Artigo de método
Após transecção espinhal, adulto zebrafish tem recuperação funcional por seis semanas após a lesão. Para tirar proveito da transparência larval e recuperação mais rápida, apresentamos um método para seccionar a medula espinhal larval. Após transecção, observamos recuperação sensorial começando em 2 dias após a lesão, e movimento C-curva por 3 dias após a lesão.
Mamíferos falhar na recuperação sensorial e motora após lesão medular, devido à falta de rebrota axonal abaixo do nível da lesão, bem como a incapacidade de reiniciar a neurogênese espinhal. No entanto, alguns anamniotes incluindo o peixe-zebra Danio rerio exposição tanto sensorial e recuperação funcional, mesmo após transecção completa da medula espinhal. O peixe-zebra adulto é um organismo modelo estabelecido para o estudo da regeneração após lesão medular, com recuperação motora e sensorial por seis semanas após a lesão. Para aproveitar in vivo análise do processo regenerativo disponível no zebrafish larval transparente, bem como ferramentas genéticas não acessível no adulto, usamos o peixe-zebra larval para estudar a regeneração após transecção medular espinhal. Aqui demonstramos um método para reprodutível e verificável seccionar a medula espinhal larval. Após transecção, nossos dados mostram recuperação sensorial início em 2 dias após a lesão (dpi), sagacidadeh o movimento C-bend detectável por 3 dpi e retomada da natação livre por 5 dpi. Assim, propõe-se o peixe-zebra larval como uma ferramenta complementar para o peixe-zebra adulto para o estudo de recuperação após a lesão medular.
Grande trauma da medula espinal humana, muitas vezes resulta em paralisia permanente e perda de sensibilidade abaixo do nível da lesão, devido à incapacidade de crescerem axónios ou reiniciar neurogénese 1,2. Em contraste com os mamíferos, no entanto, anamniotes incluindo salamandras e peixes-zebra (Danio rerio) mostram recuperação robusta, mesmo depois de medula espinhal completa transecção 3,4.
O peixe-zebra adulto é um modelo bem estabelecido para estudar o processo de recuperação após lesão medular 5-7. Na sequência completa transecção da medula espinal, restabelecimento da função sensorial e ....
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Peixe-zebra foram levantadas e produzido de acordo com processos padrão; experiências foram aprovadas pelo Comité de University Animal Care and Use Institucional Utah.
1. Preparação de Placas Cirurgia
2. Preparação de Micropipetas
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Para reduzir a severidade dos danos no tecido em torno do local da lesão, chanfradura adequada da micropipeta é crítica. Figura 1A mostra uma ponta chanfrada correctamente. Usando uma dica que é muito grande (Figura 1B) tende a resultar em fatalidades mais elevados devido ao aumento da probabilidade de entalhar a aorta dorsal, enquanto uma dica que é muito estreito (Figura 1C) tende a olhar para fora da pele ao invés de tecido de corte.
Para.......
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Quando inicialmente aprender esta técnica, recomendamos tentar não mais de 50-100 transecções em uma única sessão. Depois de dominar essa técnica, somos capazes de transecto até 300 embriões por hora; no entanto, este nível de rendimento requer alguns meses de prática semanal. Recomenda-se também a prática com uma linha de repórter e verificando transsecção completa até a incidência de incompleto transecção da medula espinal é reduzida para menos de 1%.
Transecção da medula espinhal no peixe.......
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Os autores não têm nada a revelar.
Somos gratos à facilidade zebrafish Universidade de Utah para criação de animais. RID foi financiado pelo NIH R56NS053897 e LKB era um estagiário predoctoral apoiado pela iniciativa HHMI Med-Into-Grad.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de Petri de 60 mm | VWR | 82050-544 | |
| Placa de Petri de 100 mm | VWR | 89038-968 | |
| PDMS, Kit de elastômero de silicone Sylgard 184 | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| tubo capilar de borossilicato: OD 1,00 mm, ID 0,78 mm | Warner Instruments Inc. | 64-0778 | |
| Fórceps | Fine Scientific Tools Inc. | 11252-30 | |
| microscópio de dissecação | Nikon | SMZ6454 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Sulfato de Gentamicina | Amresco Inc. | 0304-5G | dissolver em água 10 mg/ml, armazenar a -20 &graus; C |
| Tricaine | Acros Organics | 118000100 | |
| Aplicador com ponta de algodão, madeira, 6 polegadas | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Seringa de 1 ml | BD | 309625 | |
| 27 G agulha | BD | 305109 | |
| Fry food | Argent Labs | F-ARGE-PTL-CN | loja em -20 ° C |
| Extrator de micropipetas | Sutter Instrument Co. | Filamento de Caixa Modelo P-97 | FB330B |
| 20x E2 (1 L); loja em RT | |||
| 17,5 g NaCl | Fisher Scientific | S671-500 | |
| 0,75 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| 2,90 g CaCl2· 2H2O | Sigma | C7902-500G | |
| 4.90 g MgSO4· 7H2O | Merck | MX0070-1 | |
| 0,41 g KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| 0,12 g Na2HPO4 | Sigma | S0876-500G | |
| 500x NaCO3 (10 ml); fazer fresco, descartar | |||
| 0,35 g extra NaCO3 | Sigma | S5761 | |
| 1x E2 (1 L); armazenar a RT | |||
| 50 ml 20x E2 | |||
| 2 ml fresco 500x NaCO3 |
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