Dois métodos para estabelecer células endometriais Humano estromais primários de espécimes de histerectomia

Summary

Estabelecimento de sistemas de cultura primária de células do estroma endometrial a partir de espécimes de histerectomia é uma técnica biológica valioso e um passo crucial antes de prosseguir uma vasta gama de pesquisa objetiva. Aqui, descrevemos dois métodos utilizados para estabelecer culturas de tecidos do estroma endometriais ressecados cirurgicamente de pacientes humanos.

Abstract

Muitos esforços têm sido dedicados a estabelecer em sistemas de cultura de células in vitro. Estes sistemas são concebidos para modelar um vasto número de processos in vivo. Sistemas de cultura de células resultantes de amostras endometriais humanos não são excepção. As aplicações vão desde processos fisiológicos normais cíclicos de patologias endometriais, tais como cancros ginecológicos, doenças infecciosas, e deficiências na função reprodutora. Aqui, oferecemos dois métodos para o estabelecimento de células estromais endometriais primários de espécimes ressecados cirurgicamente histerectomia endometriais. O primeiro método é referido como "o método de raspagem" e incorpora raspagem mecânica usando lâminas cirúrgicas ou de barbear ao passo que o segundo método é denominado "o método de tripsina." Este último método utiliza a actividade enzimática da tripsina para promover a separação de células e primário conseqüência celular. Nós ilustramos metodologia passo-a-passo através de imagens digitais e microscopia. Nós também provide exemplos para validar as linhas de células estromais do endométrio através de tempo real, as reacções em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) e imunofluorescência (IF).

Introduction

O corpo do útero humano é composto por três camadas, a perimétrio (ou serosa), miométrio e endométrio. Distinguindo cada uma destas camadas é um passo importante para estabelecer linhas de células do endométrio. O perimétrio é a camada mais exterior do útero e do composto, as células serosas finas. O miométrio é a espessura da camada, meio do útero e composta por células de músculo liso. O endométrio é identificada como a camada interna do útero e inclui populações epiteliais e células estromais.

O endométrio é subdividida na camada basal, cuja população de células-tronco é a hipótese de repovoar a camada functionalis aproximadamente a ca....

Protocol

Espécimes de histerectomia utilizadas neste manuscrito foram coletadas em concordância com um protocolo de ética da Universidade IRB-aprovado numeradas IRB-HSR # 14424.

1. Aquisição de exemplo de origem clínica

1. Obter governo e diretrizes éticas baseadas em instituições e documentação de aprovação antes de começar.
2. Realizar todas as etapas condições estéreis.
3. Preservar tecido derivado do paciente em meio (RPMI ou DMEM / Glucose alta) em um tubo de 50 ml a 4 ° C, se a amostra não pode ser processada em cultura imediatamente. As amostras podem ser armazenadas neste estado por um período máximo de 24 horas.

Results

Conforme enfatizado na seção de protocolo, não se esqueça de realizar todos os métodos sob governo, institucionais e diretrizes éticas ao manusear e preparar o tecido humano.

Incluídos neste manuscrito é uma ilustração do fluxo de trabalho geral de "o método de raspagem" (Figura 1A) e "o método de tripsina" (Figura 1B) utilizados para estabelecer culturas primárias de endométrio. Estes métodos são descritos em detalhe na secção de pr.......

Discussion

Outros grupos descritos e adaptado metodologia para a preparação de culturas do estroma do endométrio, a maioria dos quais utilizam colagenase ^{4,12,13,15-18.} Neste manuscrito, nós fornecemos metodologia e evidências para dois métodos de cultura de estroma endometriais simplificados primários, os quais são utilizados por nosso laboratório por razões económicas ea disponibilidade conveniente de tripsina e / ou uma lâmina de barbear.

Ao comparar os nossos dois métodos, ambos geram su.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25 Tripsina ou 0,05% Tripsina	Hyclone	SH3023602 ou SH30004202
Tubo de Centrífuga de 1,7 micro	Genesee Scientific	22-272A
1 µ l, 20 µ l, 200 ml e 1.000 µ l Pipeta	ml Genesee Scientific	24-401,24-402, 24-412, 24-430
	Hyclone	339650
50 ml	Hyclone	339652
Prato para Cultura de Células de 6 cm	Thermo scientific	12-556-002
Câmaras de 8 poços	Thermo Scientific	AB-4162
Acetato	Fisher scientific	C4-100
AMV RT Enzima/Tampão	Bio Labs	M077L
Albumina de Soro Bovino (BSA)	Fisher Scientific	BP-1605-100
Zinco Tamponado Formalina	Thermo	59201ZF
Tira de carvão FBS	Fisher	NC9019735
clorofórmio	Fisher Scientific	BP1145-1
Capa de lamínula	Fisher Brand	12-544D
Cyclic AMP (cAMP)	Sigma	B7880
DMEM/Alta Glicose	Hyclone	SH30243FS
dNTP	Bioline	BIO-39025
Burro Anti Cabra -TRITC	Soro de Burro Santa Cruz	SC-3855
	Jackson' s lab	017-000-002
E Anticorpos de caderina	Epitomics	1702-1
Etanol	Fisher Scientific	BP2818-1
Soro Fetal Bovino (FBS)	Fisher Scientific	03-600-511
Anfotericina Fungizone B	Sonda GAPDH Gibco	15290-018
	Life Technologies	HS99999905
Glicogênio	5Prime	2301440
Mouse Anti Cabra - FITC	Jackson' s Lab	115-096-003
Isopropanol	Fisher Scientific	BP2618-1
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5
Acetato de Medroxiprogesterona (MPA)	Sigma	M1629
MeOH (Metanol)	Fisher Scientific	A4-08-1
(com DAPI)	Labratórias Vetoriais	H-1500
N6 DNA Oligos	Raspador Invitrogen
Número 15	BD	371615
Pan Citoqueratina  Mouse mAB	Sinalização Celular	4545
PBS (solução salina tamponada com fosfato)	Fisher Scientific	BP-399-4
Solução de Glutamina Penicilina-Estreptomicina 100X	Hyclone	SV30082.01
PML Anti Goat Anti body	Santa Cruz	SC-9862
Primer(s)	Eurofins
RPMI	Hyclone	SH30027FS
RPMI (sem fenol)	Gibco	11835
Sybr Verde	Thermo Scientific	AB-4162
Taqman	Thermo	AB-4138
Trizol	Life Technologies	15596018
Anticorpo Vimentina	Epítomica	4211-1