O manuscrito descreve as etapas necessárias para realizar o transplante cardíaco heterotópico no mouse.
Artigo de método
Técnica de transplante heterotópico Murino Coração
Neste artigo
Resumo
Resumo
É agora mais de quarenta anos desde que esta técnica foi primeiramente relatada por Corry, Wynn e Russell. Embora tenha demorado alguns anos para outros laboratórios para se tornar proficientes em e utilizar esta técnica, é hoje amplamente utilizada por muitos laboratórios em todo o mundo. Um refinamento significativo para a técnica original foi desenvolvido e relatado em 2001 pelo Niimi. Descrito aqui estão as técnicas que evoluíram ao longo de mais de uma década nas mãos de três cirurgiões (Plenter, Grazia, Pietra) em nosso centro. Estas técnicas estão sendo repassados para uma nova geração de cirurgiões e pesquisadores.
Baseado em grande parte na experiência Niimi, os procedimentos utilizados têm evoluído nos pequenos detalhes - detalhes que vamos nos esforçar para relatar aqui, de tal forma que outras pessoas podem ser capazes de usar este modelo muito útil. Como Niimi, descobrimos que um auxiliar de vídeo para a aprendizagem é um recurso de valor inestimável para o novato.
Introdução
Numa época em que é possível realizar transplantes de rim, pulmão, fígado e pâncreas em ratos, a pedra angular de transplante de órgão de pesquisa básica e imunologia desde 1973 1-4 permanece o modelo de transplante cardíaco heterotópico no mouse. Nos anos seguintes vários artigos foram publicados detalhando melhorias / aperfeiçoamentos 5,6 a este procedimento.
Como um modelo de transplante de órgãos sólidos, principalmente vascularizado este procedimento é segundo a nenhum. Uma vez dominado este procedimento se presta à investigação de respostas de rejeição alogênicos 7, o desenvolvimento de vasculopatias crônicas 8 e os mecanismos de lesão de isquemia e reperfusão 9.
As chaves para a aprendizagem com sucesso este procedimento são como qualquer outra cirurgia, paciência por parte do instrutor e do estagiário e atenção aos detalhes. No início do processo, o cirurgião irá encontrar novos que they vai gastar muitas horas em cada transplante. À luz da experiência adquirida, tempos cirúrgicos e, portanto, a isquemia, irá reduzir drasticamente. Prestar atenção aos detalhes de cada passo, mais cedo ou mais tarde levar ao sucesso.
Enquanto o instrutor pode fazer o seu melhor para passar, e para antecipar, todas as possíveis quedas do poço que podem ser encontrados durante estas cirurgias, o estagiário "criativa" provavelmente vai encontrar alguns dos seus próprios!
Os princípios básicos do procedimento são os seguintes. O doador ascendente do arco aórtico é ponta-a-lado anastomosada à aorta abdominal destinatário ea artéria pulmonar de doadores é de ponta-a-side anastomosado ao destinatário abdominal da veia cava inferior (VCI). O sangue flui desde a aorta do receptor em forma retrógrada pela aorta dador para as artérias coronárias. Quando o sangue fluiu através do sistema coronário que drena para o átrio direito através do seio coronário, é bombeado para o ventrículo direito eem seguida, através da artéria pulmonar para o destinatário da VCI. Desta forma, o sistema é fornecido coronária arterial e ritmo sinusal retorna para o enxerto dentro de 1-2 min de reperfusão. Desde as câmaras esquerdas do coração são, essencialmente, a pressão sub-carregado na parede livre do ventrículo esquerdo vai atrofiar com o tempo.
Protocolo
Todos os animais foram alojados em condições livres de patógenos na Universidade de Colorado Barbara Davis Centro Biotério sob aprovação IACUC e tratados de acordo com as diretrizes do NIH.
Profundidade da anestesia é julgado por toe pitada inicialmente e pela observância da taxa de respiração uma vez que o processo já começou.
1. Coração doador Colheita
- Anestesiar o rato doador através da injeção de pentobarbital (60 mg / kg IP).
- Imobilizar o mouse pelas restrições de 4 vias e clipe da pele. Limpe a pele com álcool.
- Após dissecação afastado da pele, abrir a cavidade abdominal através de uma incisão transversal logo abaixo do diafragma.
- Corte o diafragma para posterior inserção costal e levantar a parede anterior do tórax anterior e superiormente expondo o coração.
- Estender uma espessura total cortar o posterior cavidade torácica lateral nos lados esquerdo e direito do peito.
- Isolar oveia cava inferior (VCI) e coloque um frouxo 5-0 seda de sutura ao redor do IVC adjacente à sua inserção no átrio direito.
- Injetar 1,0 cc de 4 ° C salina heparinizada (200 u / cc) para o IVC, então ligadura do vaso com a sutura de seda 5-0 e dividir.
- Isolar o direito da veia cava superior (VCSD) de forma semelhante e ligadura com fio de seda 5-0 e dividir.
- Rolo delicadamente o coração para o lado direito dos animais e isolar a veia cava superior esquerda (VCSE), ligadura com um fio de seda 5-0 e dividir a exposição da artéria pulmonar esquerda.
- Fixe o coração sob uma gaze molhada, enquanto o timo é fechado dissecado de distância da principal artéria pulmonar (AP) ea PA ramos direito e esquerdo e ascendente do arco aórtico.
- Blunt dissecar o arco aórtico livre dos tecidos circundantes. Micro-tesoura são utilizados para dividir o proximal da aorta até a artéria braquial-cefálica direita, ou seja, não deve haver ramos entre o coração ea divisãoponto da aorta.
- Esta secção do arco aórtico forma o manguito arterial para o processo de implante.
- Refletir a braçadeira aórtica inferiormente para expor o tronco PA e os ramos direito e esquerdo do PA.
- Blunt dissecar os ramos PA esquerdo e direito longe dos tecidos circundantes, tanto do coração quanto possível. Isto permite a fácil dissecção do tronco PA a partir de tecidos circundantes.
- Divida o tronco PA como distalmente quanto possível, logo proximal à sua bifurcação. Esta secção da artéria pulmonar faz o manguito venoso para o processo de implante.
- Coloque uma seda de sutura 5-0 em torno da base do coração e laço. O coração é em seguida cortada na base livre, e colocado em solução salina a 4 ° C. O tempo total de colheita é de aprox. 10-15 min.
2. Técnica de Implantes Coração
- Anestesiar os ratos receptores com pentobarbital (60 mg / kg de dose inicial de IP, 25 mg / kg IP dose suplementar, se necessário).
- Clipe da pele eimobilizar o mouse pelas restrições de 4 vias e preparar a pele com iodopovidona e cortina de forma estéril.
- Adicione de 2 cm na linha média abdominal incisão vertical e entrar na cavidade abdominal.
- Recolha o intestino superiormente e exteriorizada para o peito. Manter envolto em gaze úmida estéril (solução salina estéril) em todo o caso.
- Isolar a aorta abdominal e veia cava inferior (IVC) abaixo dos vasos renais e colocar 4-0 laços de algodão em torno da aorta e veia cava inferior superior, então inferior à do local da anastomose.
- Identificar todos os vasos lombares dentro do campo e ligar com sutura de nylon 10-0.
- Ate os laços de algodão, primeiro o inferior seguido do superior. Deste modo algum sangue é retida na aorta fazendo o Aortotomia mais fácil.
- Formar o Aortotomia com uma agulha de 30 G para introduzir o lúmen da aorta. Estender a incisão com micro tesouras finas a um comprimento de aproximadamente 2 mm. Esta incisão é feita em uma linha reta ao longo da longaitudinal eixo do navio.
- Faça um fim a anastomose da aorta do doador para a aorta destinatário da seguinte forma. Coloque um 10-0 sutura nylon estadia ponto na aorta do doador e para o ângulo inferior da incisão na aorta destinatário e gravata. Coloque um segundo 10-0 nylon oposto ao primeiro na aorta do doador e do canto superior da incisão na aorta abdominal e gravata.
- Faça uma linha de sutura contínua de superior para inferior na parede lateral da aorta e empate contra o ponto estadia previamente colocado. Não se esqueça de trazer os INTIMAS (superfície vaso interior) juntos, como você costurar. Então suturar o lado medial de forma corrida e gravata. O primeiro e último ponto de cada lado deve ser colocado o mais próximo possível dos pontos estadia possível. Em seguida, ter em vista que 3 pontos uniformemente espaçados entre estes dois perfazendo um total de 5 pontos.
- Faça um fim a anastomose da artéria pulmonar dador até ao receptor IVC da seguinte forma. Puncture a VCI com uma agulha 30 G e estender a incisão durante aprox. Dois milímetros com micro tesoura fina. Esta incisão é feita numa linha recta ao longo do eixo longitudinal da embarcação.
- Amarre a artéria pulmonar do doador para o canto inferior da incisão na VCI com 10-0 nylon. Coloque um segundo 10-0 nylon oposto ao primeiro na artéria do doador e do canto superior da incisão no IVC e gravata.
- Faça uma linha de sutura contínua entre a artéria pulmonar ea veia cava inferior e gravata. O primeiro e último ponto de cada lado deve ser colocado o mais próximo possível dos pontos estadia possível. Em seguida, ter em vista que 5 pontos uniformemente espaçados entre esses dois fazendo um total de 7 pontos.
- Solte o algodão 4-0 empate fluxo venoso restabelecer distal.
- Uma vez que a hemostasia da anastomose venosa tem sido observado o proximal empate 4-0 algodão está gradualmente afrouxados ea anastomose arterial observada para a hemostasia. Quando ambas as anastomoses são consideradas seguras, retire o cotton amarra do mouse.
- Retorne o intestino ao abdômen. A parede abdominal é fechada em duas camadas utilizando 5-0 suturas de seda de uma maneira em execução.
- Administrar um bolus de 1,0 ml de solução salina esterilizada quente no abdômen como reposição volêmica após o fechamento, e 0,8 ml de soro fisiológico é injetado por via subcutânea no pós-operatório. Não são necessárias outras medidas de suporte durante a cirurgia. Recuperar o animal em uma manta térmica. Tempo de implante total é de aprox. 90-120 min para iniciantes, 45-60 min com a experiência. Administrar analgesia buprenorfina, 0,05 mg / kg, SC, 0,1-0,2 ml no início do procedimento e cada 6-12 horas para 72 horas pós-op.
3. Avaliação Enxerto
- Avaliar a função do enxerto diariamente por palpação trans-abdominal.
- Segure o mouse como se fosse para ser dada uma injecção intraperitoneal.
- Pressione suavemente a ponta de um dedo indicador contra a parede abdominal e determinar o str espancamentoength e regularidade do enxerto.
- Dê qualidade palpação uma pontuação de 4 (amplitude e frequência normal) para 0 (não bater rejeitado enxerto).
NOTAS IMPORTANTES:
Todos os instrumentos são esterilizados, luvas estéreis são usados durante todo o procedimento e um campo estéril é mantida. As cirurgias dadoras e receptoras são realizadas com o uso de um microscópio de operação. Certifique-se de que as anastomoses são "limpa". Isto é, que as paredes traseiras não são capturados ao colocar pontos. Isso fará com que uma constrição significativa a fluir que mais do que provavelmente resultam em um enxerto falhou e, em casos extremos para as posteriores de membros paralisia. Também é extremamente importante que a espessura total passa incluindo a adventícia vascular e íntima da agulha de sutura são alcançados. Eversão das bordas também assegura que não há contacto íntima-a-íntima, que ajuda na cura e selagem das anastomoses. Outro fato de importância vitalou é assegurar que a tensão das linhas de sutura de anastomose também é óptima. Muito solto e não haverá vazamento irreversível, muito apertado e estenose a fluir irá resultar. Se no lado arterial isto irá resultar em má perfusão do enxerto, se no lado venoso de um coração congestionado vai resultar.
Resultados
A utilização desta técnica cirúrgica abre o caminho tanto para estudos de sobrevivência do enxerto / rejeição simples, ou protocolos experimentais bastante complexas. No estudo brevemente descrito na figura abaixo, buscou-se definir o envolvimento, se houver, de Fas e / ou perforina como mecanismos de rejeição cardíaca celular mediada CD4 T. Isto foi possível graças à extraordinária variedade de linhagens de camundongos que estão disponíveis hoje. Os resultados demonstram que a rejeição direta de aloenxertos cardíacos por células efetoras CD4 T requer a contribuição alternativa de enxerto expressão de Fas e T expressão perforina celular. Para o nosso conhecimento, esta é a primeira demonstração de que a atividade citolítica de células T CD4 pode desempenhar um papel obrigatório para a rejeição do enxerto aguda primária in vivo.
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. Figura 1 Perforin e Fas Representar Obrigatórios e vias paralelas de CD4 T mediada por células B6 rejeição cardíaca, B6 PFPKO (perforina knock-out) e B6 GLD (deficientes Fas-ligante), as células T CD4 foram utilizados para reconstituir B6 rag - / - destinatários de C3H tipo selvagem ou C3H Fas-deficiente lpr aloenxertos cardíacos. Remoção de sozinho Fas (♦, p = NS vs controle Wt C3H + B6 células T CD4) dos corações de doadores ou remoção ou perforina sozinho a partir de células T CD4 (■, p = NS vs controle Wt C3H + B6 CD4 T células) não revogar rejeição. Curiosamente, a remoção de FasL de efectores de células T CD4 fez rejeição demora significativamente (●, p <0,02 versus células C3H Wt + B6 T CD4, p <0,01 versus células C3H Wt + B6 PFPKO T CD4, e p <0,01 vs . C3H lpr + B6 células T CD4). No entanto, a maioria dos enxertos ainda foram rejeitadas (4 de 5). Significativamente, a remoção simultânea do dador Fas e CD4 T perforina celularrejeição completamente revogada (○, p <0,002 vs controle Wt C3H + B6 células T CD4, Wt C3H + B6 células T CD4 PFPKO e C3H lpr B6 células T CD4 +). Esta revogação foi significativamente mais forte do que a remoção individual de FasL células CD4 T (○, p <0,003 vs controle Wt C3H + B6 GLD células T CD4). De Grazia et al 10. Reproduzido com permissão.
Discussão
Esta técnica cirúrgica não é fácil de dominar, mas uma vez dominado é uma poderosa ferramenta de pesquisa. O pesquisador / cirurgião é recompensado pela consistência técnica e pela atenção aos detalhes. Paciência durante a fase de aprendizagem é fundamental. Conforme publicado pelo Niimi 3, com o auxílio de uma ferramenta de aprendizagem de vídeo baseado leva uma média de 11 tentativas para conseguir o primeiro procedimento bem sucedido e 78 tentativas de alcançar uma taxa de sucesso de 90%. Vídeos tornaram-se uma importante ferramenta de ensino em cirurgia 11,12.
Solução de problemas
Sangramento das anastomoses podem ocorrer e isso é provavelmente devido a qualquer falta de tensão correta nas suturas, ou muito poucas suturas. Enquanto a coagulação do agente indutor, como Gelfoam pode ser útil para reduzir vazamentos, recomendamos que o cirurgião deve contar com boa técnica. Coração não bater congestionada é mais comumente devido à anastomose de que estão muito apertadas, principalmente no lado venoso. A não-beating, enxerto não perfundido é geralmente causada por uma bolha de ar que percorreu a uma das artérias coronárias. É importante manter uma área de humidade a húmido para evitar a entrada de bolhas para dentro dos vasos.
Limitações da técnica
Esta técnica não é adequada se um investigador pretende investigar efeitos sobre um coração a funcionar em pleno. Isso exigiria uma técnica de transplante ortotópico, que até à data tem-se revelado impossível de executar.
Significância com respeito aos métodos existentes
Se alguém deseja estudar os efeitos sobre um transplante de órgão totalmente vascularizado, sólida no mouse, em seguida, o modelo de coração é provavelmente o mais simples de dominar. Modelos do rato do pulmão, rim e transplante de fígado existem, mas são muito mais difíceis de aprender e perfeito.
As etapas críticas no âmbito do protocolo
É de vital importância que a espessura total pasnos incluindo a adventícia vascular e da íntima da agulha de sutura, são alcançados. Eversão das bordas também assegura que não há contacto íntima-a-íntima, que ajuda na cura e selagem das anastomoses. Outro factor extremamente importante é assegurar que a tensão das linhas de sutura de anastomose também é óptima. Muito solto e não haverá vazamento irreversível, muito apertado e estenose a fluir irá resultar. Se no lado arterial isto irá resultar em má perfusão do enxerto, se no lado venoso de um coração congestionado vai resultar.
Acima de tudo, a repetição, a consistência do processo e contínua atenção aos detalhes irá produzir grandes resultados e dados financiáveis e publicáveis.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Biagio Pietra por seu trabalho anterior em nosso laboratório.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Instrumento | Roboz # | Fine Science Tools # | Arosurgical # |
| Pinça de microdissecação reta # | RS-5015 | 11295-51 | |
| Pinça de microdissecação curva # | RS-5047 | 11297-00 | |
| Pinça serrilhada curva | RS-5137 | 11052-10 | |
| Tesoura de microdissecação Vannas, curta | RS-5610 | 09.140.08 | |
| Tesoura de microdissecação, reta, afiada, longa | 11.602.11 | ||
| com cabo de mola micro | 11.549.15 | ||
| Pinça | 91308-12 | ||
| Tesoura de microdissecação, reta, sem corte | RS-5962 | 14078-10 | |
| Tesoura de microdissecação, curva, romba | RS-5981 | 14079-10 | |
| Micro retrator | RS-6540 | ||
| Bandeja de instrumentos, 10" x 6 ½ ” x ¾ " | RT-1350S | ||
| Sutura de seda, 5/0, carretel de 22,5 m | 18020-50 | ||
| Aplicadores | de algodão Marca Fisher, #23-400-100 | ||
| Cotonetes de iodo-povidona | PDI, #B40600 | ||
| 4/0 Laços de algodão Algodão | doméstico autoclavado com instrumentos |
Referências
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- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3,000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20 (10), 1123 (2001).
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Reimpressões e permissões
