Artigo de método

Perfis de expressão de microRNA iPS Human Cells, Retinal Pigment Epithelium Derivado de Ips, e Fetal Retinal Pigment Epithelium

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DOI:

10.3791/51589

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24 de junho de 2014

 ,  ,  ,  , 
1Ocular Trauma, U.S. Army Institute of Surgical Research, JBSA Fort Sam Houston

Neste artigo

Resumo

O microRNA (miRNA) perfis de tronco humanas pluripotentes induzidas por células (iPS), epitélio pigmentar da retina (RPE) derivadas humana induzida por células-tronco pluripotentes (iPS) (IPS-RPE) e RPE fetal, foram comparados.

Resumo

O objetivo deste relato é descrever os protocolos para comparar o microRNA (miRNA) perfis de humana induzida por células-tronco pluripotentes (iPS), epitélio pigmentar da retina (RPE) derivadas de células iPS humanas (iPS-RPE) e RPE fetal. Os protocolos incluem a recolha de RNA para análise de microarray, e a análise de dados de microarrays para identificar miRNAs que são diferencialmente expressos entre os três tipos de células. Os métodos para cultura de células iPS e RPE fetal são explicados. O protocolo utilizado para a diferenciação de RPE de iPS humana também é descrito. A técnica de extracção de RNA descrevemos foi seleccionado para permitir a recuperação máxima de ARN muito pequena para ser utilizado em um microarray miARN. Finalmente, via celular e análise de redes de dados microarray é explicado. Estas técnicas vão facilitar a comparação dos perfis de miRNA de três tipos de células diferentes.

Introdução

As células estaminais têm a capacidade de se replicar sem limite e o potencial para se diferenciar em qualquer tipo de célula somática. O desenvolvimento de técnicas para reprogramar células somáticas em células-tronco pluripotentes suscitou grande entusiasmo na comunidade científica e entre os médicos, como o advento da regeneração do tecido personalizado está no horizonte 1. Induzido por células-tronco pluripotentes (iPS) apresentam as mesmas características do potencial replicativo ilimitado e pluripotência como células-tronco embrionárias (ES), contornando os dilemas éticos associados à CES. Além disso, as células estaminais derivadas de pacientes não irão estimular uma resposta imune, aumentando grandemente a probabilidade de sucesso de 2-3 aplicações terapêuticas. Sob condições específicas de cultura, as células iPS foram mostrados para se diferenciar em vários tipos de células diferentes in vitro, incluindo os cardiomiócitos, neurónios, células beta pancreáticas, hepatócitos, e epitélio pigmentado da retina (RPE) 4-12.

A EP é uma camada de células epiteliais especializadas pigmentadas localizadas na parte posterior da retina, que desempenha várias funções que são essenciais para a saúde visual e função, tais como a absorção de luz dispersa, a fagocitose dos segmentos externos de fotorreceptores, e processamento de retinóides para a produção de cromóforo visual. Disfunção do EPR devido a lesão ou doença afeta profundamente fotorreceptor saúde e função visual como evidenciado pelas doenças que causam cegueira que são o resultado de patologia RPE subjacente, como a degeneração macular relacionada à idade (DMRI), doença de Stargardt, e retinite pigmentosa (RP) 13. Tratamentos realmente eficazes que possam restaurar a visão não foram alcançados, e substituição de RPE doente com RPE saudável pode ser a melhor opção para evitar a perda de visão 14-15. RPE derivado iPS (IPS-RPE) é uma possível fonte de células para substituir o RPE danificadas. iPS-RPE expressa caracteproteínas RPE tic LRAT, CRALBP, PEDF e RPE65; exibe a morfologia RPE hexagonal altamente pigmentada clássica; e executa funções tais como RPE fagocitose, processamento de retinóide, e secreção de 11 - 5,16 retina cis. No entanto, antes iPS-RPE pode ser usada terapeuticamente, o IPS-RPE deve ser completamente caracterizada. Compreender os factores que regulam a diferenciação EPR é necessário para melhorar o rendimento e a pureza das células a serem utilizadas para aplicações clínicas.

Diferenciação de células é o resultado da expressão de genes altamente regulada. Remodelação epigenética do genoma e da coordenação dos fatores de transcrição são necessários para as decisões do destino da célula que ocorrem durante a diferenciação e desenvolvimento 17. Regulamento de mensagem de RNA (mRNA) Tradução por microRNA (miRNA) apresenta ainda um outro nível de regulação que afeta o destino da pilha 1. MiRNAs são curtos, ~ 22 nt, comprimentos de nucleotídeos que seja tradução suprimir porligação à extremidade 3 'UTR do ARNm ou o ARNm alvo para degradação. MiRNAs foram detectados em praticamente todos os tecidos e até o momento mais de 2.000 microRNAs humanos únicos foram registrados no banco de dados miRBase. Desde miRNAs exigem complementaridade parcial de se ligar ao mRNA-alvo, num único miARN pode potencialmente se ligam a dezenas ou centenas de alvos, e vice-versa, isto é, um único mRNA pode ser alvo de várias miRNAs diferentes. Esta característica de ligação promíscua aumenta dramaticamente o nível de complexidade da regulamentação, bem como o nível de dificuldade de determinar as funções dos miRNAs individuais e do papel que cada um desempenha nas funções celulares 18-21. No entanto, estudos têm mostrado que miRNA refina expressão gênica durante a diferenciação por afetar o estado de metilação de DNA 17. Num estudo mais específico para o EPR, miR-204/211 foi mostrado para promover o fenótipo epitelial do RPE 22. Outro grupo analisado o perfil miRNAde RPE durante a diferenciação de células-tronco embrionárias e revelou conjuntos distintos de miRNA são expressos durante o processo de diferenciação 23. De facto, os perfis de miRNA pode distinguir inequivocamente os tipos de células, incluindo células embrionárias, células precursoras, e células terminalmente diferenciadas 24,25. Mais de 250 miRNAs são expressos na retina. Com base nesses estudos, a hipótese de que os miRNAs desempenham um papel importante durante a diferenciação de RPE de iPS.

O objetivo deste relato é descrever os protocolos para a diferenciação de RPE de IMR90-4 células iPS, coleção de RNA para análise por microarray, e da análise de dados de microarrays para identificar os miRNAs que são diferencialmente expressos entre os três tipos de células, as células iPS , iPS-RPE e RPE fetal. O RNA total foi extraído a partir de culturas de cada tipo de célula e hibridado com uma micromatriz miARN, contendo sondas específicas para 1205 miRNAs humanos e 144 miRNAs virais. Os resultados de microarray foram comparard para determinar quais miRNAs foram diferencialmente expressos entre os diferentes tipos de células. miRNAs com 2 vezes ou mais alterações vezes na expressão foram seleccionadas para posterior análise. Um programa de software de análise de miARN foi usada para identificar potenciais alvos dos miRNAs expressos diferencialmente e para gerar redes celulares regulados por miRNAs seleccionados.

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Protocolo

1. Preparação de Culturas Reagentes e placas de cultura

  1. mídia mTeSR1: Preparar mídia mTeSR1 acordo com as instruções do fabricante. Descongelar 100 ml de suplemento mTeSR1 5x durante a noite a 4 ° C. Adicione os 100 ml de suplemento mTeSR1 5x para 400 ml de mTeSR1 mídia basais e misture bem. Este meio é estável a 4 ° C durante até 2 semanas e à temperatura de -20 ° C durante 6 meses.
  2. Meios de diferenciação: Preparar meios de diferenciação em DMEM/F12 para produzir 0,1 mM β-mercaptoetanol, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 2,0 mM de L-glutamina, 10% de soro de knockout, e 10 ug / ml de gentamicina.
  3. mídia iPS-EPR: Preparar mídia iPS-RPE em MEM, para se obter N1 1x suplemento, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 250 ug / ml de taurina, 13 ng / ml de sal de sódio tri-iodo-L-tironina, 20 ng / ml de hidrocortisona, de 5 ug / ml de gentamicina, e 15% de FBS 26.
  4. Solução estoque de sal de sódio tri-iodo-L-tironina. Para preparar a solução-mãe de dissolver 1,0 mg de tri-iodo-L-tironinasal de sódio em 1 N de hidróxido de sódio rodando suavemente. Em seguida adicione 49,0 ml de meios de base para fazer 50,0 ml de 20 ug / ml de sal de sódio tri-iodo-L-tironina. Preparar alíquotas e congelar a -20 ° C até ser necessário. Use volume adequado para atingir a concentração desejada em meio de cultura final.
  5. Solução-mãe de hidrocortisona: Para preparar uma solução de estoque de hidrocortisona, solubilizar 1 mg de hidrocortisona em 1 ml de etanol absoluto com agitação suave. Em seguida adicione 19,0 ml de meios de base para 20 ml de solução de estoque de hidrocortisona de 50 ug / ml. aliquota e congelamento a -20 ° C até ser necessário. Use volume apropriado para atingir a concentração desejada no meio de cultura final.
  6. Meio de crescimento RPE Fetal. Preparar o meio de crescimento por mistura de todos os reagentes no kit RTEGM no meio basal, de acordo com as instruções do fabricante, com excepção para o FBS.
  7. Fetal mídia RPE chapeamento. Prepare a mídia chapeamento por transferência de uma pequena quantidade de meio de crescimento para um recipiente estéril e umFBS DD para uma concentração final de 2%.
  8. Dispase: Preparar a solução de trabalho de dispase de 1 mg / ml em DMEM/F12.
  9. Placas revestidas com Matrigel: Preparar matrigel em DMEM/F12 de 0,08 mg / ml.
  10. Bata de cada poço de uma placa de 6 poços com 1,0 ml da solução de matrigel.
  11. Incubar as placas revestidas à temperatura ambiente durante 1,0 h.
  12. Após a incubação de 1,0 hr, aspirar o excesso DMEM/F12.
  13. Adicionar 0,5 ml de mídia mTeSR1 para evitar a secagem. As placas Matrigel revestido está agora pronto para o uso.

2. Cultura iPS

  1. Antes da semeadura de células iPS tem todos os tubos, quente mídia mTESR1 à temperatura ambiente, e as placas Matrigel revestido prontos.
  2. Rapidamente descongelar os IMR90-4 células iPS em um C banho de água 37 °. Em seguida, remover o frasco de congelação do banho de água e esterilizar utilizando etanol a 70%.
  3. Transferência das células para um tubo de 15 ml com uma pipeta de 2 ml para minimizar a quebra de agregados celulares.
  4. Gota a gota, adicionar 5 ml de warm media mTeSR1 para as células e misture delicadamente. Centrifugar as células a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante.
  5. Ressuspender com cuidado os agregados celulares em 2 ml de mídia mTeSR1 e semear as células em um poço de uma placa de seis bem.
  6. Colocar a placa num incubador e a cultura C 37 ° com 5% de CO 2, 95% de humidade.
  7. Altere o meio de cultura de células iPS diária. Colônias indiferenciadas aparecerá 5-7 dias após a semeadura. Verifique a existência de colônias indiferenciadas que estão prontos para a passagem (colônias com um centro denso).

3. Passaging de iPS Cells

  1. Antes de começar a passagem das células iPS, ter todos os tubos, solução dispase, mídia DMEM/F12 e mTERS1 aquecido à temperatura ambiente, eo matrigel placas revestidas pronto.
  2. Antes passaging células iPS, remova quaisquer áreas de diferenciação por raspagem da área e aspirando a mídia. Diferenciação deve permanecer abaixo de 20% do poço em altaculturas de qualidade. Lavar cuidadosamente o contendo células bem com 2 ml de DMEM/F12 iPS e adicionar 1 ml de 1 mg / ml de dispase a cada poço.
  3. Incubar a 37 ° C durante 7 min. Aspirar o dispase e lavar cuidadosamente as colônias de células com 2 ml de DMEM/F12 duas vezes.
  4. Depois de enxaguar, adicionar 2 ml de mTSER1 a cada poço.
  5. Usando uma pipeta de 5 ml raspe as colônias da placa para formar agregados.
  6. Transfira as colônias isoladas para um tubo cônico de 15 ml. Adicionar mídia mTeSR1 suficientes para semear a próxima passagem das células.

4. Diferenciação de células iPS para iPS-RPE

  1. Placa as células iPS para uma placa recém revestido em mídia mTESR1.
  2. Permitir colônias de células iPS a se expandir por 4-5 dias em cultura.
  3. Mídia mTeSR1 substituto com a mídia 4 ml diferenciação. Mude metade dos media a cada 3 dias.
  4. Permitir focos pigmentadas para crescer o suficiente para ser dissecado manualmente fora da cultura (40-50 dias).
  5. Use uma200 mL ponteira para cortar ao redor e levantar as colônias pigmentadas.
  6. Coletar e reunir as colônias dissecados em um tubo cônico de 15 ml.
  7. Em seguida, adicionam-se 5 ml de DMEM/F12 para as células de RPE reunidas e centrifugar a 300 xg durante 5 min, duas vezes.
  8. Prepara-se uma solução de uma única célula, incubando a reunidas iPS-EPR com 0,25% de tripsina EDTA.
  9. Lavar as células iPS-RPE com a mídia iPS-RPE e placa as células coletadas em um poço em 4 ml de mídia iPS-RPE revestido de matrigel fresco.
  10. Cultura das células durante 3 semanas antes da passagem. Troque a mídia a cada 3 dias. Para o experimento, placas IPS-RPE em 100.000 células / cm 2. Coletar as células no dia 17. Conte o dia da semeadura como Dia 0.

5. Coleta de Amostras

  1. Coleção de células iPS
    1. Cultura as células iPS indiferenciadas até colônias são observados para ser denso no centro.
    2. Lavar as colônias em DMEM/F12.
    3. Dissociar-se em células individuais usando accutas e. Recolher as células para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender em 2 ml de DMEM/F12.
  2. Coleção RPE Fetal
    1. Lavar culturas de células de RPE Fetal com DMEM/F12 e dissociar-se em células individuais usando 0,25% de tripsina EDTA.
    2. Coletar as células em um tubo cônico de 15 ml. Centrifugar a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender em 2 ml de DMEM/F12.
  3. Coleção de células iPS-RPE
    1. Quando a IPS-RPE atingir passagem 3 e passagem 5, recolher as células no dia 17 após a passagem. Lavar iPS-RPE por duas vezes em PBS e preparar uma suspensão de células individuais por incubação com 1,0 ml de 0,25% de tripsina.
    2. Neutralizar tripsina com 2 ml de gelo frio mídia iPS-RPE.
    3. Recolher as células num tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante.
    4. Ressuspender a suspensão de células em 3 ml de tampão de coloração de kit de microesferas.
ve_title "> 6. Negativa Seleção de iPS-RPE para remover as células indiferenciadas

  1. Manter todos os reagentes a 4 ° C até à sua utilização, mas não funcionam em gelo. Suspensão de células a partir do passo 5.3.4 Centrifugar a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante.
  2. Ressuspender as células em 100 ul de tampão de coloração de kit de microesferas por 2 x 10 6 células.
  3. Adicionar 10 ul de anticorpo anti-TRA-1-60-PE por 2 x 10 6 células.
  4. Misturar bem e incubar a 4 ° C durante 10 min.
  5. Lavar células em 1-2 ml de tampão por 2 x 10 6 células. Centrifugar durante 10 minutos a 300 x g. Aspirar o sobrenadante.
  6. Suspenda as células em 80 ul de tampão de coloração por 2 x 10 6 células. Adicionar 20 ul de microesferas anti-PE rotulados (do kit) por 2 x 10 6 células. Misture bem. Incubar durante 15 minutos a 4 ° C.
  7. Adicionar 1-2 ml de tampão de coloração por 2 x 10 6 células. Centrifugar durante 10 minutos a 300 x g. Aspirar o sobrenadante.
  8. Ressuspender as células em 500 & #956; l de tampão de coloração.
  9. Separação celular magnética:
    1. Colocar a coluna no seleccionador de células magnético. Lavar coluna com 3 ml de tampão de coloração.
    2. Aplicar a suspensão de células a partir de 6,8 em coluna.
    3. Colocar um tubo na porta negativa para recolher os TRA-1-60 células negativas.

7. ARN total Extracção

  1. Lyse as células executando as amostras através de uma coluna de microcentrífuga homogeneizador mini-rotação disponível no mercado projetado para minipreps ácidos nucleicos.
  2. Extrato de RNA total a partir de células iPS, iPS-RPE e RPE fetal com o kit de extração de RNA disponível no mercado projetado para preservar as pequenas moléculas de RNA 27.
  3. Determine as concentrações totais de RNA usando um espectrofotômetro Nanodrop.

8. Bioanalyzer e Microarray Assay

  1. Verifique a integridade do RNA com Bioanalyzer em conjunto com o kit de qualidade RNA disponíveis comercialmente.
  2. Incubar 100 ng deRNA total com fosfatase intestinal de vitelo a 37 ° C durante 30 min
  3. Desnaturar o RNA utilizando 100% de DMSO a 100 ° C durante 5 min.
  4. Rotular as amostras com PCP-Cy3 usando ligase T4 por incubação a 16 ° C durante 1 hora.
  5. Hibridizar em um formato de matriz 8_x_15K miARN humano.
  6. Lavar as matrizes de acordo com as instruções do fabricante e digitalizar a uma resolução de 5 mM usando um scanner.
  7. Aquisição de dados usando o recurso de microarray software extração compatível com o microarray miRNA.
  8. Processar os sinais miRNA para determinar o nível relativo de expressão em cada amostra.
  9. Comparar os níveis de cada um miARN entre os grupos de amostra de expressão. Escolha miRNAs com expressão diferencial, pelo menos, duas vezes maior para posterior análise.
  10. Usando um software disponível no mercado para análise de dados, siga as instruções para gerar mapas de calor para visualização de miRNAs diferencialmente expressos 28.

9. Análise Pathway

  1. Salve os dados dos miRNAs selecionados em 8,9 em formato Excel.
  2. Faça o login no programa de análise de RNA via online. Faça o upload do arquivo do Excel. Selecione "Format flexível" para o formato de arquivo e selecione "Agilent" da lista drop-down para o tipo de identificador.
  3. Sob rubrica de dados brutos, atribuir "ID" para sondar coluna ID e atribuir "Observação 1" e "relação de log" para a coluna de ração log. Selecione "ignorar" para todas as outras colunas.
  4. Selecione os parâmetros para análise, conforme segue: Confiança: experimentalmente apenas observado; incluir as relações diretas e indiretas; e incluem produtos químicos endógenos; Seleccione a base de conhecimento Ingenuity como o conjunto de referência. Escolher a base de dados de referência de moléculas que inclui os dados de todas as espécies, todas as linhas de células e tecidos, e todas as mutações.
  5. Rede Run e caminho analisa.

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Resultados

células iPS (Figura 1A) foram cultivadas em condições de diferenciação para induzir a diferenciação em células iPS-RPE. O iPS-RPE exibiu clássico fenótipo de RPE hexagonal morfologia das células pigmentadas (Figura 1B), semelhante ao RPE fetal (Figura 1C).

Para entender melhor o papel que pode desempenhar miRNA durante o processo de diferenciação de iPS a iPS-EPR, análise de microarray de expressão miRNA foi conduzido. O RNA total foi coleta...

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Discussão

Em conclusão, este relatório descreve os métodos utilizados para a cultura de células iPS, iPS-RPE e RPE fetal. RPE derivado do iPS são morfológica e funcionalmente similares ao RPE fetal. O iPS-RPE também expressa genes RPE característicos incluindo RPE65, CRALBP, PEDF e LRAT 16. Para melhor caracterizar estas células, o RNA foi extraído e utilizado para realizar a análise de microarray para identificar diferencialmente expressos miRNA. A análise das intensidades de sinal revelou que foi detectado o maior nú...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

As opiniões ou afirmações contidas neste documento são os pontos de vista particulares de seus autores e não devem ser interpretadas como funcionário ou como refletindo os pontos de vista do Ministério do Exército ou do Departamento de Defesa.

Esta pesquisa foi realizada enquanto os autores Whitney A. Greene, Alberto Muniz, e Ramesh R. Kaini realizou uma Pós-Investigação Associateship Conselho Nacional de Pesquisa da USAISR.

Os ensaios foram realizados por Microarray Facility Cancer Research Institute Microarray Núcleo do Greehey Crianças e Bioinformática Departamento da UT Health Science Center San Antonio.

Este trabalho foi apoiado pelo Exército dos EUA Programa de Clínica de Reabilitação Medicina Research (CRMRP) e Militar Programa de Pesquisa em Medicina Operacional (MOMRP).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Meio mTeSR1 + suplemento 5XStem Cell Technologies5850
DMEM/F12Life Technologies11330-032
2-β-mercaptoetanolSigmaM-7154
Aminoácidos não essenciaisHyclone(Fisher)SH30853.01
Substituição do soro knockoutLife Technologies10828-028
Gentamicina Life Technologies15750-060
Mídia MEMLife Technologies10370-021
N1 suplementoSigmaN-6530-5ML
TaurinaSigmaT-8691-25G
HidrocortisonaSigmaH0888-1G
Soro bovino fetalHyclone (Fisher)SH3008803HI
Sal de sódio triiodo-l-tironinaSigmaT6397
Hidróxido de sódioSigmaS5881
Mídia RPE fetal Kit RTEGMLife Technologies195406
DispaseLife Technologies17105-041
MatrigelBD Biosciences354277
Fosfato tamponado solução salinaHyclone (Fisher)10010-023
TripsinaHyclone(Fisher)25200-072
Miltenyi Biotec tampão de lavagemStemGent130-092-987
Miltenyi Biotec tampão de enxágueStemGent130-092-222
Kit de microesferas Anti-TRA-1-60StemGent130-095-816
Coluna classificadora de células Miltenyi BiotecStemGent130-021-101
Micro kit RNeasyQiagen74004
QIA trituradorQiagen79654
RNA 6000 Pico LabChip kitAgilentG2938-90046
Microarray de miRNA humano v16AgilentG4471A

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