Uma imersão Ensaio: Um protocolo para avaliar Interações entre CNS fagócitos e Neurônios

Resumo

Microglia são as células do sistema imunológico residentes do sistema nervoso central (SNC), com uma elevada capacidade de fagocitar ou engolir o material no seu ambiente extracelular. Aqui, um ensaio amplamente aplicável, confiável e altamente quantitativa para visualizar e medir engulfment mediada por microglia de componentes sinápticas é descrito.

Resumo

A fagocitose é um processo em que uma célula engole o material (célula inteira, as peças de uma célula, de detritos, etc) no seu ambiente extracelular circundante e subsequentemente digere este material, normalmente, através da degradação lisossomal. Microglia são as células do sistema imunológico residentes do sistema nervoso central (SNC), cuja função fagocítica tenha sido descrito em uma ampla gama de condições de doença neurodegenerativa (por exemplo, depuração da beta-amilóide na doença de Alzheimer), para o desenvolvimento do cérebro saudável (por exemplo, sináptica poda) ^1-6. O protocolo a seguir é um ensaio engulfment desenvolvido para visualizar e quantificar engulfment mediada por microglia de entradas pré-sinápticos no sistema retinogeniculate rato em desenvolvimento ^7. Embora este ensaio foi utilizado para avaliar a função da microglia, neste contexto, em particular, uma abordagem similar pode ser utilizado para avaliar outros fagócitos em todo o cérebro (por exemplo, astrócitos) e o resto do corpo(por exemplo, macrófagos periférica), bem como outros contextos em que a remodelação ocorre sináptica (por exemplo, lesão cerebral / doença).

Introdução

Circuitos sinápticos remodelar ao longo da vida de um animal. No cérebro em desenvolvimento, formam sinapses em excesso e devem ser submetidos a poda sináptica, que envolve a remoção seletiva de um subconjunto de sinapses e para a manutenção e fortalecimento das sinapses que permanecem ^8-10. Este processo é necessário para conseguir a característica de conectividade precisa do sistema nervoso adulto. No adulto, as sinapses também pode ser de plástico, em particular no contexto da aprendizagem e da memória. As correlações estruturais desta plasticidade são pensados ​​para incluir a adição e / ou eliminação das espinhas dendriticas e boutons pré-sinápt....

Protocolo

1. Anterógrada Rotulagem de RGC pré-sinápticos Entradas

Nota: Todos os experimentos envolvendo o uso de animais foram revistos e supervisionado pelo cuidado com os animais e uso comitê institucional (IACUC), de acordo com todas as diretrizes do NIH.

1. Campo e instrumentos Esterilizar.
2. Anestesiar rato com 4 vol% de isoflurano em uma câmara de indução Plexiglas (este isoflurano vol% trabalha para ratos neonatal-adulto). Observe atentamente os ratos para evitar o excesso de anestesiante. CUIDADO: Evitar a inalação de uma evacuação de gás residual de vácuo.
3. Depois de 1-3 min, (ratos mais velhos exigirá menos tempo....

Resultados

Recentemente, utilizou-se este ensaio de imersão para visualizar e quantificar imersão mediada por microglia de entradas pré-sinápticos no sistema retinogeniculate desenvolvimento (Figura 1) ^7. CGR de CX3CR1-EGFP camundongos heterozigotos foram anterogradamente traçada com CTB-594 e CTB-647 para os olhos esquerdo e direito, respectivamente. Após este traçado, microglia EGFP-positivos dentro do dLGN foram fotografadas. Essas imagens foram posteriormente superfície-renderizados para medições de.......

Discussão

A fim de medir com precisão a fagocitose, material engolido devem ser rotulados de tal forma que o pesquisador possa visualizá-lo uma vez degradação lisossomal ocorreu. Além disso, a elevada resolução de imagem é necessário, seguindo-se a utilização de software que permita o investigador para visualizar o volume de toda a célula e quantificar o seu conteúdo. Neste protocolo, descrevemos um método altamente confiável e quantitativo para medir engulfment mediada por fagócitos usando CTB conjugado com tinturas de Alexa par.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Almofada de calor	Vet Equip, Inc.	965500
Fonte de água quente para almofada de calor	Microscópio estéreo Kent Scientific	TP-700
	DSC Microscópio Óptico	Zeiss Opmi -6 Micrótomo
deslizante com estágio de congelamento	Leica	SM2010 R
Lâmina de micrótomo	Leica	14021607100
Microscópio de dissecação fluorescente	Nikon	SMZ800 com Acessório
Microscópio confocal de disco giratório	Perkin Elmer	UltraView Vox Spinning Disk Confocal
10 µ l Seringas à prova de gás Hamilton		Hamilton 80030	Use uma seringa diferente para cada corante/marcador de cor
Agulhas Hamilton	Hamilton	7803-05, especificações: romba, 1.5"
Toxina de cólera conjugada com Alexa β subunidade (CTB)	Invitrogen	488: C22841	Reconstituir em solução salina estéril, 80 µ l (488), 100 µ l (594), 20 µ l (647)
594: C22842
647: C34778
Solução salina tamponada com fosfato( PBS)	Sigma	P4417-50TAB
Sulfatos de Neomicina e Polimixina B e Pomada Oftálmica de Zinco e Bacitracina USP (pomada antibiótica)	Bausch & Lomb	24208-780-55
Agulha de 30,5 G	Becton Dickinson	305106
Tesoura de mola	Roboz	RS-5630
Aplicador com ponta de algodão	Fisher	23-400-125
Paraformaldeído (PFA) Ciências de	Microscopia Eletrônica	15710	Diluir 16% a 4% em PBS. O paraformaldeído é tóxico, use em uma capela e use equipamento de proteção individual.
Ferramentas de dissecação - tesouras, pinças, espátulas	Tesouras pequenas: Fine Science Tools	Tesouras pequenas: 14370-22
Tesouras grandes: Roboz	Tesouras grandes: RS-6820
# 55 fórceps: Fine Science Tools	# 55 pinças: 11255-20
Espátula: Ted Pella, Inc.	Espátula: 13504
Sacarose	Sigma	S8501-5KG	Produza 30% de sacarose em PBS (peso/vol)
OCT Compound	VWR	25608-930
Pese o barco	USA Scientific	2347-1426
Placas de 24 poços	BD Biosciences	353047
Fosfato de sódio monobásico	Sigma	S6566-500G	Produza 0,2 M de fosfato de sódio monobásico (PB-A) em ddH2O e 0,2 M de fosfato de sódio dibásico (PB-B) em ddH2O. Para fazer 0,1 M PB, combine 19 ml de PB-A e 81 ml de PB-B, encha até 200 ml com ddH2O
Fosfato de sódio dibásico	Sigma	S5136-500G
Lamínulas, 22 X 50 mm, N.º 1.5	VWR	48393 194
Lâmina de microscópio carregada	VWR	48311-703
Vectasheild	Vector Laboratories	H-1200