Síntese e fabricação de fibras longas electrospun abrangendo uma área maior depósito através de um coletor recém-concebido a partir de um polímero biodegradável romance chamado poli (glicerol-dodecanoato) (PGD) foi relatado. As fibras eram capazes de suportar o crescimento de células derivadas de células-tronco pluripotentes.
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Artigo de método
Electrospun fibrosa Andaimes de Poli (glicerol-dodecanedioate) para Engenharia Neural tecidos de rato as células estaminais embrionárias
Neste artigo
Resumo
Resumo
Para aplicações de engenharia de tecidos, a preparação de scaffolds biodegradáveis e biocompatíveis é a tarefa mais desejável, mas desafiador. Entre os vários métodos de fabricação, electrospinning é o mais atractivo, devido à sua simplicidade e versatilidade. Além disso, nanofibras electrospun imitar o tamanho da matriz extracelular natural, assegurando um apoio adicional para a sobrevivência e crescimento das células. Este estudo mostrou a viabilidade da fabricação de fibras longas, abrangendo uma área maior depósito de um polímero biodegradável e biocompatível romance chamado poli (glicerol-dodecanoato) (PGD) 1, usando um coletor recém-projetado para electrospinning. PGD exibe propriedades elásticas originais com propriedades mecânicas semelhantes às dos tecidos nervosos, assim, ele é adequado para aplicações de engenharia de tecidos neurais. A síntese e fabricação set-up para fazer materiais fibrosos andaimes era simples, altamente reprodutível e barato. Em biocompatibilidadeteste, as células derivadas de células estaminais embrionárias de ratinho podia aderir e crescer nas fibras PGD electrospun. Em resumo, este protocolo fornecido um método de fabricação versátil para fabricação de fibras PGD electrospun para suportar o crescimento de células da linhagem neurais derivadas do rato de células-tronco embrionárias.
Introdução
Eletrofiação é um dos métodos de processamento eficazes para produzir suportes de fibra de tamanho micro-a-nanómetro. O princípio básico de electrospinning envolve um cone de Taylor de uma solução que é realizada ao nível do orifício de uma agulha através da aplicação de alta tensão entre a ponta da agulha e de um colector ligado à terra. Quando a repulsão electrostática na solução vence a tensão superficial, um jacto de fluido carregado é ejectado para fora da ponta da agulha, se desloca através do ar com a evaporação do solvente, e é, finalmente depositada sobre o colector ligado à terra. A bomba de seringa fornece um fluxo contínuo de uma solução que emerge da fieira e, portanto, múltiplas cópias das fibras electrospun pode ser fabricado dentro de um curto período de tempo. Durante o curso de deixar a fieira de chegar ao colector, o jacto carregada sofrer estiramento e batimento de acordo com uma série de parâmetros, que incluem a viscosidade e tensão superficial da solução polimérica, os electrostatic força na solução, ea interação do campo elétrico externo, etc 2.
No processo de electrospinning, um colector serve como um substrato condutor em que as fibras de micro-a-nanométrica pode ser depositado. Neste estudo, um novo tipo de colector de fibras foi concebido para obter mantas de fibra com a dimensão desejada (comprimento x largura). Tradicionalmente, a folha de alumínio é usado como um colector, mas é difícil de transferir as fibras a partir da superfície plana a um outro substrato. A dificuldade de colher um tapete de fibra intacta de um colecionador tradicional deveu-se principalmente ao fato de que as fibras electrospun anexar fortemente à superfície do coletor. Portanto, nós modificamos o coletor dobrando um pedaço de papel alumínio em uma tira retangular e anexá-lo perpendicular a uma placa de metal plana. As fibras são electrospun esticado em toda a área entre a ponta da tira e a placa de metal, que pode ser facilmente transferida para outro substrate.
Interesse em polímeros elastoméricos termicamente reticuladas está crescendo rapidamente por causa do trabalho pioneiro do grupo de Robert Langer, que introduziu poli (sebaçato glicerol) (PGS), um poliéster que é análoga à borracha vulcanizada, em 2002 3. Semelhante ao PGS, temos desenvolvido com sucesso poli (glicerol-dodecanoato) (PGD) por condensação térmica do glicerol e ácido dodecanodioíco e demonstrou a sua propriedade única memória de forma 1. Ao contrário rígida poli materiais sintéticos (hidroxil-butirato) ou poli (L-lactido) (módulos de Young de 250 MPa e 660 MPa, respectivamente), o PGD exibe propriedade elastomérica como a borracha, com um módulo de Young de 1,08 MPa, quando a temperatura estiver acima de 37 ° C, que é um jogo perto do nervo periférico in-situ (0,45 MPa). Além disso, o PGD é biodegradável e o tempo de degradação, podem ser afinadas variando a proporção de glicerol e ácido dodecanóico. Ácido dodecanodioíco é um sub de doze carbonoposição com dois grupos carboxílicos terminais, HOOC (CH2) 10 COOH. Ácidos dicarboxílicos pares numeradas como ácido sebácico e o ácido dodecanodióico pode ser metabolizado a acetil-CoA e introduzir o ácido tricarboxílico (TCA) / ciclo (ácido cítrico). O produto metabólico de ácidos dicarboxílicos, succinil-CoA, é um precursor gluconeogenetic e intermédia do ciclo de TCA 4. Assim, alguns estudos sugerem que poderiam ser utilizados como um substrato de combustível alternativo para nutrição entérica e parentérica, especialmente nas condições patológicas. Além disso, o PGD exibe memória de forma única por causa da sua temperatura de transição de vidro é de 31 ° C, portanto, apresenta propriedades mecânicas diferentes, à temperatura ambiente e à temperatura do corpo. Em suma, a PGD é biodegradável, biocompatível, exibindo propriedades elásticas únicas com propriedades mecânicas semelhantes aos tecidos nervosos; por conseguinte, é um material adequado para aplicações de engenharia de tecidos nervosos. Neste protocolo, o electrospunfibras longas que abrangem uma grande área de depósito foram fabricados através do coletor recém-projetado do PGD. Os andaimes de fibras pode suportar o crescimento e diferenciação de células-tronco pluripotentes.
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Protocolo
1. Setup Electrospinning Collector
- Corte o papel alumínio em uma peça retangular.
- Dobre o pedaço retangular em uma tira retangular, e anexá-lo perpendicular a uma placa de metal plana com fita adesiva (Figura 1). Nota: O tamanho da esteira de fibras dependem do comprimento e da largura da tira. Assim, as dimensões da tira pode ser ajustada conforme necessário.
2. Solução polimérica Preparação
- Mistura de glicerol e ácido dodecanóico (ADD) em razão molar de 1:1, num copo de 120 ° C durante 100 horas para se obter polímero de DGP.
- Dissolve-se o poli (óxido de etileno) (PEO) e de gelatina, em etanol a 65% com uma proporção de peso de 1.5:3:95.5 em um tubo de 15 ml, apertar a tampa e aquecer a mistura num forno a 60 ° C durante 1 hora com agitação até que se torna uma solução homogénea (solução basal).
- Para electrospinning, misture o polímero PGD ea solução basal em 04:06 de peso. Nota: concentração PGD tem um big efeito sobre o diâmetro da fibra. 30% -50% por cento PGD é aceitável para a produção de fibras mais do que 5 cm com diâmetros de fibra de aumento.
- Adicionar 0,1% de riboflavina para a solução polimérica e misturar bem.
3. Electrospinning
- Alimente a solução polimérica em uma seringa de 5 ml de série com um 18 G embotada agulha de aço inoxidável.
- Insira a seringa em uma bomba de seringa.
- Ligue o cabo ligado à terra de uma fonte de alimentação de alta tensão para a placa de metal e o chumbo carregada positivamente para a agulha.
- Ajustar a distância entre a agulha e a tira de folha de alumínio de 15 cm.
- Coloque a bomba de seringa em um ângulo de aproximadamente 15 ° com a horizontal para impedir a agregação das fibras na parte da frente da faixa.
- Ligar a bomba de seringa e ajustar a taxa de fluxo da bomba de 0,6 mL / hora.
- Ligue a fonte de alimentação de alta tensão e ajustar a tensão de operação de 14,6 kV.
4.Processamento de fibras
- Após a recolha está completa, expor a esteira de fibra para a luz UV, durante 60 minutos para a ligação cruzada.
- Transferir a esteira de fibras a partir da tira de folha de alumínio de uma placa de Petri de 100 milímetros, e expô-la à luz UV durante mais 20 min para a esterilização.
- Em uma cabine de segurança biológica, cortar a manta de fibra em peças redondas do mesmo tamanho com uma lâmina de bisturi e colocar os pedaços em uma placa de 24 poços.
- Para o tratamento das células de pré-sementeira, imergir amostras de fibras em 1 ml de tampão fosfato salino (PBS) e incuba-se a 37 ° C durante a noite.
- No dia seguinte, cuidadosamente aspirado PBS, adicionar 1 ml de meio de diferenciação (DMEM/F12, N2, e FGF2) (ver receita na tabela Materiais) a cada poço e incuba-se a 37 ° C durante 3 hr.
- Meio de diferenciação aspirado cuidadosamente, adicionar 0,2 mL de matrigel a cada amostra de fibra e incubar a 37 ° C durante 30 min. Nota: A laminina também pode ser utilizado para o revestimento de fibra. Adicionar 0,2 mL de 20 ug / ml de lamininapara a fibra e incubar à temperatura ambiente durante 3 hr.
- Com cuidado, retire o excesso de matrigel de cada poço. Lavar com 2 ml de meio de diferenciação de uma vez. Nota: As amostras de fibras estão prontos para a cultura de células.
5. Sementeira celular em Fibras
- Adicionar 1 ml de Accutase para o prato de cultura de células MES e incubar durante 10 min a 37 ° C.
- Após 10 min, as células MES são separadas do prato de cultura. Adicionar 4 ml de meio de diferenciação para a placa. Recolher as células MES flutuantes em um tubo de 15 ml e as células para cima e para baixo de pipeta para quebrar colónias (cerca de 15x).
- Centrifugar a 400 xg durante 5 minutos e re-suspender as células em 4 ml de meio de diferenciação.
- Contar as células usando um hemocitômetro. Transferir 200 ul da suspensão de células para um tubo de 15 ml e diluir 10x com meio de diferenciação. Transferir 15 uL da suspensão de células diluída a uma câmara na hemocitómetro com uma lamela no lugar. Contaras células no quadrado do centro a 1 mm e as quatro esquinas do hemocitómetro sob o microscópio. Nota: celular por ml = a contagem média por metro quadrado x fator de diluição x 10 4
- Colocar aproximadamente 5 x 10 4 células MES em cada poço. Gota lentamente a suspensão de células para o meio das amostras de fibras, em vez de correr para fora do lado do poço, para evitar que a solução de se drenar o tapete de fibra.
- Adicionar 1 ml de meio de diferenciação em cada poço, e manter a placa numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 para permitir que as células de fixação, o crescimento e diferenciação.
- Aspirar o meio antigo em cada poço e substitua com 1 ml de meio de diferenciação fresco todos os dias.
6. Viabilidade celular
- Aspirar o meio antigo em cada poço.
- Misture 1/10 de volume de Resazurina reagente de fluorescência com o meio de cultura e adicionar 1 ml para cada poço.
- IncubComeram a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 4 h, protegido da luz directa.
- Depois de 4 horas, transferir 100 mL 3x do reagente de cada poço de uma placa de 96 poços, em seguida, as amostras estão prontas para ser medido em um espectrofotômetro de fluorescência usando configurações de filtro de 560EX nm/590EM.
7. PCR em Tempo Real
- Após 14 dias de cultura, adicionar tampão de lise às amostras e isolar o RNA total a partir das células nas amostras de fibras.
- Use 4 ul de ARN total, para sintetizar ADNc em 20 uL de escalas de reacção de transcrição reversa.
- Preparar a mistura de reacção de PCR em cada um dos tubos óptica: 10 ul Master Mix (2x), 0,2 ul de corante, 8 mL de água livre de nuclease, 1 ul de cDNA, e um iniciador pi (iniciadores utilizados neste estudo estão listados na Tabela 1).
- Configure o programa de PCR: a. 95 ° C 02:20 min, um ciclo de b. 95 ° C 3 seg → 60 ° C 1 min, 40 ciclo c. 95 ° C 15 seg, um ciclo d. 60 ° C 1min, um ciclo de e. 95 ° C 15 seg, 1 ciclo. Escolha forma de C T comparativo para determinar os níveis de expressão gênica relativa.
- Após PCR for concluído, analisar os resultados em tempo real PCR com software StepOne e exportar os resultados para o Excel.
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Resultados
Os principais componentes do electrospinning são mostrados na Figura 1. Uma esteira de fibras de tamanho grande foi tipicamente obtida através da tira perpendicularmente ligada folha de alumínio e uma chapa de metal plana. Figura 2 mostra o desenho do colector e o tapete de fibra de electrospinning. A largura e o comprimento pode ser ajustado para diferentes aplicações. O comprimento da fibra feito com polímeros de PGD e mistura solução basal é de até 10 cm. A morfologia das fibras elec...
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Discussão
As limitações de coletores simples ou as complexidades de colecionadores que são usados atualmente para eletrofiação aumentar a restrição de se obter o comprimento desejado e tamanho do tapete de fibra para algumas aplicações rotativas. Além disso, a transferência de fibras do coletor de terra para o prato de cultura ou outros substratos é um desafio 5. Neste relatório, um coletor recém-concebido, feito, simplesmente anexando uma tira de folha de alumínio para o coletor de castigo, foi capaz de obter grande...
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi realizado utilizando as instalações do Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade Internacional da Flórida.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| Ácido dodecanodióico | Sigma-Aldrich | D1009 | |
| Gelatina | Sigma-Aldrich | D1890 | |
| Poli (óxido de etileno) (PEO) | Sigma-Aldrich | 182028 | |
| Riboflavina | Sigma-Aldrich | 132350250 | 0,10% |
| Células-tronco | embrionárias de camundongoGlobalStem | GSC-5002 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | SH30272.02 | |
| N2 suplemento | Invitrogen | 17502048 | 1% |
| FGF2 | Stemgent | 03-0002 | 10 ng/ml |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Invitrogen | 10010-031 | |
| Resazurin fluorescência corante | Sigma-Aldrich | 62758-13-8 | |
| SV Sistema de Isolamento Total de RNA | Promega | Z3100 | |
| GoScript Sistema de Transcrição Reversa | Promega | A5000 | |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
| Bomba de seringa | Fisher scientific | 14-831-200 | |
| Spellman High Voltage Electronics Corporation | SL30 | ||
| Luz UV | Philips | 308643 | 15W/G15T8 |
| Synergy HT Leitor de Microplacas Multimodo | BioTek | ||
| Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600 | Perkin Elmer | 8488 | |
| StepOne Sistema de PCR em Tempo Real | Applied Biosystems | 4376357 |
Referências
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Reimpressões e permissões
