Um método eficiente para Quantitativa, Análise de células Único de cromatina Modificação e Arquitetura Nuclear em Todo-mount óvulos em<em&gt; Arabidopsis</em

Resumo

Nós fornecemos aqui um protocolo eficiente e confiável para a imunocoloração, hibridação in situ fluorescente, a coloração do DNA seguido de quantitativo, imagem de alta resolução em Arabidopsis thaliana óvulos inteiros de montagem. Este método foi utilizado com sucesso para analisar as modificações da cromatina e arquitectura nuclear.

Resumo

Em plantas com flores, a transição destino de células somáticas-to-reprodutiva é marcada pela especificação de células-mãe de esporos (PMEs) em órgãos florais da planta adulta. O SMC feminino (célula mãe de megásporo, MMC) diferencia no primórdio óvulo e sofre meiose. O megásporo haplóide selecionado então sofre mitose para formar o gametófito multicelular feminino, o que dará origem aos gametas, o óvulo ea célula central, juntamente com células acessórias. A acessibilidade limitada do MMC, meiocyte e gametófito feminino no interior do óvulo é tecnicamente desafiador para citológico e análises citogenéticas em nível de célula única. Particularmente, imunodetecção directa ou indirecta de epítopos celulares ou nucleares é prejudicada pela falta de penetração dos reagentes no interior da célula vegetal e de uma única célula de imagem é demised pela falta de claridade óptica em todo-montagem tecidos.

Assim, desenvolvemos um método eficiente para analisar os nuclorganização orelha e modificação da cromatina em alta resolução de uma única célula em Todo-mount óvulos Arabidopsis incorporados. Ele baseia-se na incorporação de dissecção e óvulos fixos em uma fina camada de gel de acrilamida a uma lâmina de microscópio. Os óvulos embarcados são submetidos a tratamentos químicos e enzimáticos com o objetivo de melhorar a clareza do tecido e permeabilidade aos reagentes de positividade. Esses tratamentos preservar organização, DNA e proteínas epítopos celulares e cromatina. As amostras podem ser utilizadas para diferentes análises citológicas a jusante, incluindo a imunocoloração da cromatina, hibridação in situ fluorescente (FISH), e a coloração de ADN para análise de heterocromatina. Microscopia confocal a laser (CLSM) de imagem, com alta resolução, seguido de reconstrução 3D permite medições quantitativas na resolução de uma única célula.

Introdução

Em plantas com flores, o estabelecimento de linhagens de reprodução inicia-se com a diferenciação de células musculares lisas, MMC feminino e célula-mãe microspore masculino. A MMC desenvolve a partir de uma célula nucelar sub-epidérmica na ponta distal do primórdio óvulo, e a célula mãe micrósporos se desenvolve a partir de tecido esporogênico na antera lóculo, que estão localizados no fundo dos órgãos florais ^1. SMCs sofrer meiose para produzir esporos haplóides, que depois dão origem aos gametófitos sobre mitose. O gametófito feminino ou saco embrionário, consiste de uma célula-ovo, uma célula central, dois sinérgides e três antípodas. O gametófito masc....

Protocolo

O procedimento é descrito no fluxo de trabalho na Figura 1, e a configuração para a dissecção e a incorporação de tecidos são apresentados na Figura 2.

1. Fixação do tecido

1. Recolher 20-30 carpelos em um tubo de microcentrífuga contendo feita recentemente tampão fixador BVO em gelo.
2. Fixar o tecido 30 min com agitação suave à temperatura ambiente.
3. Girar os tubos contendo as carpelos em fixador em uma microcentrífuga de bancada 1 min a 400 x g.
4. Retire cuidadosamente o tampão fixador e adicionar 1 ml de PBT, colocar os tubos no gelo.

2.....

Resultados

Nós fornecemos um protocolo robusto para a preparação em grande escala e de processamento de óvulos Arabidopsis adequados para exames citológicos em todo-mount. Graças à incorporação, os óvulos manter uma estrutura 3-dimensional (Figura 3). Além disso, o processamento de tecidos, incluindo esclarecimento de imagem óptico permite estruturas subcelulares em alta resolução. Figura 4 mostra a coloração de DNA em todo primórdios óvulo de montagem onde heterochromatin aparece como br.......

Discussão

Em plantas com flores, a linhagem reprodutor feminino é cercado por várias camadas de células, incluindo o nucelo e os tegumentos óvulo, tornando assim a coloração citológica em toda montagem tecnicamente desafiador. Aqui apresentamos um protocolo eficiente que permite a preparação e processamento de um grande número de óvulos adequados para a coloração citológica como imunomarcação, a coloração do DNA e hibridização fluorescente in situ no todo-mount. Foi utilizado com sucesso para a análise da linhag.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Soluções
Tampão de fixação BVO (à base de32)			2 mM EGTA, pH 7,5, 1% (v/v) formaldeído, 10% DMSO, 1x PBS, 0,1% Tween-20
PBT			1x PBS, 0,1% Tween-20
PBT-F			1x PBT, 2,5% (v/v) formaldeído
30% acrilamida:bisacrilamida			3 g de acrilamida, 0,33 g de bisacrilamida, 1x PBS (prepare 10 ml, armazene a 4 ° C)
200 ml de mistura de acrilamida a 5% em PBS			34 ml de acrilamida a 30%: bisacrilamida, 166 ml 1x PBS (fazer fresco a partir de 30% do estoque)
20% de persulfato			amônio 0,2 g de persulfato de amônio, 1 ml de água estéril (prepare alíquotas com 1 ml e armazene a -20 ° C)
		de sódio a 20%	0,2 g de sulfito de sódio, 1 ml de água estéril (prepare alíquotas com 1 ml e armazene a -20 & C)
		enzimática da parede celular	0,5% (p / v) de celulase, 1% (p / v) de driselase, 0,5% (p / v) de pectolyase
Reagentes e materiais
Formaldeído	Sigma-Aldrich	F1635
DMSO	Sigma	D5879
Tris	Amaresco	0497
Etanol	Schaurlau	ET00102500
Metanol	Schaurlau	ME03062500
Xileno	ROTH	4436.1
Celulase	Sigma	1794
Driselase	Sigma	D8037
pectolyase	Sigma	P5936
Tween-20	Merck	8.22184.0500
EGTA	Sigma	E-4378
acrilamida	Sigma	A-3553
bissacrilamida	Sigma	M2022
persulfato de amônio	Sigma	A9164
Sulfito de sódio	Fluka	71988
Anti-trimetil-histona H3 (Lys4)	Upstate	07-473
Anti-monometil-histona H3 (Lys27)	Upstate	07-448
Alexa Fluor 488 ~ cabra ~ anti ~ coelho (H + L)	Sonda Molecular	A11008
ProlongGold	Invitrogen	P36934
Iodeto de propídio	Sigma	P4170	tóxico
DAPI	Sigma	D9542
RNAse tóxico A	Roche	10109169001
Coplin jar	Huber & CO	10.055
Fórceps	DUMONT BIOLOGY
Shaker	Heidolph	543-12310-00-0
Câmara			Uma caixa de plástico com toalha de papel úmida dentro, um suporte de plástico é colocado na caixa para apoiar as lâminas e manter as lâminas longe da água.
Slide Superfrost Plus	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Glä Kit de DNA de etiqueta de
	Invitrogen	F32947
GFP booster	Chromotek

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