curva padrão devem ser as mesmas espécies cultivadas sob as mesmas condições experimentais, como os que estão sendo medidos. As mudanças significativas na composição do meio, a técnica de cultivo, e protocolo de coloração pode afectar a intensidade da leitura de fluorescência. Extracção com hexano (descrito nas secções 1 e 2) foi utilizado para determinar o teor de lípidos neutros de amostras usadas na curva padrão. Para as medições da intensidade de fluorescência precisos, todas as amostras devem.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer às Ciências Naturais e Conselho de Pesquisa do Canadá Engenharia para a prestação de apoio financeiro para este projeto.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Peso | |||
| 25 ml pipetas descartáveis | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipeta Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene Teflon Tubos de centrífuga | Fisher | 05-562-16A | Teflon necessário para hexano |
| Pesar pratos (polipropileno) | Fisher | 2-202B | |
| 1,5 ml microcentrífuga tubos | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrífuga | Sorvall | RC6plus | |
| Forno de Secagem (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Frascos de armazenamento | Fisher | 0337-4 | |
| Microcentrífuga de bancada (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Quantificação | |||
| Argamassa de Porcelana (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Pilão de Porcelana (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| Tubos de centrifugação de 40 ml (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Também pode usar tubos de vidro |
| Pipetas de vidro Pasteur | Fisher | 13-678-20C | |
| Pratos de pesagem de alumínio | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanos | Fisher | H292-4 | |
| Quantificação fluorométrica do teor | |||
| Leitor de placas multipoços de fluorescência | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Software leitor de fluorescência | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| Placa de poço COSTAR 96 com fundo redondo | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Etanol (grau de reagente de álcool) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Células | |||
| Leica DMRXA2 (ou equivalente) microscópio | Leica | DMRXA2 | |
| Lâminas de microscópio | Fisher | 12-550-15 | |
| Lamínulas de microscópio | Fisher | 12-541B | |
| Câmera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
Referências
- Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnol. Adv. 25, 294-306 (2007).
- National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency & Renewable Energy. U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and....
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Reimpressões e permissões
