Descrevemos aqui uma adaptação de protocolos utilizados para induzir plasticidade homeostático em neurónios para o estudo da plasticidade dos receptores acoplados à proteína G astrocíticos. Recentemente usado para examinar as mudanças no grupo I astrocitário mGluRs em ratos juvenis, o método pode ser aplicado para medir o dimensionamento de vários GPCRs astrocitárias, em tecidos de camundongos adultos in situ e in vivo, e para obter uma melhor apreciação da sensibilidade dos receptores astrocitárias a mudanças na atividade neuronal.
Perto de duas décadas de pesquisa estabeleceu que os astrócitos in situ e in vivo expressar inúmeros receptores acoplados à proteína G (GPCRs) que podem ser estimulados pelo transmissor neuronalmente-lançado. No entanto, a capacidade dos receptores astrocitárias para expor plasticidade em resposta a mudanças na atividade neuronal tem recebido pouca atenção. Aqui, descrevemos um sistema modelo que pode ser usado para escalonar globalmente para cima ou para baixo grupo astrocíticos que os receptores de glutamato metabotrópicos (mGluRs) em fatias cerebrais agudas. Estão incluídos os métodos de como preparar fatias de hipocampo parassagitais, construir aposentos adequados para a incubação fatia de longo prazo, bidirectionally manipular ação neuronal potencial de freqüência, astrócitos de carga e processos de astrócitos com fluorescente Ca 2 + indicador, e medir as mudanças na atividade Gq GPCR astrocitário por gravação astrócitos espontâneas e evocadas Ca 2 + eventos usando microscopia confocal. Em essência, um "r cálciooadmap "é prevista como medir a plasticidade de GPCRs Gq astrocitárias. São discutidas aplicações da técnica para o estudo dos astrócitos. Ter uma compreensão de como a sinalização do receptor astrocitária é afetada por mudanças na atividade neuronal tem implicações importantes tanto para a função sináptica normal, assim como os processos subjacentes distúrbios neurológicos e doenças neurodegenerativas.
Os astrócitos responder em segundos a estimulação dos neurônios ou axônios neuronais com o aumento do Ca 2 + citoplasmático resultantes quase exclusivamente da ativação de GPCRs Gq astrocitárias. Por exemplo, os receptores de acetilcolina muscarínicos 1, 2 receptores de canabinóides, receptores adrenérgicos α 1A 3, 4 e grupo I mGluRs (veja abaixo) são todos os subtipos astrocitárias Gq GPCR que agudamente respondem à atividade neuronal. A activação do grupo astrocitário I mGluR foi demonstrado mais extensivamente, após a estimulação de aferentes glutamatérgicos neuronais in situ (tal como fatias de hipocampo agudas) 5-7, assim como no córtex do rato adulto in vivo após estimulação sensorial 8. O resultado da ativação de astrócitos Gq GPCR sinalização sobre a biologia e fisiologia dos astrócitos, neurônios, ou interações astrócitos-neurônios tem sido uma questão de debate 9-12. Será some tempo antes que a função de sinalização do receptor do neurônio-a-astrócitos é totalmente apreciado.
Embora seja claro que os neurônios podem ativar receptores astrocitárias usando protocolos experimentais, existem aspectos da comunicação neurônio-a-astrócitos receptor que permanecem pouco conhecidos. Em primeiro lugar, a quantidade real de actividade neuronal requerida para activar astrocitário Gq GPCRs não é bem definida, e em segundo lugar, a capacidade dos receptores astrocíticos para expor dependente de utilização plasticidade tem recebido pouca atenção. Para começar a responder a estas questões, que recentemente desenvolveu um protocolo para induzir a descamação bidirecional de grupo astrocitário I mGluRs em fatias de hipocampo juvenis agudos em resposta às mudanças de longo prazo no potencial de ação neuronal (AP)-dependentes atividade sináptica. À semelhança do que foi descoberto para a plasticidade homeostático bidirecional de receptores de glutamato ionotrópicos neuronais 13, 14, grupo astrocitário eu mGluRs expandir as following bloqueio de potenciais de ação neuronais e escala para baixo quando a ação neuronal freqüência potencial é aumentado 15. Estas alterações de compensação em receptores astrocíticos pode ser medido através da gravação espontânea e evocada astrócitos transientes de Ca 2 + e comparação das propriedades destes eventos para aqueles a partir de astrócitos em condições de controle. Neste artigo, descrevemos a metodologia completa para o uso deste protocolo, incluindo a preparação de fatias do hipocampo, condições agudas de incubação para induzir a descamação receptor astrócitos, astrócitos Ca 2 + indicador corante de carregamento, Ca 2 + técnicas de imagem por meio de microscopia confocal e efeitos esperados em astrócitos atividade Gq GPCR. Previsíveis efeitos em astrócitos Ca 2 + propriedades de sinalização – que correspondam às registradas previamente em pilhas cultivadas transfectadas com diferentes níveis de GPCRs Gq de expressão – fornecer um "roteiro", que pode ser usado em estudos futuros para analisar mudanças em comoexpressão GPCR trocytic. As ramificações e aplicações potenciais para o uso desta técnica irá contribuir para a nossa compreensão das interações astrócitos-neurônios no cérebro saudável e doente.
Os modelos de dimensionamento descritos representam métodos práticos para a pesquisa de plasticidade de longo prazo do grupo astrocitário eu mGluRs. Geração de imagens espontâneas e evocadas Ca 2 + eventos fornece um ensaio sensível para medir mudanças na atividade astrocitária Gq GPCR, como evidência empresa foi estabelecido que astrócitos Ca 2 + elevações ocorrem após liberação do IP 3 lojas sensível-R jusante da ativação Gq GPCR 10, 12, 17, 18. O percentual de astrócitos na população responder ao grupo I mGluR agonista eo padrão de tais Ca 2 + respostas relatam mudanças no grupo I mGluRs pelos astrócitos.
A técnica específica utilizada para carregar os astrócitos com Ca 2 + indicador é uma consideração importante na concepção de ensaios para observar as mudanças na actividade astrocitário Gq GPCR. Bolus de carga ou carregamento a granel vários astrócitos, ou patch-carregamento da braçadeira de astrócitos individuais pode ser utilizado para imagem transientes de Ca 2 + em astrócitos. Cada abordagem oferece certas vantagens e desvantagens. Preenchendo diretamente astrócitos com Ca 2 + indicador via patch clamp permite a identificação inequívoca da célula como um astrócitos, sem necessidade de um marcador secundário, como SR-101. Entrega de patch-clamp de indicador também permite a gravação de Ca 2 + atividade de pequenos compartimentos astrocitárias incluindo os processos de multa espessas, potencialmente mais profundas na fatia onde as células são mais saudáveis e com interações mais intactas com as sinapses (dependendo da potência do laser disponível). No entanto, patch-clamp carregamento sofre com baixa taxa de transferência como os dados são coletados uma célula de cada vez. De carregamento de grandes quantidades, por outro lado, permite que um grande número de astrócitos para ser carregado com Ca2 + indicador e fotografada simultaneamente. No entanto, apenas os astrócitos perto da superfície (<20 mm) da fatia são carregados, com a preocupação associadas sobre a saúde das células e sinapses intactas.
O protocolo de bolus de carregamento contrapressão aqui apresentado oferece um meio termo, com relativamente alto rendimento ea capacidade de monitorar Ca 2 + atividade mais profunda dentro da fatia (40-75 mm). Um aumento significativo na percentagem de astrócitos espontaneamente activas utilizando a técnica de bolus de carregamento é observada em relação ao volume de carga, o que sugere que as ligações entre as sinapses neuronais e os processos astrocíticos são mais completa 15. Com boa carga, pode-se frequentemente controlar Ca 2 + na actividade principais processos de astrócitos (dados não mostrados) ou, potencialmente, mesmo compartimentos menores usando microscopia de dois fotões. No entanto, os cuidados que precisam ser exercido em atribuir os processos menores para um astrocyte particular, como os limites mistura no fundo não específica coloração. Uma preocupação adicional com o uso de procedimentos de grandes quantidades de carga ou bolus de carregamento é a necessidade de um mar secundárioker para identificação dos astrócitos. Embora tenha sido conhecida há muitos anos que os astrócitos preferencialmente ocupam AM éster Ca 2 + indicadores, o marcador secundário SR-101 é frequentemente usado para verificar as células carregadas como astrócitos. SR-101 pode, por si só alterar a excitabilidade de neurónios intrínsecos 29. O uso de SR-101 corrobora a necessidade de realizar todos os Ca 2 + medições de astrócitos em TTX para limitar possíveis SR-101 efeitos sobre a excitabilidade neuronal. Supondo-se que ambos os grupos controle e experimentais incluem SR-101, o marcador em si não deve contabilizar os efeitos observados em astrócitos Ca 2 + sinalização seguintes manipulação de longo prazo dos potenciais de ação neuronais. SR-101 pode ser mais uma preocupação em alta K + experiências, no entanto, uma vez que pode reduzir a diferença entre os 2,5 mM de K + vs 5,0 mM K + se a taxa de disparo basal não é alterado proporcionalmente.
Uma abordagem muito promissora para entregar Ca 2 + </sup> Indicador de astrócitos surgiu recentemente, que oferece uma alternativa atraente para as abordagens mais tradicionais usando Ca 2 + corantes. Avanços significativos têm sido feitos ao longo dos últimos anos, com indicadores de cálcio geneticamente codificados (Gecis) direcionados para os astrócitos 30-32. Gecis pode ser entregue a astrócitos in vivo por microinjecção de vectores virais adeno-associados para uma região do cérebro de interesse, tais como o hipocampo. Expressão de Gecis é alcançada após cerca de duas semanas após a infecção viral 32. Há inúmeras vantagens oferecidas pela utilização de Gecis nos astrócitos. Em primeiro lugar, os vetores são direcionados para os astrócitos, utilizando um promotor específico do astrócitos, por isso as células marcadas são astrócitos 32. Em segundo lugar, o ruído de sinal-para-agora parece comparável com o que pode ser obtido usando a entrega de patch-clamp de corante, mas sem a capacidade de invasão de ter tido uma pipeta patch na célula 32. Em terceiro lugar, os indicadores podem ser delivered e expressa em tecidos adultos, o que é problemático usando métodos de entrega em massa-carga. Além disso, a expressão é mosaico, oferecendo a capacidade de diferenciar entre as várias astrócitos. Assim, vários astrócitos podem potencialmente ser trabalhada ao mesmo tempo, e ao mesmo tempo de gravação no soma e Branchlets finas, ao mesmo tempo. Portanto, potencialmente uma técnica simples pode ser usado no lugar de três técnicas diferentes (massa de carregamento, bolus de carregamento, e patch-clamp de carga) para gravar a atividade de escala de GPCRs Gq astrocitárias, aumentando significativamente a eficiência.
Uma desvantagem potencial do uso de entrega viral mediada de Ca 2 + indicadores de astrócitos é o possível efeito sobre a fatia de saúde 32. Os vectores virais adeno-associados utilizados para entregar as Gecis ter sido mostrado previamente para causar a gliose reactiva de 33 astrócitos. Preparação de fatias do cérebro em geral provavelmente inicia estágios iniciais da patologia, incluindo liberação de inflammatory moléculas 10. Portanto, combinado com o tempo de incubação longos necessários para induzir a descamação de receptores astrocíticos, utilização de Gecis entregues utilizando vectores virais que necessitam de receber consideração adicional no contexto da fatia de saúde nestes tipos de experiências.
Quando se emprega este protocolo, é importante ter em mente que o tempo de aplicação para o agonista para produzir uma resposta irá variar em função da disponibilidade de receptor. Para uma dada concentração do agonista, o tempo de aplicação terá de ser mais longo, se os receptores têm reduzida, e mais curtos, se os receptores têm ampliados, para a droga para alcançar uma concentração suficiente no tecido para activar os receptores suficientemente para produzir um Ca2 + resposta. Portanto, os tempos de aplicação de droga, e, potencialmente, as suas concentrações, pode ter de ser ajustado, dependendo da direcção pretendida para o dimensionamento. Por exemplo, a concentração de agonista pode ter de ser reduzido no case de TTX para evitar a saturação respostas, e aumentou após a incubação fatias em alto K + até mesmo ver uma resposta. Especificamente, a concentração de DHPG foi deslocado 5-15 fiM após o tratamento TTX 30-50 uM após tratamento 5,0 mM de K +, a fim de estudar de Ca 2 + os padrões de resposta, tal como de 5-15 uM é muitas vezes demasiado baixa para produzir respostas em fiáveis astrócitos após a escala para baixo do grupo I mGluRs.
Gravação de astrócitos Ca 2 + atividade fornece nenhuma evidência direta de inserção receptor ou internalização de ou para a membrana plasmática. No entanto, com base na similaridade notável dos dados com os dados de estudos anteriores in vitro que examinaram a relação direta entre os níveis de expressão Gq GPCR e espontânea e evocadas Ca 2 + transientes 21-24, a interpretação mais lógica das mudanças em Ca 2 + sinalização é que os níveis de expressão dos receptores de superfície de astrócitos têmalterados. Uma abordagem complementar pode ser uma consideração importante quando se quer fornecer evidências adicionais sobre o locus do efeito sobre o Ca 2 + atividade. Uma estratégia que usamos foi examinar o efeito de TTX incubação em fatias de hipocampo de ratos MrgA1R astrocitárias. Estes ratos transgênicos expressar uma Gq GPCR estrangeira (o MrgA1R) só nos astrócitos. Porque este não é o receptor nativo para o cérebro, não há neurotransmissor endógeno presente para alterar os seus níveis de actividade. Trabalho anterior sugeriu que este receptor envolve o mesmo intracelular moléculas de sinalização como grupo endógeno I mGluR nas mesmas astrócitos 34. Após incubação a longo prazo das fatias de ratinhos MrgA1R em TTX, não há diferenças nas respostas MrgA1R evocada por agonista, em comparação com o controlo de ninhada incubadas fatias poderia fornecer provas de que o efeito em astrócitos de Ca 2 + a actividade é devida a variações localizadas para o receptor da superfície, especialmente se as respostas do grupo I mGluR ainda são signifivamente melhorado nos mesmos astrócitos. Uma alternativa, no entanto estratégia talvez mais envolvido seria isolar astrócitos das fatias para análise de Western blot, enquanto uma fracção de membrana pode ser analisado para alterações nos níveis de expressão dos receptores de superfície. Fluorescência ativado celular (FACS) ou citometria de fluxo pode ser útil aqui.
As possíveis aplicações desta técnica para o estudo de neurónios, astrócitos e interacções astrócitos neuronal são muitos. Em nossos experimentos, único grupo DHPG evocadas eu mGluR foram estudados astrocitárias Ca 2 + respostas, em fatias de hipocampo agudas isoladas de ratos juvenis. Esta preparação não só tem as aferentes intactos (efeitos colaterais Schaffer), mas também os neurônios que dão origem a eles (células piramidais CA3), tornando-se possível manipular as taxas de disparo desses neurônios glutamatérgicos sobre as células pós-sinápticas (células piramidais CA1) e astrócitos no estrato radiatum cujos processos assoenviar um e com estas sinapses. A fatia do hipocampo aguda pode não ser a melhor preparação para a manipulação de taxas de disparo de outros tipos de neurônios, no entanto, como muitos aferentes são cortados a partir dos neurônios que dão origem a eles. No entanto, pode ser possível, em certas preparações fatia observar plasticidade de outros subtipos Gq GPCR astrocíticos. Por exemplo, as fatias podem ser preparados com os neurônios colinérgicos do prosencéfalo basal e suas projeções para hipocampo intacto. A incubação dessas fatias em TTX ou elevada K + afetaria taxas de disparo dos neurônios colinérgicos basais, levando a descamação dos receptores muscarínicos em astrócitos de oriens estrato, que recebem uma parcela significativa da entrada colinérgica 1. Uma alternativa abordagem ainda não testados para estudar o dimensionamento do receptor astrocitário dentro de uma área específica do cérebro, com todas as ligações intactas, enquanto ocorre escamação, poderia ser a utilização de um modelo in vivo, onde uma libertação prolongada de TTX é conseguido por implantação de um plastpolímero ic Elvax 40W acima da região de interesse 35. Esta abordagem tem sido usada anteriormente em um estudo de escalonamento neuronal, mas também deve ser aplicável a descamação astrocitária. Finalmente, com a leitura adequada, estudos futuros poderiam examinar outras famílias GPCR, incluindo mudanças na L s ou L i GPCRs. Alguém poderia prever astrocitário GABA B G i GPCRs a ser afetado com a inibição do disparo no local projetando interneurônios GABA dentro de qualquer preparação fatia. Desenvolvimento de novos indicadores que visam outras moléculas sinalizadoras, como um indicador de tempo real do segundo acampamento mensageiro, abriria toda uma nova área de pesquisa sobre comunicação neurônio receptor-a-astrócitos.
Escamação bidireccional de mGluRs astrocíticos por manipulação das taxas de queima neurónios basais fornece uma medida da sensibilidade dos astrócitos para libertação AP-mediada de neurotransmissor. Os astrócitos aparentemente pode sentir APs espontâneos e glutamatoliberação te a garantia Schaffer-CA1 sinapses celulares piramidal mesmo quando extracelular K + está dentro de uma faixa fisiológica. Embora a aplicação aguda da TTX não reduz a freqüência de astrócitos espontânea Ca 2 + actividade 18, 36, 37, o Ca 2 + atividade entre os astrócitos na população torna-se decorrelated 36, fornecendo evidências de que os receptores astrocitárias são detectores de AP. Isto sugere que os astrócitos sentir APs neuronal espontânea sem afetar em seu Ca 2 + actividade global. É amplamente aceito que as concentrações intracelulares de IP 3 precisa atingir um nível de limiar para estimular IP 3 Rs suficiente para levar a uma detectável Ca 2 + elevação. Poderia APs neuronal espontânea ativar GPCRs astrocitárias sem produzir mensuráveis Ca 2 + elevações? Estudos futuros poderão utilizar fluorescência Resonance Energy Transfer (FRET) ou um tecnol semelhante ique (tais como BRET) para analisar a relação entre a proteína G de acoplamento ao receptor (uma medida da activação do receptor) e Ca 2 + de libertação das reservas internas. BRET tem sido amplamente utilizado para a detecção in vitro de proteína G-a-GPCR de acoplamento 38, embora possa haver algum tempo antes de esta tecnologia esteja disponível para utilização em preparações de tecidos intactos. É possível que GPCRs Gq astrocitárias estão sendo ativados com muito mais freqüência do que pode ser gravado usando as ferramentas de Ca 2 + de imagem atualmente disponíveis. Além de sentir os potenciais de ação, GPCRs Gq astrocitárias também pode ser capaz de detectar liberação quântica miniatura de neurotransmissores como relatado em um estudo recente 39. O método de escalonamento bidireccional aqui descrito pode ser utilizado em estudos futuros para fornecer uma medida da extensão em que os GPCRs astrocitário Gq detectar libertação vesicular quântico de neurotransmissor, incluindo bafilomicina A1 no protocolo de incubação.
ntent "> Até aqui, os protocolos de dimensionamento apenas têm sido utilizadas em fatias de hipocampo de ratinhos jovens (p12-p18). Portanto, é actualmente desconhecido se o dimensionamento do receptor astrocitário também podia ser induzida em tecidos obtidos a partir de ratinhos adultos. Um estudo recente convincente sugere que a expressão grupo I de mGluR em astrócitos diminui consideravelmente após a primeira semana de idade e continua a descer até à idade adulta, com níveis muito baixos de expressão do receptor nos astrócitos adultos 40. Assim, seria interessante determinar se os mGluRs astrocíticos intensificar seguinte longo inibição prazo de disparo neuronal em fatias do hipocampo do rato adulto para níveis próximos aos observados em astrócitos de ratos juvenis. Este achado sugere que a expressão do receptor astrocitário não é estática a uma determinada idade, mas podem mudar rapidamente, dependendo de níveis de atividade neuronal. Em contraste com expressão reduzida de mGluRs grupo I em ratos adultos, estão surgindo evidências que os receptores adrenérgicos, incluindo & #945, 1A, 2A α, e β subtipos 1, são predominantemente expressos por astrócitos no cérebro adulto 3, 4. O adrenérgicos α 1A Gq GPCR pode ser um alvo atraente para futuros estudos de comunicação neurônio-a-astrócitos, inclusive se esses receptores são sensíveis a mudanças nas taxas de disparo dos neurônios adrenérgicos.The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer o Centro de UC Riverside para glia neuronais interações para valiosa discussão dos protocolos de escala e dados. Os autores também gostaria de dar um agradecimento sincero você Abcam por patrocinar a publicação de seu trabalho.
Chamber Supplies | |||
Brinkmann pipette storage container | Fisher Scientific | 03-491 | Use the drawer portion as the incubation chamber |
Electrical drill | |||
Flexible tubing | Tygon | R-3603 | |
Silicone seam sealant | Also called aquarium seam sealer | ||
Gas tank | 95% oxygen, 5% carbon dioxide | ||
Natural beveled pipette tip | USA Scientific | 1111-1000 | Cut-to-fit to connect oxygenate lines |
One-to-six lines manifold | Warner Instruments | 64-0210 (MP-6) | For the microloader-manifold apparatus |
Eppendorf microloader | Eppendorf | 5242 956.003 | For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit |
Floating Bubble Rack | Bel Art Scienceware | F18875-0400 | For slice holder |
600 micron Sefar Nitex nylon mesh | ELKO filtering Co. | 06-600/51 | For slice holder |
Krazy Glue | For slice holder | ||
Reagent | |||
Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
NaCl | Fisher | S271-3 | |
KCl | Fisher | P333-500 | |
CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
MgCl2 | Fisher | M33-500 | |
NaH2PO4 | Fisher | S369-500 | |
NaHCO3 | Fisher | S233-500 | |
Glucose | Fisher | Fisher | |
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Acros Organics | 53188-07-1 | |
Ascorbic acid | Acros Organics | 401471000 | |
Tetrodotoxin citrate (TTX) | Ascent Scientific | Asc-055 | |
Sulforhodamine 101 (SR-101) | Sigma-Aldrich | 284912 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
Pluronic Acid F-127 | Invitrogen, Molecular Probes | P6867 | |
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging) | Invitrogen, Molecular Probes | O6807 | |
(RS)-3,5-DHPG | Ascent | Asc-020 | |
Histamine | Sigma-Aldrich | H7125 | |
Carbamoylcholine chloride (Carbachol) | Sigma-Aldrich | C4382 | |
Adenosine 5’-ATP disodium (Na-ATP) | Sigma-Aldrich | A7699 | |
Dissection Tools | |||
Single-edge razor blade | GEM | 62-0161 | For bisection |
Double edge razor blade | TED PELLA, INC. | 121-6 | For cutting slices |
Mayo Scissors, supercut | WPI | 14010-15 | For decapitation |
Fine iris scissors, straight | Fine Science Tools | 14094-11 | For cutting the skull |
Iris forceps, curved | WPI | 15915 | To remove the skin and skull |
Small spatula | To remove/transfer the brain | ||
Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | For hippocampus dissection |
Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20B | For transferring brain slices |
Pasteur pipette rubber bulb | Fisher | 03-448-22 | For transferring brain slices |
Polystyrene 100-mm tissue culture dishes | Corning | 25020 | |
Equipment | |||
Vibratome | Leica | VT 1200S | |
Water bath | Fisher | ISOTEMP 210 | For warm incubation |
Micropipette puller | Narishige | PC-10 | For bolus-loading pipette |
Confocal microscope | Olympus | Olympus Fluoview 1000 | |
Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform | Warner Instruments | RC-26GLP | diamond bath with low profile |
Borosilicate glass pipette | World Precision Instruments | TW150F-4 | For bolus-loading pipette |
Micromanipulator | Sutter instrument | ROE-200 | For bolus-loading pipette |
Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 µm cellulose acetate | Costar | 8161 |