Quantificar Único microvasos Permeabilidade em perfusão isolada-Sangue Rat Lung Preparação

Summary

A preparação isolada de perfusão pulmonar de sangue faz com que seja possível visualizar redes microvasos na superfície do pulmão. Aqui nós descrevemos uma abordagem para quantificar a permeabilidade de microvasos de solteiro em pulmões isolados tempo real usando imagens de fluorescência.

Abstract

A preparação isolada de perfusão pulmonar com sangue é amplamente usado para visualizar e definir a sinalização em microvasos individuais. Juntando esta preparação com imagens em tempo real, torna-se viável para determinar alterações da permeabilidade em microvasos pulmonares individuais. Aqui nós descrevemos etapas para isolar pulmões de ratos e perfundem-los com sangue autólogo. Em seguida, descrevemos as etapas para infundir fluoróforos ou agentes através de um microcatheter em uma região de pulmão de pequenas. Utilizando estes procedimentos descritos, determinou-se o aumento da permeabilidade em microvasos de pulmão de rato em resposta a infusões de lipopolissacarídeo bacteriano. Os dados revelaram que lipopolissacarídeo aumento de fugas de fluido em ambos os segmentos venulares e microvasos capilar. Assim, este método faz com que seja possível comparar as respostas de permeabilidade entre os segmentos vasculares e, assim, definir qualquer heterogeneidade na resposta. Enquanto os métodos comumente utilizados para definir a permeabilidade pulmonar requerem pós-processamento de amostras de tecido do pulmão, ouso de imagens em tempo real elimina esta exigência, como é evidente a partir do presente método. Assim, a preparação de pulmão isolado combinado com a imagem em tempo real oferece várias vantagens em relação aos métodos tradicionais para determinar a permeabilidade microvascular pulmão, ainda é um método simples para desenvolver e implementar.

Introduction

O aumento da permeabilidade microvascular nos pulmões leva ao desenvolvimento de edema alveolar e troca gasosa comprometida e é uma das principais características da lesão pulmonar aguda (LPA) ^1-3. Assim, estimativas da permeabilidade vascular são importante na definição do grau de lesão dos pulmões e a eficácia das intervenções terapêuticas propostas. Análise gravimétrica como proporção wet-a-seco de pulmão livre sangue e coeficiente de filtração microvascular são amplamente utilizados métodos para estimar a permeabilidade ^4,5. Outros métodos incluem a quantificar a retenção de sondas radioactivas ou fluorescentes no tecido pulmonar ^6-8.

Protocol

Todos os experimentos realizados em animais foram aprovados pelo Comitê da Universidade de Tennessee Health Science Center Animal Care Institucional e uso.

1. Tubulação de preparações perfusão Rat Lung

1. Preparar um sistema de tubos com um tubo Tygon (# 18) para a perfusão de sangue como mostrado na Figura 1. Ligue transdutores de pressão (P23XL) e colocar o tubo na platina do microscópio.
2. Ajustar a temperatura do banho de água a 37 ° C.
3. Conecte a entrada e saída de pulmão temporariamente com Tygon tubulação.

Results

Uma preparação isolada de perfusão pulmonar de sangue ligado ao sistema de perfusão e afins é mostrado na Figura 2. Para fins de demonstração, foi utilizado um rato Sprague Dawley, embora os procedimentos aqui descritos podem ser utilizados com qualquer espécie de rato. Infusões com um microcateter atrial esquerdo atingir apenas uma pequena região do pulmão. A região infundido pode ser identificado pela descoloração induzida por infusão (Figura 3). A preparação de pulmão como posicionad.......

Discussion

A preparação isolada de perfusão pulmonar com sangue combinado com imagens em tempo real fornece uma ferramenta simples para a determinação de alterações de permeabilidade em microvasos pulmonares individuais. Aplicamos esse método para definir alterações de permeabilidade em resposta à infusão de LPS. Os nossos dados sugerem claramente que a infusão de LPS causou um aumento da permeabilidade microvascular. Além disso, os dados também indicam que as alterações de permeabilidade induzida por LPS foram similares em ambas .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tygon Tubing	Fisher Scientific		#18
Transdutor de Pressão	Data Sciences International	P23XL	Quantidade necessária 3
Agulha Borboleta	Greiner Bio-One	450081	21 G
Bomba peristáltica	Cole Parmer	Masterflex L/S
PE-90 tubulação	Becton Dickinson	427421	30 cm necessária
Tubulação PE-10	Becton Dickinson	427401	40 cm necessária
Bomba de seringa	Braintree Scientific	BS8000
O-ring			Feito sob medida com um orifício de 20 mm de diâmetro e uma alça para fixar o O-ring ao suporte
Microscópio de fluorescência vertical	Olympus America	BX61WI
Software de Aquisição de Imagem	Dispositivos Moleculares	Metamorfo
FITC Dextran 20KD	Sigma Aldrich		0,5 mg/ml (Um dextrano de diferentes tamanhos moleculares pode ser selecionado, se experimentos experimentais indicarem sua adequação com base nos valores calculados do índice de permeabilidade)
Sorótipo 0111:B4	Sigma Aldrich		Lipopolissacarídeo