NANOmanipulação de Solteiro RNA Moléculas por pinça óptica

William Stephenson; Gorby Wan; Scott A. Tenenbaum; Pan T. X. Li

doi:10.3791/51542

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Artigo de método

NANOmanipulação de Solteiro RNA Moléculas por pinça óptica

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DOI:

10.3791/51542

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20 de agosto de 2014

William Stephenson¹ , Gorby Wan² , Scott A. Tenenbaum³^,⁴ , Pan T. X. Li⁴^,⁵

¹Nanoscale Engineering Graduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, ²Nanoscale Science Undergraduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, ³Nanobioscience Constellation, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, ⁴The RNA Institute, University at Albany, State University of New York, ⁵Department of Biological Sciences, University at Albany, State University of New York

Neste artigo

Resumo

Pinças ópticas têm sido usadas para estudar o dobramento de RNA esticando moléculas individuais de suas extremidades 5 'e 3'. Aqui são descritos procedimentos comuns para sintetizar moléculas de RNA para pinça, calibração do instrumento e métodos para manipular moléculas individuais.

Resumo

Uma grande parte do genoma humano é transcrito, mas não traduzidos. Neste pós genómico, as funções reguladoras de RNA foram mostrados para ser cada vez mais importante. Como função de ARN, muitas vezes depende da sua capacidade para adoptar estruturas alternativas, isto é difícil de prever a estrutura tridimensional de ARN directamente a partir da sequência. Uma única molécula de abordagens apresentam potenciais para resolver o problema de polimorfismo de ARN através da monitorização de estruturas moleculares de uma molécula de cada vez. Este trabalho apresenta um método para manipular com precisão o dobramento e estrutura de moléculas de RNA utilizando pinças ópticas. Primeiro, os métodos para sintetizar moléculas adequadas para o trabalho mecânico única molécula são descritos. A seguir, vários procedimentos de calibração para garantir as operações próprias dos pinças ópticas são discutidos. Em seguida, vários experimentos são explicados. Para demonstrar a utilidade da técnica, os resultados de desdobramento mecanicamente grampos de ARN e um único RNA Kissing complexo são usados como prova. Nestes exemplos, a técnica nanomanipulação foi utilizado para estudar dobragem de cada domínio estrutural, incluindo secundário e terciário, de forma independente. Por fim, são discutidas as limitações e as futuras aplicações do método.

Introdução

O desenvolvimento da técnica de pinças ópticas tem sido acompanhada com a sua aplicação no domínio da investigação biológica. Quando o efeito de captura óptica foi descoberto pela primeira vez, Arthur Ashkin observado que as bactérias em água contaminada pode ser preso no foco do laser ^1. Desde então, as bactérias trapping tornou-se um involuntário, experiência divertida para gerações de estudantes de biofísica, bem como uma ferramenta de pesquisa séria para estudar a fisiologia microbiana ^2,3. A técnica de captura óptica usa raio laser focado para imobilizar um objeto microscópico ^1. Na prática, uma série de funções de armadilha de l....