Analisando o movimento da Nauplius &#39;<em&gt; Artemia salina</em&gt; &#39;Por Optical Rastreamento de plasmônicos Nanopartículas

Resumo

Usamos rastreamento óptico de nanopartículas plasmonic para investigar e caracterizar os movimentos de organismos aquáticos de freqüência.

Resumo

Demonstramos como pinças ópticas podem proporcionar um instrumento sensível para analisar as vibrações geradas fluídicos pelo movimento de pequenos organismos aquáticos. Uma única nanopartícula de ouro mantida por uma pinça óptica é usado como um sensor para quantificar o movimento rítmico de uma larva Nauplius (Artemia salina) em uma amostra de água. Isto é conseguido através da monitorização do tempo de deslocamento dependente da nanopartícula preso, como consequência da actividade Nauplius. Uma análise de Fourier da posição da nanopartícula proporciona então um espectro de frequência, que é característica para o movimento das espécies observadas. Esta experiência demonstra a capacidade deste método para medir e caracterizar a actividade de pequena larvas aquático sem a necessidade de observar directamente e para obter informações sobre a posição das larvas no que diz respeito à partícula aprisionada. No geral, esta abordagem poderia dar uma visão sobre a vitalidade de certas espécies encontradas em um e aquáticocosystem e poderia ampliar o leque de métodos convencionais para análise de amostras de água.

Introdução

Avaliação da qualidade da água com base em indicadores químicos e biológicos é de fundamental importância para obter insights sobre as condições de estado e ambientais de um ecossistema aquático ^1-3. Os métodos clássicos de análise química de água baseiam-se em propriedades organolépticas ou a determinação dos parâmetros físico-químicos. Os indicadores biológicos, por outro lado, são as espécies animais cuja presença e viabilidade fornecer informações sobre as condições ambientais e os efeitos de poluentes para um ecossistema que elas ocorrem dentro Exemplos típicos de bioindicadores são copépodes, um grupo de pequenos crustáceos de água, que pode ser encontrados em praticamente qualquer habitat de água ^4,5. Observando-se a actividade e a viabilidade destas espécies a partir de uma amostra de água pode assim ser utilizada para obter informação sobre as condições gerais de um ecossistema ^5. As larvas de copépodes, que são chamados Nauplii, use traços rítmicos de suas antenas (cada larva tem três pares de appendages em sua região da cabeça) para nadar em água ^6. A freqüência ea intensidade desses cursos é, assim, um indicador direto de idade, fitness, e as condições ambientais do animal ^7-10. Quaisquer investigações sobre estes espécimes são geralmente feito com um microscópio, observando e contando os cursos de antena do Nauplii diretamente. Devido ao seu tamanho (~ 100-500 mm) ^11, isso muitas vezes requer a fazer medições de um por um, ou para corrigir um único Nauplius a um substrato.

Aqui, nós demonstramos uma nova abordagem para observar a atividade de Copépode larvas em amostras de água usando uma nanopartícula de ouro opticamente preso como um detector ultra-sensível. As pinças ópticas são geralmente usados ​​por muitos grupos como uma ferramenta experimental multa a aplicar ou medir forças entre as moléculas até a faixa piconewton ^12-14. Mais recentemente, a gama de aplicações para pinça óptica foi expandida para observar vibrações acústicas e resolverflutuações nt em meios líquidos, monitorando o movimento de nano e micropartículas que estão confinados em uma armadilha óptica ^15. As partículas que são imersos num líquido são submetidos a movimento Browniano. Dentro de uma armadilha óptica, no entanto, este movimento é parcialmente amortecido por um laser induzida, força forte, gradiente. Por conseguinte, a rigidez da armadilha óptica e a localização da partícula no interior do foco do feixe de laser pode ser afinado pela potência de laser. Ao mesmo tempo, é possível revelar características sobre o potencial de captura e a análise da interacção de moléculas com o de partículas através da monitorização do movimento das partículas em função do tempo na armadilha. Esta abordagem torna possível para pegar a freqüência, intensidade e direção do movimento fluídico que é gerado por um objeto em movimento em seu ambiente líquido. Demonstramos como esta ideia geral pode ser aplicada para obter um espectro de o movimento de um indivíduo Nauplius frequência sem o requisitode interferir diretamente com o modelo. Esta abordagem experimental apresenta um novo conceito geral para a observação do comportamento de motilidade das amostras aquáticas de uma forma muito sensível. Para observações sobre as espécies bioindicadoras, isso poderia expandir a atual metodologia para análise de água e pode ser aplicado para obter informações sobre a saúde ea integridade dos ecossistemas aquáticos.

Protocolo

1. Setup Experimental

1. Use um microscópio de up-direito e um óleo de condensador de campo escuro com uma abertura numérica (NA) = 1,2 para a iluminação de campo escuro. Utilize uma objectiva de imersão em água com aumento de 100X e uma NA = 1.0 para observações de partículas e trapping. Use um objetivo ar com aumento de 10x e uma NA = 0,2 para seguir o movimento do Nauplius.
2. Use uma configuração de pinça óptica com 1.064 nm laser de onda contínua acoplado ao microscópio vertical. Defina a potência do laser da armadilha óptica a 100 mW (medido com um medidor de energia após a objetiva).
3. Use uma câmera de alta velocidade CMOS ou uma reflex digital de lente única (DSLR) para detectar e imagem do movimento de partículas de ouro na armadilha óptica e o movimento do Nauplius.
4. Usar um filtro de entalhe para evitar que o laser de entrar na câmara.
5. Use um medidor de potência para medir a potência do laser após a objetiva.

2. Preparação de Amostras

1. Pipetar uma gota de água (180 mL) em uma lâmina de vidro de microscópio e posicionar a amostra no microscópio de campo escuro.
2. Pipetar um Nauplius de um pequeno tanque de água à gota de água.
3. Usar um objectivo ar 10X para observar o movimento da Nauplius na solução e gravar um fluxo de vídeo.
4. Use uma nanopartícula de ouro com um diâmetro de 60 nm, como um detector para observar o movimento de fluido gerado pelo Nauplius. Por conseguinte, adicionam-se 5 mL de uma solução de partículas altamente diluído na gotícula de água, de modo que aproximadamente uma partícula pode ser visto no campo de visão com uma objectiva de imersão em água 100X.

3. Particle Experiment Rastreamento

1. Armadilha uma nanopartícula de ouro com a pinça óptica. Portanto, trazer a 1.064 nm armadilhas a laser perto de uma nanopartícula de ouro que está difundindo em solução movendo o estágio do microscópio. As forças ópticas atraentes puxar a nanopartícula de ouro para o ponto focal do the feixe de laser. A partícula aprisionada não está a difundir mais e em vez mantém a sua posição. Faça um fluxo de vídeo da nanopartícula preso com a câmera DSLR em uma taxa de quadros de 50 Hz por 30 segundos.
2. Desligue o laser da pinça óptica e solte a nanopartículas de ouro da armadilha.
3. Use um programa de rastreamento de partículas para a leitura da posição da partícula de ouro opticamente preso em cada quadro do fluxo de vídeo. Uma transformação rápida de Fourier (FFT) de xy-posição da partícula ao longo do tempo revela um espectro de freqüência.
   NOTA: Aqui, um "IGOR PRO 'código de programa de computador auto-escrito foi utilizado para analisar a posição central da partícula no plano xy com o tempo e para a análise FFT.
4. Como uma alternativa a um código IGOR auto-escrita usar o programa livremente disponível 'Spots Rastreio' para controlar a partícula no vídeo. Use o software comercial "Origin" para executar a transformação de Fourier dos dados de rastreamento:
   1. Arraste o arquivo de vídeo para o programa aberto 'Video Ponto Rastreador'.
   2. Clique do mouse sobre a partícula visto na primeira foto do fluxo de vídeo e uma região circular de aparecer juros.
   3. Escolha "simétrica" ​​e "otimizar" na janela do prompt de comando top para otimizar o acompanhamento da partícula.
   4. Clique do mouse "logging" na janela do prompt de comando superior e escolha uma pasta para guardar os dados. Os dados de monitoramento serão guardados como uma planilha de dados.
   5. Clique do mouse "video jogo" no prompt de comando janela esquerda do programa de rastreamento e espere até que são analisados ​​todos os quadros do vídeo.
   6. Feche o programa e abra a planilha de dados salvos com 'Origem'. Defina os valores de coluna como "y _1" e "y _2".
   7. Definir intervalos de tempo para cada quadro do vídeo como "x" da planilha de dados 'Origem'.
   8. Marque a x-Posição da coluna e realizar uma FFT, escolhendo "Análise de Dados" e "FFT" na janela do prompt de comando top. Repita o passo para a coluna posição y.
   9. Traçar as amplitudes do sinal FFT calculado em x-e y-direção em relação a freqüência.

4. Simulação Numérica

1. Calcular as α polarizabilidade da partícula de ouro de 60 nm, utilizando o programa de computador 'Mathematica'.
   1. Utilizar a equação (1) para calcular a polarizabilidade de acordo com Kuwata et al ^16.:
      (1)
   2. Definir os seguintes três parâmetros no código do programa: a função dielétrica complexa dependente do comprimento de onda da partícula de ouro, o raio de nanopartículas, eo índice de refração do meio circundante.
2. Use a descrição dos elecdistribuição de campo tric de um feixe focalizado de acordo com Gaussian Agayan et al ¹⁷ para calcular as forças ópticas que agem em uma partícula de ouro de 60 nm.:
   (2)
   1. . Utilização das equações (3) - (6) a partir de Agayan et al ¹⁷ para calcular tanto, o gradiente e dispersar as forças que actuam sobre a partícula:
      (3)
      (4)
      (5)
      (6)
   2. No código de programa, definir os parâmetros para a potência do laser, a abertura numérica da oobjective, ea polarizabilidade complexo das nanopartículas.
   3. Soma-se a força do gradiente ea força de dispersão para calcular a força óptica total atuando sobre a partícula de ouro em uma armadilha óptica.
3. Execute a simulação pressionando simultaneamente "Control" e "Enter".

Resultados

Uma ilustração esquemática da configuração experimental é mostrado na Figura 1A. A configuração de campo escuro é necessário para detectar opticamente a deslocação de uma partícula de ouro de 60 nm de uma armadilha óptica ^15. O comprimento de onda de 1.064 nm para o laser trapping é escolhido para garantir um confinamento estável do detector de partículas de ouro ^12,14. Um divisor de feixe no microscópio é utilizado para focar o feixe através de aprisionamento do objectivo e um fil...

Discussão

Microscopia de campo escuro é uma poderosa ferramenta para a visualização de nanopartículas de ouro com dimensões inferiores ao limite de difração óptica, uma vez que a seção de espalhamento transversal das nanopartículas metálicas superior à sua seção transversal geométrica (cf. Figura 2A) ^18. Em uma configuração de pinça, esta abordagem ainda permite distinguir se apenas um único ou vários nanopartículas de ouro são presos pelo feixe de laser porque acoplamento plasmônica entre as partícula...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscópio Zeiss Axio Scope.A1	Carl Zeiss	490035-0012-000	iluminação de campo escuro
Objetivo de água Achroplan	Carl Zeiss	440087 ampliação de	100X, NA = 1,0
Objetivo de ar Epiplan	Carl Zeiss	442934	ampliação de 10X, NA = 0,2
Condensador de óleo de campo escuro	Carl Zeiss	445323	NA = 1,2
Cobolt Rumba CW 1.064 nm DPSSL	Cobolt	1064-05-01-2000-500	1.064 nm, CW, λ = 1.064 nm, 2 Watt, TEM00
Expansor de feixe	Edmund Optics		Parte nº 1064 2-8X 64414
Câmera de Alta Velocidade Dimax HD	PCO. Câmera Colorida da Alemanha
Canon EOS 500 D	Canon		FAQ-ID: 8201395700
Filtro de entalhe StopLine 532/1064	Semrock	A11149-711265 Nº do	artigo. NF01-532U
Água
Náuplio Artemia salina
Colóide de ouro	BBInternational	Batch 13741	Diâmetro 60 nm
MQMie Versão 3.2	Dr. Michael Quinten
Mathematica 8.0	Wolfram
Comsol Multiphysics 4.0	COMSOL, Inc.