Reverter Genética Abordagem Morfolino Usando Injeção Cardíaca Ventricular para transf múltiplos tecidos de difícil alvo do Zebrafish Zergling

A regeneração de órgãos e apêndices é de fundamental importância para a sobrevivência e fitness; no entanto, vários vertebrados, incluindo o homem limitaram capacidades regenerativas. Embora existam vários modelos animais que têm ampla capacidade regenerativa, inverter técnicas genéticas para avaliar a função do gene durante o órgão e regeneração apêndice continuam a ser muito limitada ou inexistente. Por conseguinte, novas abordagens são necessárias para dissecar a biologia molecular de regeneração nestes organismos modelo.

O peixe-zebra é um modelo bem estabelecido para a compreensão da biologia celular e molecular do órgão e regeneração apêndice ^1, não só devido à sua significativa capacidade de regenerar vários órgãos, tecidos e apêndices, mas também porque existem várias linhas de peixes transgênicos para rastrear células e para sobre-expressar genes constrói ^{2, 3.} No entanto, a inibição do gene em peixes-zebra larval é limitada principalmente ao overexpression de construções dominantes-negativas, que não estão disponíveis para todos os genes de interesse ou cujo produto transgene pode adquirir efeitos ganho de função que não refletem a atividade endógena do gene. Assim, um método alternativo para remover especificamente expressão gênica por nocaute ou nocaute é necessária para superar esses problemas.

Específica do gene alvo usando TALENS existe como um meio genéticos reversa para nocautear a função do gene; no entanto, esta estratégia de nocaute é muito frequentemente limitado a avaliação funcional durante a embriogênese cedo, porque os requisitos iniciais do gene impedir a progressão do desenvolvimento embrionário. Assim, o estudo de fenômenos posteriores, como a regeneração ou a homeostase do órgão após o desenvolvimento usando TALENS é impedida ^{4, 5.} Portanto, uma estratégia alternativa de remoção de gene é necessário que atinge a função do gene após o desenvolvimento cedo para avaliar os requisitos de genes em órgãos e estruturas totalmente formados. Morfolino injecção foi demonstrado ser eficaz no direccionamento de genes em alguns órgãos adultos e adultos regenerar barbatana ^6-8, mas estes métodos requerem a electroporação e muitos órgãos internos são difíceis para electroporar, quer devido à sua localização, ou devido à sua sensibilidade à eléctrica perturbação. Além disso, alguns tecidos, em que a larva são difíceis de administrar directamente, devido à injecção directa pode perturbar a sua integridade estrutural ou porque o seu tamanho é limitante. O caudal da larva é uma estrutura deste tipo, porque a injecção directa na membrana embrionária não é possível. Assim, foi necessária uma alternativa para eletroporação e injeção direta para atingir genes em tecidos que são demasiado pequenos para injetar ou não pode ser eletroporados.

A fim de orientar e inibir a função de genes específicos durante a regeneração da nadadeira caudal larval, modificamos tecnologias morpholino existentes permitindo a umAVALIAÇÃO da função do gene durante a regeneração da nadadeira caudal em larva late-encenado. Este método emprega entrega intraventricular ⁹ de fluoresceína-marcado morpholinos juntamente com Endo-Porter reagente de transfecção ^10. Uma vez no interior do ventrículo, a mistura de morfolino-Endo-Porter espalha-se rapidamente por toda a larva através da vasculatura e entra tecidos que tenham sido previamente impossível de atingir. Este método de injecção pode ser modificado para alvejar genes em tecidos específicos e, possivelmente, pode ser aplicado em outros modelos animais, que não têm ainda métodos de genética inversa para inibir a função do gene. Assim, oferece um método rápido e fácil com o potencial para uso amplo leque de estudar imediatamente a função do gene durante a homeostase órgão geral e regeneração em estágios larvais.

1. Preparação das agulhas de vidro (Figura 1)

1. Use capilares de vidro com um diâmetro 0,75 milímetros para preparar as agulhas de injeção (Figura 1A).
2. Colocar o capilar de vidro, em um extrator de agulha e puxe a agulha com o seguinte parâmetro: valor ciclo de aquecimento: 463; puxando valor ciclo: 230; velocidade: 150 ms; tempo: 150 mseg (Figura 1B).
3. Quebre o capilar de vidro puxado com uma pinça relojoeiro para produzir uma agulha de 20 um de diâmetro sob um estereoscópio com uma ocular micrométrica.
4. Use um torno com uma roda de fiar de borracha molhada para aguçar a agulha e produzir a 20 mM bisel (Figuras 1C e 1D). Nota: Sharp, agulhas biseladas melhorar a facilidade de inserção no interior do ventrículo e, portanto, minimizar o dano ao tecido e permite que o músculo perfurada para selar após a remoção da agulha (figuras 1E-G).

2. Preparção da Solução Morfolino

1. Prepare o estoque morfolino dissolvendo o morfolino liofilizado em 1x com fosfato tamponado salino (PBS) a uma concentração final de 7,5 mM. [Veja as instruções do fabricante para obter mais detalhes (tabela Materiais)].
2. Preparar a solução de injeção morfolino misturando solução estoque morfolino 2,5 mL (7,5 mM) com 2,8 mL solução Endo-Porter estoque (1 mM) (Ver tabela de materiais) para uma concentração final de 3,5 mM morfolino e 0,5 mM Endo-Porter.

3. Preparação de Injecção Morfolino (Figura 2)

1. Coloque a agulha de vidro chanfrado com 5 mL desta solução, utilizando uma micropipeta com a 10 mL microloader ponteira.
2. Inserir a agulha de vidro no suporte de agulha do micromanipulador ligado à bomba de pico pneumático (Figuras 2A-C).
3. Coloque o suporte da agulha ao lado do microscópio de modo que a agulha apenas as necessidadespara ser movido numa direcção planar a inseri-lo no interior do ventrículo cardíaco da larva (Figura 2A).
4. Ajuste o ângulo para as injeções em torno de 45 °.
5. Defina os valores microinjetor como segue: pressão de recalque: 20 libras por polegada quadrada (psi); pressão de ejeção: 15 psi; 100 ms gama de gating, valor do período de 1,9 (corresponde a 10,9 ms).
6. Melt agarose em 1x PBS utilizando um forno de microondas padrão para produzir 20 ml de 1,5% (w / v) de gel. Despeje gel derretido em um prato de 10 centímetros de Petri. Coloque uma forma de injeção ranhuras no agarose quente, de modo que uma vez endurecido, o agarose terá sulcos em que a larva sedado serão colocados ¹¹ (Figuras 2D e 2E).

4. Injecções (Figura 3)

1. Anestesiar larva em 100 ml de água do aquário com 20 mg / L tricaina (sulfonato L-etil-m-amino-benzoato de-metano) até que pare de responder ao toque.
2. Use uma pipeta Pasteur de plásticoe transferir cuidadosamente a larva sedado dentro de uma ranhura do molde de agarose molhado de modo que o lado ventral está virada contra a parede vertical do sulco de agarose (Figura 3A).
3. Colocar a placa de agarose sob o microscópio estereoscópico, de modo que o ventrículo está voltado para fora a partir da agulha de injecção (Figura 3A).
4. Abaixe a agulha para inseri-lo para o ventrículo cardíaco. Insira a agulha apenas 1-2 mM para o ventrículo tomando cuidado para não inserir a agulha muito profundamente (Figura 3B e 3C).
5. Uma vez que a agulha é inserida, injectar a solução de morfolino no ventrículo com 4-6 pulsos, cada um fornecendo 3 nl da solução, com intervalos de espera para permitir a compensação do coração (Figuras 3D e 3E).
6. Após a injecção, retirar a agulha (paralelo ao plano de inserção) e, em seguida, transferir cuidadosamente a larva usando uma pipeta de Pasteur de plástico cheio com meio E3 back em uma placa de Petri contendo meio fresco E3.
7. Coloque a agulha em uma placa de Petri contendo 1x PBS para impedir a secagem da agulha durante a transferência da larva injectado.
8. Repita os passos 4,1-4,6 cada 12-24 horas, para a duração da experiência. Nota: Repetindo as injecções assegura a captação e manutenção da morfolino em células.

5. Análises de injecções (Figura 4)

1. Anestesiar os peixes em 100 ml de água do aquário com 20 mg / L tricaina até que parar de responder ao toque.
2. Coloque a larva lateralmente em uma superfície plana molhada 1,5% (w / v) placa de agarose cobertas com meio E3.
3. Larvas de imagem usando um microscópio estereoscópico com claro e imagens de fluorescência. Observação: Como as larvas são transparentes, o morfolino marcado com fluoresceína deve ser visível como verde fluorescente nos vasos sanguíneos em todo o animal imediatamente após a injecção. Esta fluorescência irá dispersar ainda mais nos tecidos vascularizados pela15 minutos (Figuras 4A-4C).

6. Avaliação da Regenerativa Conseqüência

1. Avaliar as imagens capturadas usando Fiji Imagem J software livre (http://fiji.sc/Fiji). Para investigar a regeneração, use a ferramenta de rastreamento de linha para determinar a quantidade de crescimento regenerativo que ocorreu em controle e injeção de larva morfolino.
2. Para calibrar imagens, abrir um dos arquivos de imagem originais em Fiji por arrastar e soltar o arquivo para a janela principal de Fiji.
3. Para definir a escala para todas as imagens a seguir, vá para "Analisar" no menu principal.
4. No menu drop-down, clique em "Definir escala".
5. Nesta janela, ative a opção "Global", clicando na caixa de seleção.
6. Agora, abra a imagem para medir a quantidade de crescimento regenerativo novamente por arrastar e soltar (veja o passo 6.1).
7. Escolha a ferramenta "seleções à mão livre" na barra de ferramentas.
8. Cercar a área a ser medida (Figuras 4J-4D).
9. Pressione Ctrl + M. Isto irá abrir uma nova janela "Results", mostrando o valor da área cercada em pixels quadrados.

O forte, agulha de injeção chanfrado é facilmente colocado no ventrículo cardíaco da larva zebrafish quando foi abordado dorsal (Figura 3A). O coração continua a bombear e o fluxo de sangue é mantido apesar da presença da agulha (figuras 3B e 3C). Injeções cuidadosas não perturbar a morfologia do ventrículo ou contrações cardíacas (Figura 3D), apesar de a injeção do morfolino para o coração (Figura 3E).

Dentro de minutos, a solução de morfolino-Endo-Porter distribui por todo o organismo através da vasculatura (Figuras 4A e 4B). O morfolino é então distribuída a partir da vasculatura em diferentes tecidos, como a membrana embrionária e no cérebro durante pelo menos 12 horas ou mais, tal como observado a partir da fluorescência (Figura 4C).

Nesta abordagem, nós removemos a ponta distal do the membrana embrionária, a ponta distal da medula espinal, músculo tronco distal, distal da notocorda e células de pigmento (figuras 4D e 4H); todos os quais são difíceis de alvejar especificamente por injecção directa, devido à compactação (músculo), tamanho pequeno (medula espinhal e notocorda) e magreza (membrana embrionária), mas parecem incorporar o morfolino após injeções ventriculares de série, que é visto por fluorescência dentro destes tecidos (Figura 4E) em comparação com os animais uninjected (Figuras 4F e 4G). Assim, este método de forma relativamente fácil promove a entrega de morfolino para tecidos que são difíceis de atingir de forma individual, e que permite a avaliação da função de genes em vários tecidos do fin regenerador de uma só vez. Para avaliar a importância de genes específicos envolvidos na regeneração, um amputa cirurgicamente parte da nadadeira caudal larval (Figura 4H), ressecção de todos os tecidos que têm incorp orated o morfolino (Figura 4I). A membrana embrionária larval regenera sua estrutura dentro de alguns dias após a amputação (dpa) (Figura 4J). Morfolino segmentação   um gene necessário para a regeneração (dados não publicados) resulta em uma resposta regenerativa perturbado (Figura 4K) em comparação com não injectada (Figura 4J) e controlos morfolino desadaptação (Figura 4D). O efeito total desses experimentos morpholino em conseqüência regenerativa pode ser medida usando ferramentas morfométricas padrão nos programas Fiji publicamente disponíveis 12 traçando os tecidos regenerados e comparando as áreas (Figuras 4J-4D). Assim, este método de direccionamento de genes proporciona um ensaio rápido e relativamente fácil de testar a importância dos genes no processo de regeneração.

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Figura 1. Preparação de agulhas capilares de vidro para injeção. A) tubo capilar de vidro antes de puxar (acima) e puxou agulha (abaixo). B) aparelho puxando Needle. C) Torno para chanfro e afiar a agulha de vidro. A agulha é vista através dos binóculos. D) O torno é um disco giratório de borracha molhada. A agulha é lentamente baixado sobre o disco. E) afiado da agulha devem ter uma curta de bisel que há mais tempo (20 mm) do que a largura (20 mm) para minimizar o espaço necessário para inserir toda a extremidade da agulha no cardíaca larval ventrículo. F) imagem ampliação superior que mostra a ponta da agulha. G) ​​Vista esquemática da ponta de agulha, mostrando a forma de o chanfro após afiar.

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Aparelho de injeção Figura 2. Configurar. A) Equipamento completo para injeção de morfolina em larva de peixe-zebra. B) Suporte para controlar o posicionamento da agulha durante as injeções. C) A bomba de pico que regula a pressão pneumática para injectáveis. D) Forma de imprensa usado para criar o molde de agarose. E) molde de agarose usado para estabilizar larva injectável.

Figura 3. Injeção de larva de peixe. A) de posicionamento da agulha em relação a larvas de peixe-zebra. B) Inserção no ventrículo cardíaco. C) da fluorescência do morfolino na agulha, mas ausente no ventrículo antes injectiem. D) imagem de campo claro mostra a relação entre o tamanho da agulha de vidro e o ventrículo larval E) Injecção da morfolino fluorescente no ventrículo do coração.. As barras de escala igual a 100 um.

Figura 4. Dispersão de morfolino em todo peixe. A) 3 dias de idade Zebrafish larva. B) Fluorescência de morfolino em todo o sistema vascular do corpo (v) 5 minutos após a injecção ventricular. C) Dispersão do morfolino em todo o animal, incluindo membrana embrionária (ff) marcado com fluoresceína, o cérebro (b) em idosos larva após injeções de morfolino a cada 12 horas D) tecidos na nadadeira caudal larval e tronco:.. notocorda (n), medula espinhal (sc), pigmento (p), e membrana embrionária (ff) E) Dispersos morfolinovários minutos após a injeção em tecidos larvais tronco, incluindo a membrana embrionária imagem Brightfield de tronco larval uninjected e nadadeira caudal. F). A linha tracejada indica o plano de amputação em potencial. G) fin uninjected fotografada com o filtro GFP mostrando autofluorescência em verde (setas). A forma dendrítica das estruturas fluorescentes sugere que estas são as células de pigmento. H) imagem de campo claro de um caudal de larvas amputado cirurgicamente através do notocórdio, músculo e da medula espinhal. Eu) imagem fluorescente, mostrando a distribuição nos tecidos morfolino coto. Morfolino incorporação no músculo, medula espinhal, notocorda e membrana embrionária. J) regenerada estruturas membrana embrionária caudais do tipo selvagem larva. Linha preta traça os tecidos regenerados para a análise de quantificação. K) inibição Morfolino mediada de regeneração. Linha de traçado Preto destaca claramente a redução re regeneraçãoposta depois knockdown morfolino. L) regenerada membrana embrionária caudal de larva injetado com uma morfolino controle incompatibilidade mostrando uma resposta regeneração semelhante à de larva não injectado (J). As barras de escala igual a 100 um.

Os autores não têm nada a revelar.