Desenvolvimento de Amelogenina-quitosana Hidrogel para<em&gt; In Vitro</em&gt; Esmalte Regrowth Com uma interface Densa

Resumo

Neste artigo, nós descrevemos um protocolo para a fabricação de um hidrogel amelogenina-quitosana para reconstrução de esmalte superficial. Organizado em crescimento situ de cristais de apatita no hidrogel formado uma interface esmalte-restauração densa, o que irá melhorar a eficácia e durabilidade das restaurações.

Resumo

A reconstrução biomimética do esmalte é um tópico significativo na ciência dos materiais e na odontologia como uma nova abordagem para o tratamento de cárie dentária ou erosão. A amelogenina provou ser uma proteína crítica para controlar o crescimento organizado de cristais de apatita. Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado para reconstrução superficial do esmalte usando um novo hidrogel de amelogenina-quitosana. Em comparação com outros tratamentos convencionais, como flúor tópico e enxaguatório bucal, esse método não só tem o potencial de prevenir o desenvolvimento de cárie dentária, mas também promove uma restauração significativa e durável do esmalte. A microestrutura organizada semelhante ao esmalte regulada por conjuntos de amelogenina pode melhorar significativamente as propriedades mecânicas do esmalte condicionado, enquanto a densa interface esmalte-restauração formada por um crescimento in situ de cristais de apatita pode melhorar a eficácia e durabilidade das restaurações. Além disso, o hidrogel de quitosana é fácil de usar e pode suprimir a infecção bacteriana, que é o principal fator de risco para a ocorrência de cárie dentária. Portanto, este hidrogel de amelogenina-quitosana biocompatível e biodegradável mostra-se promissor como um biomaterial para a prevenção, restauração e tratamento do esmalte defeituoso.

Introdução

O esmalte dentário é a superfície mineralizada dura dos dentes humanos. É composto por numerosos cristais de apatita em forma de agulha, que são agrupados em prismas paralelos organizados para garantir a resistência mecânica única e a proteção biológica que o esmalte fornece^1-2. Ao contrário de outros tecidos mineralizados, como osso e dentina, o esmalte maduro é acelular e não pode se regenerar após perda mineral substancial^1-2, que geralmente ocorre como cárie dentária ou erosão. Produtos disponíveis comercialmente, como vernizes contendo flúor, cremes dentais e enxaguatórios bucais, são eficazes na remineralização do esmalte, mas nenhum deles tem o potencial de promover a formação de cristais de apatita organizados. Clinicamente, o tratamento convencional para reparo do esmalte envolve um procedimento de preenchimento com materiais artificiais, como amálgama, cerâmica ou resina composta ³. No entanto, esses materiais geralmente não interagem bem com o tecido natural ao redor da lesão, porque suas estruturas, componentes e propriedades são diferentes do esmalte natural. Como resultado, a cárie secundária freqüentemente se desenvolve ao longo do tempo na interface entre o dente e os materiais estranhos. Portanto, o crescimento in situ do esmalte com uma interface densa é um alvo atraente para os campos da ciência dos materiais e estomatologia. Uma maneira particularmente promissora de atingir esse objetivo é a síntese biomimética de material semelhante ao esmalte na superfície do esmalte. Recentemente, inúmeras tentativas in vitro foram feitas para preparar materiais semelhantes ao esmalte usando sistemas biomiméticos que contêm nanoapatitas ou diferentes aditivos orgânicos ^4-12. No entanto, desenvolver a estratégia biomimética ideal para promover cristais de remineralização para alcançar uma interface densa perfeita ainda é um desafio.

Durante a mineralização do esmalte, o crescimento orientado e o alongamento dos cristais de apatita são regulados por uma matriz rica em amelogenina ^1,13-14. Para imitar a matriz orgânica no desenvolvimento do esmalte, descrevemos aqui um protocolo detalhado para a fabricação de um hidrogel de amelogenina-quitosana (CS-AMEL) para o crescimento do esmalte in situ em uma superfície de esmalte condicionada com ácido usada como modelo para lesões erosivas. Como "o meio de crescimento mais versátil" para cristais ¹⁵, as matrizes de hidrogel têm uma vantagem sobre um sistema de solução, pois clinicamente são mais fáceis de manusear. Além disso, o CS-AMEL é biocompatível, biodegradável e possui propriedades antimicrobianas e de adesão únicas que se comparam favoravelmente com outros sistemas biomiméticos para aplicações odontológicas ¹⁶. É importante ressaltar que a mineralização in situ de cristais de apatita na superfície do esmalte fornece uma interface densa entre a camada reparada e o esmalte natural, o que pode potencialmente melhorar a durabilidade das restaurações e prevenir a formação de novas cáries na margem da restauração.

Protocolo

Os molares humanos foram extraídos seguindo os procedimentos padrão para a extração da Escola Ostrow de Odontologia da University of Southern California e manipulados com a aprovação do Conselho de Revisão Institucional.

1. Preparação de dente ácido-gravadas Slice

1. Selecione um terceiro molar humano sem cárie restauradas.
2. Retirar a porção de raiz do molar, e cortar a coroa do molar longitudinalmente em fatias de 2 mm de espessura, utilizando uma baixa velocidade de serra de diamante arrefecida com água. Ultrassonicamente limpar essas fatias por 2 minutos, em seguida, enxágüe-os com água deionizada 3 vezes.
3. Para simular lesões erosivas, gravar as fatias de dentes com 30% de ácido fosfórico por 30 segundos, em seguida, lave-os imediatamente com água deionizada.
4. Ultrassonicamente limpar as fatias gravadas por 2 min, e em seguida, enxágüe-os com água deionizada 3 vezes.

2. Preparação de Hidrogel amelogenina-quitosano

1. Preparation da solução de quitosana
   1. Dissolve-se 1% (w / v) de quitosano (peso molecular médio, 75-85% desacetilada) numa (v / v) de solução a 1% de ácido acético, seguido por agitação a 80 ° CO / N.
   2. Depois de arrefecer a solução até à temperatura ambiente, filtra-se a solução de quitosano utilizando um filtro de 0,45 um. Ajustar o valor de pH para 5,0 por adição de solução de NaOH 1 M.
2. Preparação de cálcio e uma solução de partida de fosfato (0,1 M)
   1. Pesar de cloreto de cálcio _(CaCl2) e preparar uma solução 0,1 M, em seguida misturar com um vortex até que a solução é límpida. Ajustar o valor de pH para 11 por adição de solução de NaOH 1 M.
   2. Pesar de fosfato de sódio dibásico (Na ₂ HPO ₄₎ e preparar uma solução 0,1 M, em seguida misturar com um vortex até que a solução é límpida.
3. Expressão e purificação de amelogenina recombinante ^17-18
   O full-length amelogenina porcino recombinante (rP172) usado aqui tem 172 aminoácidos e é um análogo de cheiaDe comprimento P173 porcina nativa, mas sem a metionina N-terminal, bem como um grupo fosfato em Ser16 ^18.
   1. Adicionar 20 g de caldo de Lisogenia (LB) agar em pó em 500 ml de água desionizada, a solução em autoclave a 121 ° C (ajuste líquido) durante 20 min. Deixe arrefecer ágar para ~ 55 ° C, adicionar ampicilina (100 ug / ml) em solução de agar.
   2. Transferir a solução agar para placas de Petri, que cada placa fria até que ele é sólido, em seguida, virar para evitar a condensação no ágar. Armazene as placas em sacos de plástico a 4 ° C.
   3. Raia a placa de agar LB com células de E. coli recombinante (-BC21) a partir do stock de glicerol (-80 ° C). Incubar as placas de O / N a 37 ° C.
   4. Preparar 50 ml de meio NZCYM e os meios de comunicação autoclave a 121 ° C durante 30 min. Permita que os meios de comunicação para esfriar, adicione 50 mL de 100 mg / ml de ampicilina para os 50 ml de mídia.
   5. Inocule uma colónia isolada a partir da placa de LB agar para os meios de 50ml NZCYM suplementado com ampicillpol Incubar as células S / N em um incubador com agitação a 37 ° C.
   6. Prepare 1 litro de mídia NZCYM e autoclave a mídia a 121 ° C por 30 min. Adicionar 1 ml de 100 mg / ml de ampicilina a 1000 ml de meio. Tome uma densidade óptica (DO) a leitura como um espaço em branco usando um espectrofotômetro UV-Vis. NOTA: Não descartar este após a primeira leitura.
   7. Inocular 10 ml de cultura de células a partir do passo 2.3.5 em 1000 ml de meio a partir do passo 2.3.6. Ler a densidade óptica a 595 nm, imediatamente após a inoculação. Pegue a leitura da densidade óptica periodicamente para acompanhar o crescimento. NOTA: Leia o branco cada vez que o OD está tomada.
   8. Induzir com 700 ul de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG, 1 H), quando o crescimento bacteriano atinge a cerca de 0,75 ~ 0,8 OD a 595 nm.
   9. Colheita das células, quando o OD atinge 1,1. Verter o conteúdo do balão para 6 frascos de plástico. Equilíbrio e pesar as garrafas antes de usar a centrífuga. Centrifugar durante 20 minutos a 8554 xg, a 4 ° C.Manter o pellet celular no -20 ° CO / N.
   10. Retire as pelotas de células e combiná-los em um tubo de 50 ml. Adicionar 3,5 ml de cloridrato de guanidina 4M por L de fermentação. Sonicate 2-3 vezes no gelo, 30 seg de cada vez, com intervalos de 1 min.
   11. Fazer diluições 6x de volume das células com ácido fórmico 0,5% e deixá-lo mexer na câmara fria durante 2 horas. Centrifugar durante 30 minutos, 8554 xg, a 4 ° C. Manter o sobrenadante. Adicionar 20% de sulfato de amônio saturada utilizando a solução de saturada e agitação na sala fria, O / N.
   12. Centrifugar durante 30 minutos, 8554 xg, a 4 ° C e manter o sedimento. Reconstituir os peletes em 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA), a carga em uma coluna C4 (10 x 250 mm, 5 mm), e fraccionar usando um gradiente linear de A = 0,1% de TFA e B = 60% de acetonitrilo em TFA, com uma taxa de 1,5 ml · min ^-1 fluir.
   13. Congelar a solução de proteína em gelo seco e liofilizar a amostra congelada S / N.
4. Preparação de amelogenina-quitosana (CS-AMEL) hydrogel (Figura 1A)
   1. Adicionar 200 mg de rp172 para um tubo contendo 960 ml de solução de quitosano a 1%, em seguida misturar com um vortex até que a solução é límpida.
   2. Adicionar 25 ul de 0,1 M de solução de _CaCl2, seguido de 15 ul de 0,1 M de Na ₂ HPO ₄ a solução a solução de quitosano contendo amelogenina, em seguida misturar com um vortex durante 5 min.
   3. Ajustar o pH da solução de CS-AMEL para 6,5 ​​por adição cuidadosa de solução de NaOH 1 M. CS-AMEL hidrogel irá formar-se quando o valor do pH atingir 6,5.

3. Esmalte Regrowth em Amelogenina-quitosana Hidrogel

1. Preparação de solução de saliva artificial
   1. Dissolve-se uma certa quantidade de cloreto de magnésio _(MgCl2, 0,2 mM), cloreto de cálcio (CaCl _2, 1 mM), fosfato de potássio (KH ₂ PO _4, 4 mM), cloreto de potássio (KCl, 16 mM) e cloreto de amónio ( NH ₄ Cl, 4,5 mM) em HEPES 20 mM(4 - (2-hidroxietil)-etano-sulfónico piperazina-1 de ácido) de tampão ^12.
   2. Ajustar o pH para 7,0 com NaOH 1 M e armazenar a solução de saliva artificial a 4 ° C.
   3. Antes de usar a solução, adicionar fluoreto de sódio (NaF, 300 ppm).
2. Aplicação de CS-AMEL hidrogel
   1. Aplicar cerca de 20 ul de hidrogel CS-AMEL ao corte de dente gravado utilizando uma seringa (Figura 1B).
   2. Seca-se o corte de dente coberta de hidrogel num exsicador à TA durante 2 horas.
   3. Transferir o corte de dente para um copo contendo 30 ml de solução de saliva artificial. Cobrir a proveta com folha de alumínio, e, em seguida, manter o recipiente num forno a 37 ° C durante 7 dias.
   4. Remover o corte de dente e secá-lo num exsicador à TA.

4. Caracterização da interface entre a camada recentemente crescido e Esmalte

A microestrutura da interface entre a camada recentemente crescido e esmalte foi observed por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia eletrônica de transmissão de alta rotação (HR-TEM). A amostra TEM foi preparado utilizando um feixe de íons focalizado (FIB), técnica, os passos para o que são os seguintes.

1. Coloque a amostra em um instrumento FIB-SEM e terminar todos os alinhamentos de acordo com as instruções de operação. NOTA: Ajuste fino Z deve ser realizada pelo menos duas vezes.
2. Depositar uma camada de carbono (15 x 3 mm) com a amostra para proteger a estrutura subjacente (Figura 2A).
3. Moinho da amostra cuidadosamente os lados superior, inferior e direita da camada de carbono para preparar um pequeno pedaço de amostra e, em seguida, corte a parte inferior desta peça fina. NOTA: Verifique o alinhamento do feixe de iões antes de cada etapa de moagem (Figura 2B).
4. Solda uma ponta Pt sobre a parte fina e corte do lado esquerdo para separar o pedaço de amostra (Figura 3C). NOTA: Verifique o alinhamento do feixe de iões antes da etapa de soldagem.
5. Retire tEle PT ponta com a amostra lentamente, e montar a amostra lamelar dentro de uma grade TEM elevador-out.
6. Retire a ponta da amostra, e fina a amostra até a sua espessura é menor do que 100 nm (Figura 3D). Retirar a amostra do instrumento para realizar a observação MET. NOTA: Verifique o alinhamento do feixe de iões antes de cada processo de desbaste.

5. Avaliação da vinculação e propriedades mecânicas da camada recém-Grown

1. A força de ligação é avaliada por tratamento de ultra-sons. Mantenha o corte de dente reparado em um limpador ultra-sônico (42 kHz, 100 W) por 10 min, e em seguida, observar a interface entre a camada de esmalte reparado e natural com uma análise SEM retroespalhados-elétron.
2. Medir a dureza e módulo de elasticidade aos 20 pontos de teste em cada superfície do esmalte reparado (n = 3) por uma nano-penetrador com uma ponta de Berkovich.

6. Imunofluorescência Coloração

1. Lave a fatia de dente com Tris buffer salino (TBS) durante 15 min.
2. Bloquear com 1% de albumina sérica bovina (BSA) em TBS durante 15 min.
3. Remover o líquido e incubar a amostra S / N com 1 ° Ab (1:500 galinha anti-Amelogenina) diluído em TBS (0,1% de BSA, 0,3% de Triton X-100).
4. Lava-se a amostra com TBS durante 30 min e incubar S / N ° 2 com Ab (1:100 Anti-galinha FITC) diluído em TBS.
5. Lava-se a amostra com TBS durante 30 minutos e deixou-se secar durante mais 30 min.
6. Observar por microscópio de fluorescência.

Resultados

A eficácia do protocolo aqui descrito é demonstrado por microscopia eletrônica de varredura (MEV), difração de elétrons selecionado área (SAED) e difração de raios-X (XRD) analisa. Após o reparo por amelogenina-quitosana (CS-AMEL) hidrogel por 7 dias, uma camada de esmalte com uma espessura de 15 mm foi formada na superfície esmalte condicionado. A camada recentemente cultivadas foi efectuada de matrizes altamente ordenada de cristais com um diâmetro de cerca de 50 nm, de preferência crescente ao longo do eixo c, perpen...

Discussão

Embora o conteúdo mineral do esmalte é alta tornando-o mais difícil de tecido mineralizado no corpo humano, esta biocerâmica é suscetível a processos de desmineralização, que muitas vezes ocorrem como cárie dentária ou erosão. Mutações no gene, também podem causar esmalte finas ou macias que conduzem a uma série de doenças hereditárias de malformação esmalte chamado Amelogenesis imperfeita ^20. Produtos de cuidados de saúde oral que contenham flúor ou CPP-ACP ter sido no mercado há vários anos (is...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Terceiro molar humano	Faculdade de Odontologia Ostrow da Universidade do Sul da Califórnia	N/A	Os molares humanos foram extraídos seguindo os procedimentos padrão para extração na Ostrow School of Dentistry da University of Southern California e tratados com a aprovação do Conselho de Revisão Institucional.
Pocina amelogenina recombinante	Expressão e purificação  em laboratório	N/A	rP172, de comprimento total
Quitosana	Sigma-Aldrich	448877	Peso molecular médio, 75-85% ácido
fosfórico desacetilado	VWR	AA033266
Ácido acético glacial	VWR	A036289
Hidróxido de sódio	VWR	BDH9292
Cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich	223506
Fosfato de sódio dibásico anidro	VWR	BDH0316
BL21-CodonPlus (DE3)-RP	Agilent Technologies Inc.
Sulfato de amónio	VWR	BDH8001
Ácido trifluoroacético	VWR	AAAL06374
Acetonitrila	VWR	BDH1103
Cloreto de magnésio	VWR	BDH0244
Di-hidrogenofosfato de potássio	VWR	BDH9268
Cloreto de potássio	VWR	BDH0258
Cloreto de amónio	VWR	AAAA15000
HEPES (4-(2-Hidroxietil)piperazina-1-etano-ácido sulfónico)	VWR	AAA14777
Fluoreto de sódio	VWR	AA11561
Solução salina Tamponada com Tris	Bio-Rad	170-6435	10&vezes; TBS
Albumina sérica bovina	EMD Millipore	12659	CalBioChem, Albumina, Soro Bovino, Fração V, Metais Pesados Baixos
Triton X-100	EMD Millipore	TX1568-1
Anti-Amelogenina de Frango	N/A	N/A	Um presente do Prof. Malcolm Snead, Universidade do Sul da Califórnia
Bovino Anti-Frango IgY-FITC	Santa Cruz Biotechnology	Sc-2700
Sistema de Cromatografia Líquida de Alto Desempenho	Agilent Technologies Inc.	Coluna Varian Prostar 210
C4	Phenomenx	Júpiter 5μ Microscopia Eletrônica de Varredura 300A
	JEOL	JSM-7001
FIB-SEM	JEOL	de Transmissão JIB-4500
	JEOL	JEM-2100F
Serra digital de diamante de baixa velocidade	MTI Corporation	SYJ-150
Microscopia de fluorescência	Leica	DMI3000 B
Limpador ultrassônico	Branson	2510	42 kHz, 100 W
Nano-indentador	Agilent Technologies Inc.	MTS XP