Aqui um romance região do protocolo de análise de juros com base na classificação elipses melhor ajuste atribuídos a regiões de sinal positivo dentro de sequências de imagens de lapso de tempo bidimensional é demonstrada. Este algoritmo pode permitir que os investigadores a analisar exaustivamente sinais fisiológicos Ca + 2 com entrada mínima do usuário e preconceito.
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Artigo de método
Automated Análise de Ca dinâmico
Neste artigo
Resumo
Resumo
Ca 2 + intracelular sinais são vulgarmente estudada com corantes de Ca 2 + indicadoras fluorescentes e as técnicas de microscopia. No entanto, a análise quantitativa de Ca 2 + dados de imagem é demorado e sujeito a viés. Algoritmos de análise de sinal automatizado baseado na região de interesse (ROI) de detecção têm sido implementadas para medições de varredura de linha unidimensional, mas não há nenhum algoritmo atual que integra a identificação otimizado e análise de ROI em sequências de imagens bidimensionais. Aqui um algoritmo para rápida aquisição e análise de ROI em sequências de imagens é descrito. Ele utiliza elipses caber aos sinais filtrados de ruído, a fim de determinar a colocação ROI ideal, e calcula Ca 2 + parâmetros do sinal de amplitude, duração e distribuição espacial. Este algoritmo foi implementado como um plug-in gratuito para software ImageJ (NIH). Juntamente com os scripts de análise escritos para o open source software de processamento estatístico R,Esta abordagem proporciona um gasoduto de alta capacidade para a realização de análise estatística rápida da produção experimental. Os autores sugerem que o uso deste protocolo de análise levará a uma caracterização mais completa e imparcial do fisiológica Ca 2 + de sinalização.
Introdução
Ca 2 + é um segundo mensageiro ubíquo molécula sinalizadora e citosólicas de Ca2 + níveis são altamente regulamentados. Ca 2 + intracelular sinais são complexas e incluem transientes isoladas, oscilações, e as ondas de propagação 1-4. Controle espacial e temporal da Ca 2 + é pensado para ser a base especificidade sinal fisiológico e, portanto, a análise de Ca 2 + padrões de sinal é de considerável interesse para os investigadores em vários campos 5.
Corantes de Ca 2 +, como indicador de Fluo-4 e de Fura-2 são normalmente utilizados para medir intracelu....
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Protocolo
1. Dissection Vessel and Imaging
- Tecido Colheita de suínos juvenis domésticos, conforme descrito no Martens et al 27. Coloque ventrículos direito suínos colhidas em um polidimetilsiloxano (PDMS) prato dissecção inferior contendo tampão HEPES solução salina fisiológica (PSS).
- Com o auxílio de um microscópio estereoscópico, dissecar e remover um segmento da artéria coronária descendente anterior da artéria coronária (~ 8 milímetros de comprimento, 0,5 mm de diâmetro) de tecido circundante, utilizando um fórceps e tesouras mola através da remoção do segmento de vaso a partir das camadas de tecido cardíaco circundantes. NOTA: Tome ....
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Resultados
Um algoritmo de costume, LC_Pro, foi desenvolvido e implementado, a fim de realizar a análise automatizada de Ca 2 + dinâmicas em sequências de imagem confocal. Como representado na Figura 1, o algoritmo utiliza módulos de processamento sequenciais que A) detectar e locais de pista de dinâmica de Ca 2 + mudar acima estatística (p <0,01) o ruído, B) definir as regiões de interesse (ROI) automaticamente em centros de sítio activo, e C) calcular intensidades médias de fluorescência.......
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Discussão
Decodificando complexos Ca 2 + sinais a nível celular e multicelular exigirá abordagens experimentais e analíticos rigorosos. Aqui, é descrito um método em que a sequência de tempo de imagem confocal resolvidos de Ca 2 + dependente de fluorescência são submetidas a uma análise automatizado que identifica e quantifica a Ca 2 + sinais estatisticamente relevantes dentro de campos celulares intactos no caso concreto apresentado, um segmento da artéria foi isolado de coração de porco, preso a.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado em parte pelo Instituto Nacional de Bolsas de Saúde HL-085887, HL-092992, S10RR027535 e MOP-93676.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Prato de dissecação | Fisher Sci | # 08-772-70 | |
| Polidimetilsiloxano (PDMS) | Fisher Sci | #NC9644388 | kit de elastômero, deve ser moldado em pratos |
| com buffer HEPES PSS | Sigma | #H3375-250G | HEPES ácido |
| Estereomicroscópio | Nikon Inst. | ||
| Fórceps | Fine Science Tools | # 11223-20 | |
| Tesoura de mola | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fio de tungstênio | Scientific Inst Svcs | # 406 | |
| Fluo-4 AM | Life Tech. | #F-14201 | |
| Pluronic F-127 | Life Tech. | ||
| Pinos de metal | Fine Science Tools | #26002-10 | |
| Câmara | de | ||
| Microscópio confocal de disco giratório | Perkin Elmer | RS-3 | |
| ImageJ software | download em: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | ||
| LC_Pro plugin para imageJ | download em: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html | ||
| R software | baixe em: http://www.r-project.org/ | ||
| de plotagem de rastreamento R | baixe em: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing |
Referências
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).
- Berridge, M. J., et al. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Delisle, S.
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Reimpressões e permissões
