Artigo de método

Spinal Cord Injury completo e Cérebro Dissection Protocolo para Wholemount Subsequente In Situ Hibridização em larval da lampreia de mar

DOI:

10.3791/51494

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14 de outubro de 2014

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1Centre for Neuroregeneration, School of Biomedical Sciences, University of Edinburgh, 2Shriners Hospitals Pediatric Research Center (Center for Neural Repair and Rehabilitation), Temple University School of Medicine, 3Department of Neurology, Temple University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

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As lampreias recuperar locomoção após uma lesão completa da medula espinhal. No entanto, alguns neurônios espinhais de projeção são bons regeneradores e outros não. Este artigo ilustra as técnicas para larvas de lampreia mar habitação (e adultos recém-transformados), produzindo completos transecções medulares e preparar cérebros wholemount e medulas espinhais de hibridização in situ.

Resumo

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Depois de uma lesão completa da medula espinhal, lampreias marinhas no primeiro estão paralisados ​​abaixo do nível da transecção. No entanto, eles se recuperam locomoção depois de várias semanas, e isso é acompanhado por regeneração curta distância (alguns mm) dos axônios propriospinal e axônios espinal-se projectam a partir do tronco cerebral. Entre os 36 grandes neurônios espinhais-projetando identificáveis, alguns são bons e outros são regeneradores maus regeneradores. Esses neurônios podem ser mais facilmente identificados em preparações wholemount SNC. A fim de compreender os mecanismos neuronais intrínsecos que favorecem ou inibem a regeneração do axônio após a lesão nos vertebrados do SNC, podemos determinar diferenças na expressão gênica entre os bons e maus regeneradores, e como expressão é influenciada pela medula transecção espinhal. Este artigo ilustra as técnicas para larval habitação e lampreias marinhas adultas recentemente transformados em tanques de água, produzindo completos transecções da medula espinhal sob visão microscópica, e preparando brain e wholemounts da medula espinhal para hibridização in situ. Resumidamente, os animais são mantidos em 16   ° C e anestesiados em 1% benzocaína na lampreia Ringer. A medula espinal é seccionado com tesoura iridectomia através de uma abordagem dorsal e o animal é deixado recuperar em tanques de água a 23 ° C. Para a hibridização in situ, os animais são reanesthetized e o cérebro e medula removido por meio de uma abordagem dorsal.

Introdução

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Nos mamíferos lesão medular (LM) é uma condição devastadora que leva à perda permanente da função abaixo do local da lesão, porque os axônios lesionados não se regeneram através da zona de trauma e se reconectar com suas metas adequadas. Em contraste com os mamíferos, lampreia recuperar locomoção após uma lesão completa da medula espinal. Uma forma interessante, a lampreia tem um conjunto de 36 projectando neurónios da medula espinal que são identificáveis ​​individualmente em conjunto de montagem em preparações de cérebro devido ao seu grande tamanho 2,3 (Figura 1) . Todos esses neurônios espinhais de projeção são axotomizados ....

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Protocolo

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Ver Tabela 1 para todos os materiais utilizados neste protocolo.

Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional da Universidade de Temple.

1. Os animais

  1. Obter tipo selvagem lampreias marinhas larvais (Petromyzon marinus L.), 10-14 cm de comprimento (4-7 anos) dos córregos que alimentam o Lago Michigan, a partir de afluentes do rio Delaware (Pensilvânia) ou córregos em Maine.
  2. No laboratório, a manter as larvas em grupos de 50 - 100 animais em tanques de água doce de 50 galões a 16 ° C. Linha de tanques com uma polegada de cascalho....

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Resultados

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Como um exemplo dos resultados que podem ser obtidos quando se usa este método, as imagens representativas dos cérebros wholemounted que mostram a expressão dos transcritos neogenin em neurónios projectam-medulares identificáveis ​​de controlo e 2 semanas após a lesão a lampreia mar larvas são mostrados na Figura 2. Os leitores são referidos num estudo anterior 6 relatando a relação entre a expressão de neogenin após uma transecção medular completa ea capacidade de regeneração da medula espin.......

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Discussão

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Aqui apresentamos um protocolo detalhado para executar uma transecção medular completa e dissecção cerebral posterior em lampreias marinhas larvais. Este procedimento permite que as diferenças de análise da expressão gênica entre medula espinhal identificável salientes neurônios após a lesão medular por meio de um cérebro inteiro de montagem de hibridização in situ. O passo crítico no processo é o correcto desempenho de uma completa transecção da medula espinal, o que pode ser controlado através da observação das extrem.......

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Apoiado pelo NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 ao Dr. Michael E. Selzer; Bolsa de Pesquisa Shriners SHC-85220 para o Dr. Michael E Selzer; e Shriners Research Grant SHC-85310 para o Dr. Michael I. Shifman. O Dr. Antón Barreiro-Iglesias foi apoiado pela Fundación Barrié (Espanha) e pela Xunta de Galicia (Galiza, Espanha).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tricaine metano sulfonatoSpectrumTR108Solução saturada de benzocaína em PBS para sacrifício
Bisturi #3Fine Science Tools (FST)10003-12
Lâminas para bisturi: #11Fine Science Tools 10011-00
Tesoura Castroviejo #8Ferramentas de Belas Ciências 15002-08
184
Alfinetes de insetos 0,15, 0,20 mmAusterlitzSem catálogo #0,15 mm para fixar o cérebro e a medula espinhal; 0,20 mm para o corpo
7 ml HDPE Tubos de cintilação com tampasFisher Scientific03-337-1
Paraformaldeído 16%Microscopia Eletrônica Science (EMS)19210Diluir a 4% em PBS
Fórceps #4 & #5 Dumont, Suíça Roboz RS4955#4 para a dissecção da medula espinhal; #5 para o microscópio de dissecação Olympus SZ51 Sylgard Dow Corning Co. de 15002-08

Referências

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  1. Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury. Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).
  2. Davis, G. R. Jr, McClellan, A. D. Extent and time course of restoration of descending br....

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Reimpressões e permissões

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