O microRNA (miRNA) perfis de tronco humanas pluripotentes induzidas por células (iPS), epitélio pigmentar da retina (RPE) derivadas humana induzida por células-tronco pluripotentes (iPS) (IPS-RPE) e RPE fetal, foram comparados.
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Artigo de método
Perfis de expressão de microRNA iPS Human Cells, Retinal Pigment Epithelium Derivado de Ips, e Fetal Retinal Pigment Epithelium
Neste artigo
Resumo
Resumo
O objetivo deste relato é descrever os protocolos para comparar o microRNA (miRNA) perfis de humana induzida por células-tronco pluripotentes (iPS), epitélio pigmentar da retina (RPE) derivadas de células iPS humanas (iPS-RPE) e RPE fetal. Os protocolos incluem a recolha de RNA para análise de microarray, e a análise de dados de microarrays para identificar miRNAs que são diferencialmente expressos entre os três tipos de células. Os métodos para cultura de células iPS e RPE fetal são explicados. O protocolo utilizado para a diferenciação de RPE de iPS humana também é descrito. A técnica de extracção de RNA descrevemos foi seleccionado para permitir a recuperação máxima de ARN muito pequena para ser utilizado em um microarray miARN. Finalmente, via celular e análise de redes de dados microarray é explicado. Estas técnicas vão facilitar a comparação dos perfis de miRNA de três tipos de células diferentes.
Introdução
As células estaminais têm a capacidade de se replicar sem limite e o potencial para se diferenciar em qualquer tipo de célula somática. O desenvolvimento de técnicas para reprogramar células somáticas em células-tronco pluripotentes suscitou grande entusiasmo na comunidade científica e entre os médicos, como o advento da regeneração do tecido personalizado está no horizonte 1. Induzido por células-tronco pluripotentes (iPS) apresentam as mesmas características do potencial replicativo ilimitado e pluripotência como células-tronco embrionárias (ES), contornando os dilemas éticos associados à CES. Além disso, as células estaminais derivadas de pacientes não ....
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Protocolo
1. Preparação de Culturas Reagentes e placas de cultura
- mídia mTeSR1: Preparar mídia mTeSR1 acordo com as instruções do fabricante. Descongelar 100 ml de suplemento mTeSR1 5x durante a noite a 4 ° C. Adicione os 100 ml de suplemento mTeSR1 5x para 400 ml de mTeSR1 mídia basais e misture bem. Este meio é estável a 4 ° C durante até 2 semanas e à temperatura de -20 ° C durante 6 meses.
- Meios de diferenciação: Preparar meios de diferenciação em DMEM/F12 para produzir 0,1 mM β-mercaptoetanol, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 2,0 mM de L-glutamina, 10% de soro de knockout, e 10 ug / ml de gentamicina.
- mídia iPS-EPR: Preparar mídia iPS-R....
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Resultados
células iPS (Figura 1A) foram cultivadas em condições de diferenciação para induzir a diferenciação em células iPS-RPE. O iPS-RPE exibiu clássico fenótipo de RPE hexagonal morfologia das células pigmentadas (Figura 1B), semelhante ao RPE fetal (Figura 1C).
Para entender melhor o papel que pode desempenhar miRNA durante o processo de diferenciação de iPS a iPS-EPR, análise de microarray de expressão miRNA foi conduzido. O RNA total foi coleta.......
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Discussão
Em conclusão, este relatório descreve os métodos utilizados para a cultura de células iPS, iPS-RPE e RPE fetal. RPE derivado do iPS são morfológica e funcionalmente similares ao RPE fetal. O iPS-RPE também expressa genes RPE característicos incluindo RPE65, CRALBP, PEDF e LRAT 16. Para melhor caracterizar estas células, o RNA foi extraído e utilizado para realizar a análise de microarray para identificar diferencialmente expressos miRNA. A análise das intensidades de sinal revelou que foi detectado o maior nú.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
As opiniões ou afirmações contidas neste documento são os pontos de vista particulares de seus autores e não devem ser interpretadas como funcionário ou como refletindo os pontos de vista do Ministério do Exército ou do Departamento de Defesa.
Esta pesquisa foi realizada enquanto os autores Whitney A. Greene, Alberto Muniz, e Ramesh R. Kaini realizou uma Pós-Investigação Associateship Conselho Nacional de Pesquisa da USAISR.
Os ensaios foram realizados por Microarray Facility Cancer Research Institute Microarray Núcleo do Greehey Crianças e Bioinformática Departamento da UT Health Science Center San Antonio. <....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Meio mTeSR1 + suplemento 5X | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-β-mercaptoetanol | Sigma | M-7154 | |
| Aminoácidos não essenciais | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Substituição do soro knockout | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicina | Life Technologies | 15750-060 | |
| Mídia MEM | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 suplemento | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurina | Sigma | T-8691-25G | |
| Hidrocortisona | Sigma | H0888-1G | |
| Soro bovino fetal | Hyclone (Fisher) | SH3008803HI | |
| Sal de sódio triiodo-l-tironina | Sigma | T6397 | |
| Hidróxido de sódio | Sigma | S5881 | |
| Mídia RPE fetal Kit RTEGM | Life Technologies | 195406 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Fosfato tamponado solução salina | Hyclone (Fisher) | 10010-023 | |
| Tripsina | Hyclone(Fisher) | 25200-072 | |
| Miltenyi Biotec tampão de lavagem | StemGent | 130-092-987 | |
| Miltenyi Biotec tampão de enxágue | StemGent | 130-092-222 | |
| Kit de microesferas Anti-TRA-1-60 | StemGent | 130-095-816 | |
| Coluna classificadora de células Miltenyi Biotec | StemGent | 130-021-101 | |
| Micro kit RNeasy | Qiagen | 74004 | |
| QIA triturador | Qiagen | 79654 | |
| RNA 6000 Pico LabChip kit | Agilent | G2938-90046 | |
| Microarray de miRNA humano v16 | Agilent | G4471A |
Referências
- Yu, Z., et al. miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation. Front Genet. 3, 191 (2012).
- Romano, G., et al. A commentary on iPS....
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Reimpressões e permissões
