Artigo de método

Lipid Bilayer Vesicle Geração Usando Microfluidic jateamento

DOI:

10.3791/51510

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21 de fevereiro de 2014

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1Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, 2Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, 3Department of Biomedical Engineering, Institute for Cellular and Molecular Biology, The University of Texas at Austin, 4Department of Bioengineering, University of California, Berkeley, 5Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

Neste artigo

Resumo

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Jorrando Microfluidic contra uma bicamada lipídica interface de gota fornece uma maneira confiável para gerar vesículas com controle sobre a assimetria da membrana, a incorporação de proteínas transmembrana, e encapsulamento do material. Esta técnica pode ser aplicada ao estudo de uma grande variedade de sistemas biológicos, onde são desejados biomoléculas compartimentadas.

Resumo

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Biologia sintética Bottom-up apresenta uma nova abordagem para investigar e reconstituir sistemas bioquímicos e, potencialmente, organismos mínimos. Este campo emergente envolve engenheiros, químicos, biólogos e físicos para projetar e montar componentes biológicos básicos em funcionamento de sistemas complexos, a partir de baixo para cima. Tais sistemas bottom-up pode levar ao desenvolvimento de células artificiais para investigações biológicas fundamentais e terapias inovadoras 1,2. Vesículas unilamelares gigantes (GUVs) pode servir como um modelo para a plataforma de biologia sintética, devido à sua estrutura da membrana celular-como e tamanho. Jacto de microfluidos, ou microjetting, é uma técnica que permite a geração de GUVs com tamanho controlado, a composição da membrana, a incorporação da proteína transmembranar, e encapsulação 3. O princípio de base deste método é o uso de vários impulsos de fluido, de alta-frequência gerados por um dispositivo de jacto de tinta piezo-actuada para deformar uma l suspensobicamada IPID num GUV. O processo é semelhante ao soprar bolhas de sabão a partir de uma película de sabão. Através da variação da composição da solução de hidromassagem, a composição da solução que engloba, e / ou os componentes incluídos na camada dupla, os investigadores podem aplicar esta técnica para criar vesículas personalizadas. Este artigo descreve o procedimento para gerar vesículas simples a partir de uma bicamada interface de gota por microjetting.

Introdução

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Tornou-se cada vez mais claro que a biologia celular é um problema multi-escala que envolve a integração de nossa compreensão a partir de moléculas às células. Consequentemente, sabendo exatamente como as moléculas trabalhar individualmente não é suficiente para compreender os comportamentos celulares complexos. Isto é em parte devido à existência de comportamentos emergentes de sistemas multi-componentes, como exemplificado pela reconstituição de interação da rede de actina com vesículas bicamada lipídica 4, montagem do fuso mitótico em Xenopus extrair 5 e dinâmica espacial de bactérias máquinas divisão celular 6. Uma maneira de complementar a abordagem do reducionista de dissecar os processos moleculares dos sistemas vivos é tomar o caminho inverso de reconstituir comportamentos celulares usando um conjunto mínimo de componentes biológicos. Uma parte crítica dessa abordagem envolve o encapsulamento confiável de biomoléculas em um volume confinado, uma característica fundamental de uma célula.

e_content "> Várias estratégias existentes para o encapsulamento de biomoléculas para estudar sistemas biomiméticos. O sistema mais biologicamente relevante é membranas de bicamadas de lípidos, que imitam os constrangimentos físicos e bioquímicos impostas pela membrana plasmática da célula. Formação de vesículas unilamelares gigantes (GUVs) por eletropolimerização 7, uma das técnicas mais amplamente utilizadas para a geração de GUV 14, tem, tipicamente, uma baixa eficiência de encapsulação devido à sua incompatibilidade com tampão de alto teor salino 8. eletropolimerização também requer grandes volumes de amostra (> 100 mL), o qual pode ser um problema para o trabalho com proteínas purificadas , e de forma ineficiente incorpora moléculas grandes, devido à dificuldade de difusão entre as camadas lipídicas espaçados. Várias abordagens de microfluidos para gerar vesículas lipídicas foram desenvolvidos. Os métodos de emulsão dupla, que passam através de duas componentes de interfaces entre as camadas de água-óleo-água (W / O / W), baseia-se na evaporação de um volatile solvente para conduzir a formação de bicamada lipídica 9. Outros utilizaram uma linha de montagem de microfluidos, que produz um fluxo contínuo de vesículas lipídicas de duas camadas 10 ou em duas etapas independentes de 11. Desenvolvemos uma técnica alternativa baseada em rápida aplicação de impulsos de fluido de encontro a uma bicamada de interface gota 12 para produzir GUVs de tamanho controlado, composição, e de encapsulamento. A nossa abordagem, conhecida como jacto de microfluidos, oferece as vantagens combinadas de várias técnicas de geração de vesículas existentes, proporcionando uma abordagem para a criação de sistemas de biomoléculas funcionais para investigar uma variedade de problemas biológicos.

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Protocolo

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1. Infinito Câmara Fabricação

  1. Projetar a câmara infinito (nomeado para a sua forma), utilizando um software de desenho assistido computador (CAD), e salve o arquivo de tal forma que seja compatível com um cortador de laser. Para criar esta forma, separados dois círculos de diâmetro 0,183, em por uma distância centro-a-centro de 0,15 cm Corte da câmara de 1/8- 3/16 em acrílico transparente com o cortador a laser. A forma infinito facilita interface de formação em bicamada gota e estabilidade.
  2. Broca de 1/16 em buraco através da borda da caixa de acrílico para o infinito em forma de poço. Repita no lado oposto. Corte um pequeno rectângulo de uma folha de acrílico 0,2 milímetros com uma tesoura ou um cortador a laser para servir como uma base para os poços.
  3. Aplicar uma camada fina, mas completa da cola de secagem rápida, para um lado do acrílico 0,2 mm e colá-la para o fundo da câmara. Segurar o acrílico 0,2 milímetros firmemente no lugar contra o fundo da câmara e dispensara cola na interface para permitir que a cola para criar uma vedação, mas evitar que cobre a área de visualização. Certifique-se de alinhar o acrílico de modo que sua borda fique nivelada com a borda da parede da câmara e cobre completamente o recorte câmara infinito. Isto irá permitir a penetração de jacto suficientes e evitar fugas do poço.
  4. Corte dois pequenos pedaços de borracha natural para cobrir os furos. Aplicar a cola de secagem rápida ao redor do buraco. Coloque a borracha em cima do buraco e de imprensa em todas as áreas com um par de fórceps para fixar. Repita o procedimento para os dois furos. Certifique-se de que todas as ligações são coladas juntas completas, de modo a impedir qualquer fuga.
  5. Usando um 23 L, 1 em agulha, fazer um buraco na borracha natural em ambos os lados da câmara a fim de facilitar a inserção da ponta do jacto de tinta piezoeléctrica.

2. Preparação Experimental

Solução estoque loja de lipídios em clorofórmio em um freezer -20 ° C. Para este estudo, ou 1,2-diphytanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC) ou 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) foi usado. 2 ml de 25 mg / ml de solução de lípido é tipicamente preparado neste protocolo e vai durar durante dois meses, quando armazenada a -20 ° C.

  1. Para voltar a suspender o lípido em n-decano, primeiro transferi-lo de um frasco de estoque para um pequeno frasco de vidro, e seca suavemente sob árgon ou azoto. Segurar o frasco num ângulo durante a secagem para expor mais a área de superfície para o gás, permitindo o lípido para secar mais rapidamente.
  2. Com a tampa do frasco apenas ligeiramente enroscada, permitir que a solução foi seca ao sentar-se sob vácuo num exsicador durante 1-2 horas. Em seguida, adicionar n-decano, para ressolubilizar o lípido de 25 mg / ml. Vortex a solução brevemente lipídico e sonicate-lo em um banho de ultra-sons para 15 min. Armazenar o lípido reconstituído em n-decano, a -20 ° C.
  3. Prepara-se uma solução estoque de sacarose. Num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, adicionar 900 ul de 300 mM de sacarose e 100 ulde 1% de metilcelulose (MC). A metilcelulose é adicionado para aumentar a viscosidade da solução, o que ajuda no jacto. Etapa opcional: Adicionar um opcionais 1 ml de corante alimentar de cor escura ou partículas fluorescentes para dar mais contraste ou fluorescência em imagem, respectivamente. Esta solução é uma solução de 300 mOsm sacarose concebido para corresponder a osmolaridade celular e para proporcionar contraste durante microjetting.
  4. Desenhar a solução numa seringa de 1 ml descartável de plástico. Enquanto segura a seringa com a ponta virada para cima, apertar o eixo várias vezes para expulsar as bolhas em direção à ponta, e empurre o êmbolo para retirar o ar aprisionado. Certifique-se de evacuar todo o ar da seringa antes de prosseguir, uma vez que irá interferir com a contração adequada piezoelétrico responsável por jateamento.
  5. Instalar um filtro de 0,22 um na extremidade da seringa. Para evitar que o ar fique preso no filtro, segure a seringa na vertical e empurre o êmbolo até que uma gota se forma acima da ponta. Nota: A33 milímetros de diâmetro unidade de filtro de seringa foi encontrada a funcionar melhor, mas os filtros alternativos tão pequeno como um diâmetro de filtro seringa de 3 mm podem ser utilizados para reduzir o volume morto.
  6. Soltar o adaptador Luer fêmea do jato de tinta, e pressione-o firmemente no lugar durante o fim do filtro. Mais uma vez, ejetar fluido para evitar a retenção de ar. Aperte a parte superior do jato de tinta. Fluid deve viajar para a ponta do jato de tinta depois que ele é completamente conectado.

3. Preparando o Equipamento

  1. Usando um v-braçadeira, montar o conjunto de seringa na platina do microscópio. Ligue o fio do jato de tinta para o controlador de jato de tinta. Nota: A fase de costume foi construído para este protocolo, enquanto que a concepção fase pode ser determinada pelo utilizador, que é crítico para o controle xyz independente da seringa e controlo xy do suporte da amostra.
  2. Determinar a ampliação e combinação necessária para atingir a lente de imagem desejada. Aqui, uma objetiva de 10X e 10X ocular são usados.
  3. Use uma câmera de alta velocidade (≥ 1.000 fps) para visualizar a jorrar e geração de vesícula. Antes de imagem, executar necessário calibração da câmara. Utilize auto-trigger com base em imagens dentro do software da câmera para iniciar a captura de imagem.
  4. Monte a câmara infinito para o palco microscópio. Fixe a câmara gravando-o no lugar no palco.
  5. Alinhe cuidadosamente a ponta de jato de tinta com o buraco perfurado na borracha natural (ver Figura 1b). Para fazer isso, trazer a jato de tinta próximo da câmara e ajustar o posicionamento por olho, em seguida, fazer ajustes mais precisos através da lente do microscópio. Proceda com cautela, como movimentos grosseiros pode danificar a ponta de jato de tinta.
  6. Uma vez que o jacto de tinta é alinhada, voltar o conjunto da seringa para fora da câmara para impedir qualquer dano para o jacto de tinta, durante o carregamento dos poços. Certifique-se que o movimento do jato de tinta é unidirecional para que ele permaneça alinhado com o furo na membrana.
  7. Pressione suavemente sobre a plunger do conjunto da seringa até que uma pequena gota de formas no bico jato de tinta. Isso irá fornecer algum contrapressão inicial.
  8. Introduza os parâmetros de jateamento. Para uma onda bipolar trapezoidal, utilize os seguintes parâmetros: frequência de 20 kHz de pulso, tempo de 3 ms ascensão, 35 ms de duração de pulso, tempo de 3 ms queda, 65 V de tensão aplicada (amplitude de pulso), e 100 pulsos por jato de gatilho (número de pulsos) . No entanto, a tensão aplicada (a amplitude do pulso) e o número de impulsos (pulsos de jacto por gatilho) pode ser variado para controlar o tamanho das vesículas.

4. Vesícula Geração

  1. Adicionar 25-30 uL solução lipídica suspensa em n-decano, para a câmara de infinito, que cobre toda a superfície de ambos os poços.
  2. Adicionar 25 mL de glicose (de mesma osmolaridade que a solução de sacarose) para a borda externa de um bem, pipetagem lenta e suavemente. Após a deposição, uma queda de glicose devem formar, porque a glicose e de lipídios não se misturam. Adicione mais 251; l de glicose para o bem de frente, o que fará com que uma gota e formar a membrana de dupla camada de lípido no meio da câmara dentro de 5-10 min.
  3. Insira a jato de tinta através da borracha natural e, cuidadosamente, orientá-la para a bicamada interface de gota. Aproxime-se da bicamada lentamente, como a jato de tinta introduzida deslocará volume e pode romper a bicamada.
  4. Quando o jato de tinta é dentro de ~ 200 mM, aplique o jateamento com as definições descritas no passo 3.8. A distância a partir da bicamada pode variar dependendo principalmente da quantidade de tensão e de impulso, entre outros parâmetros. Este protocolo recomenda aumentando lentamente configurações (tensão e número de pulsos) e observando a deformação bicamada.

5. Limpeza do equipamento

  1. Separe o conjunto seringa do estágio do microscópio, e dispor do 1 ml seringa de plástico e filtro.
  2. Para limpar a jato de tinta, aspirar as seguintes soluções na ordem mergulhando a ponta na solution 7-10x cada: etanol a 70%, solução a 2% Neutrad em água quente, etanol a 70%, e ddH 2 O. Se a jato de tinta não se encaixa com segurança na pipeta de aspiração, corte uma ponta de pipeta para formar um adaptador.
  3. Seca-se a câmara com o tecido. Coloque a câmara de infinito em um copo de 250 ml com 2% v / v Neutrad em água morna, e sonicado por 5-10 min. Após sonicação, seque cuidadosamente os poços sob ar comprimido. Qualquer humidade em poços pode comprometer a estabilidade da membrana de bicamada lipídica, de modo que também é recomendável que as câmaras são colocadas num forno a 60 ° C durante 15 min.

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Resultados

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Nós montamos uma configuração jorrando microfluídicos em um microscópio de fluorescência invertido convencional com um palco personalizado montado a partir de peças usinadas e micrômetros manuais (Figura 1). Caracterização do jato de tinta fornece insights sobre o processo de geração de vesícula. Variando a distância entre o bico de jacto de tinta e bicamada lipídica afecta a força aplicada para provocar a deformação da membrana. Perto da bicamada concentra a corrente de jacto e impede a membrana a part...

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Discussão

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Muitas técnicas têm sido desenvolvidas para a produção de vesículas, incluindo eletropolimerização, emulsão, e de geração de gotículas 14-16. No entanto, novas técnicas experimentais são necessários para permitir a concepção de sistemas biológicos com a crescente semelhança com os sistemas vivos. Métodos microfluídicos em particular, têm oferecido um aumento do nível de controle que regem unilamellarity membrana, monodispersity de tamanho e conteúdo interno 17,18, trazendo modelos vesícula mais per...

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Divulgações

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Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

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Agradecemos a Mike Vahey do Lab Fletcher, da Universidade da Califórnia, em Berkeley para aconselhamento sobre os parâmetros microjetting. Este trabalho foi patrocinado pelo NIH conceder DP2 HL117748-01.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Jato de tinta piezoelétricoMicroFab TechnologiesMJ-AL-01-xxxxxx denota diâmetro do orifício em mícrons
Controlador Jet Drive IIIMicroFab TechnologiesCT-M3-02
Câmera de alta velocidadeVision ResearchMiroEX2
DPhPC lipídio em clorofórmioAvanti850356CEncomendado em pequenas alíquotas em frascos de
33 mm PVDF filtros, 0,2 e micro; mFisher ScientificSLGV033RS
Seringas de 1 mlFisher Scientific14823434
n-DecanoAcros Organics111871000
GlicoseAcros Organics410950010
SacaroseSigma-AldrichS7903-1KG
MetilceluloseFisher ScientificNC9084958
1/8 in AcrílicoMcMaster Carr8560K239Desenhos CAD para a câmara em forma de infinito estão disponíveis mediante solicitação
0.2 mm AcrílicoAstra ProductsClarex clear 001
Acrílico CimentoTAP Plastics10693
Loctite 495 SupercolaFisher ScientificNC9011323
Loctite 3494Estroboscópios Adesivos de Fortalecimento UV Fornecimento30765
de borracha naturalMcMaster Carr85995K14
Estágio personalizadocaseiro N / ACAD projetos estão disponíveis mediante solicitação

Referências

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