Transferência de prótons e Proteína Conformação Dynamics em fotossensíveis Proteínas por Time-resolvido Passo-scan-Fourier Transform Infrared Spectroscopy

Resumo

As principais etapas da função da proteína, em particular as mudanças conformacionais da espinha dorsal e as reações de transferência de prótons, geralmente ocorrem na escala de tempo de microssegundos a milissegundos. Esses processos dinâmicos podem ser estudados por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier de varredura em etapas resolvida no tempo, em particular para proteínas cuja função é desencadeada pela luz.

Resumo

Monitoramento da dinâmica de protonação e proteína backbone mudanças de conformação durante a função de uma proteína é um passo essencial para a compreensão de seu mecanismo. Protonação e conformacionais alterações afectam o padrão de vibração de cadeias laterais de aminoácidos e da ligação peptídica, respectivamente, ambas as quais podem ser sondados por infravermelho (IR), espectroscopia de diferença. Para proteínas cuja função pode ser repetitivamente e reprodutivelmente desencadeadas pela luz, é possível obter os espectros de diferença de infravermelhos com (sub) resolução microssegundo sobre uma ampla gama espectral usando a técnica de infravermelhos passo digitalizar transformada de Fourier. Com ~ 10 -10 ^{2 3} repetições da fotorreacção, o número mínimo de completar uma varredura a resolução espectral razoável e largura de banda, o nível de ruído no espectro de diferença de absorção pode ser tão baixo como ~ 10 ^{- 4,} suficiente para seguir a cinética da mudanças de protonação de um único aminoácido. Baixaros níveis de ruído pode ser realizada por mais média de dados e / ou de processamento matemático. A quantidade de proteína necessária para resultados óptimos é entre 5-100 mg, dependendo da técnica de amostragem utilizada. Quanto requisitos adicionais, a proteína tem de ser primeiro concentradas num tampão de baixa força iónica e, em seguida, seca para formar um filme. O filme de proteína é hidratado antes da experiência, quer com pequenas gotas de água ou sob humidade atmosférica controlada. O nível de hidratação atingida (g de água / g de proteína) é medido a partir de um espectro de absorção de infravermelho. Para demonstrar a técnica, estudamos a photocycle do bacteriorodopsina da bomba de prótons de luz dirigido em seu ambiente membrana roxo nativo, e do light-gate canal iônico channelrodopsina-2 solubilizado em detergente.

Introdução

Para elucidar completamente como proteínas desempenhar a sua função, é necessário medi-los como eles trabalham, ou seja, ao longo de um caminho de reação que muitas vezes envolve uma série de intermediários e estende várias ordens de tempo. As principais etapas de função da proteína ocorrem frequentemente no microssegundo para milissegundo intervalo de tempo ^1, em particular backbone mudanças conformacionais e reações transferências de prótons em proteínas de membrana. Cristalografia de raios-X, sem dúvida, o pilar da biologia estrutural, proporciona estáticos (time-média) densidades de elétrons a partir de bem-difração cristais de proteínas, notoriamente difíceis de crescer com as proteínas da membrana ^2. A modelo atômico 3D pode ser construído com base em densidades de elétrons, embora raramente incluindo a localização dos átomos de hidrogênio. Progresso notável na cristalografia de raios-X resolvida no tempo, quer confiando no Laue difracção ³ ou em femtosecond pulsos de raios-X ^4, acrescenta a dimensão de tempo para a informação estrutural elevada eminerentes a cristalografia de raios X ^5. Mas deixando de lado os desafios técnicos e analíticos, a rede cristalina pode prejudicar backbone mudanças conformacionais e alterar a dinâmica de proteínas, uma lacuna inevitável de métodos baseados em cristais de proteínas ^5. Consequentemente, os aspectos dinâmicos de proteínas são ainda melhor coberto por métodos ópticos, como pioneira pelo flash fotólise ^6,7, embora com a desvantagem geral da visão estrutural limitado.

Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR), combina a resolução temporal de espectroscopia óptica com uma sensibilidade valioso para a estrutura da proteína, a última característica explorada em investigações estruturais e funcionais estáticos em inúmeras proteínas de membrana ^8-11. Em particular, a diferença de espectroscopia FT-IR tem provado ser uma ferramenta ideal para estudar mudanças espectrais minúsculos como um trânsitos de proteína de um estado metaestável para outro ^12-19.

Studies sobre a dinâmica de proteínas, que não no nível única molécula ^20,21, exigem um processo de disparo para a sincronização. A reacção é convenientemente iniciada rápido e não invasivo usando luz como gatilho, como foi feito no estudo de proteínas com fotoreações cíclicos. Um dos principais desafios associados a estudos resolvido em tempo é a realização de resolução de tempo suficiente, mantendo a boa resolução espectral e relação sinal-ruído adequado. É essencial também para cobrir uma gama suficientemente ampla espectral e temporal. Time-resolved passo de varrimento espectroscopia FT-IR sobressai em todos estes aspectos ^22, com exemplos publicados cobrindo faixas espectrais tão largo quanto 3,900-850 cm ^-1 e dinâmica que se estende ~ 9 ordens de tempo, com até 3,5 ^cm1 espectral e resolução temporal de 30 ns ^23-28.

Espectrômetros de infravermelho com transformada de Fourier mostram redução de ruído e maior precisão fotométrica sobre os dispersivos ^29. However, no modo de gravação rápida varredura normal espectrômetros FT-IR sofre de uma resolução de tempo limitado a ≥ 5-10 ms, como consequência do tempo mínimo do espelho móvel do interferômetro requer para completar uma varredura. Com a técnica de passo de varrimento, em contraste, a dependência do tempo do evento dinâmico é desacoplado da duração do varrimento do interferômetro. Resumidamente, os movimentos do espelho móvel em passos discretos, em vez de continuamente varredura para completar uma varredura. Em cada uma dessas etapas o (móvel) espelho é mantida fixa e uma passageira é gravado. Assim, a resolução de tempo é limitada pelo tempo de subida do mercúrio-cádmio-telureto (MCT) do detector, que é geralmente na gama de 10-100 ns. Na prática, a grande faixa dinâmica do interferograma (contendo um sinal intenso nos sinais centerburst e pequenas nas asas), requer a digitalização adequado um conversor analógico / digital (ADC) com até 16-24 bits, levando à amostragem taxas não superiores a ~ 200 kHz(5 ms) ^30. Nanossegundo tempo resolução pode ser realizada por medição de apenas as mudanças no interferograma, para que um bit ADC 8-12 é suficiente ^23,31-33. Aspectos técnicos ^30,34,35 e aplicações ^36-38 de tempo resolvido passo-scan foram discutidos em detalhe em outro lugar.

A finalidade da contribuição actual é proporcionar um protocolo descrevendo os aspectos práticos do passo de varrimento espectroscopia de FT-IR de resolução por tempo nas proteínas de membrana fotossensíveis. Aqui, o desempenho da técnica é mostrado para dois métodos de amostragem: transmissão e de reflexão total atenuada (ATR). O uso de ATR permite trabalhar na presença de excesso de água, o que não só assegura condições de hidratação completa para a proteína, mas também permite o controlo agudo do pH da amostra e força iónica ^49,50. Experimentos Passo-Scan são ilustrados em dois sistemas selecionados: bacteriorodopsina e canal-2.

O bacteriorodopsina bomba de protões luz-driven (BR) tem sido objeto de numerosos estudos biofísicos para mais de quarenta anos ^39,40, tornando-se a proteína de membrana best-entendido até agora. Entre as várias técnicas empregadas para o estudo de funcionalidade bR espectroscopia FT-IV, indiscutivelmente, exercida uma das maiores impactos. Ou seja, a espectroscopia FT-IR tem sido a chave para resolver os grupos envolvidos na transferência de prótons através da membrana como contabilizados em outros lugares ^13,41,51.

Channelrodopsina (CDH) é o primeiro canal iônico fechado leve encontrado na natureza ^42,43. Excitação da luz de ChR leva à abertura transitória de um canal de iões. Sua descoberta se estabeleceu o caminho para o desenvolvimento de optogenetics, onde os processos moleculares são controlados por luz ^44,45. ChR pertence, como Br, para a família de rodopsinas microbianos mas, em contraste com Br, muito menos se conhece sobre o seu mecanismo funcional ^52. ChR2 combina a sua função como um ion canal com a atividade de bombeamento de prótons ^46,47. Recentemente, nós aplicamos passo-scan espectroscopia FT-IR resolvida no tempo para resolver reações de transferência de prótons intra-proteína ea dinâmica de proteínas backbone mudanças de conformação em ChR2 ^48.

Protocolo

1. Aspectos gerais da amostra e Instrumento Preparação

1. Use um espectrômetro comercial FT-IR equipado para medições passo-scan resolvida no tempo. Para obter os melhores resultados colocar o espectrómetro de FT-IR na parte superior de uma mesa dissociado-vibração.
2. Evacuar o compartimento de ótica para alguns mbar. Purgar o compartimento da amostra com ar seco ou azoto.
3. Coloque um IR material transparente opaco à radiação visível na frente do detector MCT do espectrómetro de FT-IR. Esta precaução é essencial para evitar artefatos do pulso de laser emocionante durante experimentos passo-scan. Nota: Nós usamos um de germânio (Ge) janela de 25 mm de diâmetro. O alto índice de refração faz com que intensidade indesejável perde, em grande parte evitadas usando um filtro de Ge com revestimento antireflexo.
4. Refresque-se o detector MCT Dewar com nitrogênio líquido. Nota: O uso de detectores fotovoltaicos MCT é preferido sobre photoconductives devido à sua resposta linear e, por conseguinte, photometr superioresic precisão e confiabilidade da linha de base ^31,53.
5. Pré-concentrar a amostra usada para as experiências para, pelo menos, 2 mg de proteína / ml em um tampão de baixo (<20 mM) a força iónica para evitar a formação de cristais de sal, enquanto a secagem da suspensão de proteína para formar uma película homogénea de proteína. Para amostras que sedimento, lavar / concentrá-las através da aplicação de ultracentrifugação (por exemplo, proteínas de membrana, um lipossomas ou em pedaços de membrana celular). Use centricons de corte adequada para proteínas que não fazem sedimento (por exemplo, proteínas de membrana solubilizadas em detergente).
6. Para melhores resultados use: a) preparações de proteínas tão puro e ativo quanto possível; b) Relação de lípidos / proteínas ≤ 3 em peso para as proteínas em manchas de membrana celular ou reconstituídos em lipossomas; c) índices de detergente / proteína ≤ 1 em peso para as proteínas de detergente solubilizado. Evite o uso de detergentes ou lipídios cujas bandas vibracional se sobrepor aos da proteína (por exemplo, rachaduras).

2. Preparação de total atenuada Experimentos reflexão sobre bacteriorodopsina

1. Montagem do acessório de ATR para dentro do compartimento da amostra do espectrómetro de FT-IR. Nota: Nós usamos um ATR ZnSe / diamante com 5 reflexões ativos. Evite materiais semicondutores como o germânio ou de silício como elemento de reflexão interna (IRE) do acessório ATR, como suas propriedades ópticas são afetados pelo laser visível emocionante.
2. Meça uma ampla gama (aprox. 4,000-800 cm ^-1) espectro de energia em 4 ^cm-1 de resolução da superfície IRE limpa, rápida-scan espectroscopia FT-IR convencional. Utilizar este espectro de um espectro de referência para calcular espectros de absorção em uma fase posterior.
3. Cobrir a superfície IRE do ATR com 20 mL de tampão usado mais tarde para re-hidratar a amostra (por exemplo, 4 M de NaCl e 100 mM de NaPi, pH 7,4). Medir a absorção de infravermelho do tampão.
4. Retire o tampão, e lavar a superfície wi IREª água. Evite tocar na superfície. Remover o líquido residual a partir da superfície do IRE por uma intensa corrente de ar.
5. Espalhe ~ 3 ul de bacteriorodopsina (BR) em membranas roxas (~ 6 mg de proteína / ml em água desionizada) por cima da superfície IRE (-0,2 cm ² de área). Seca-se a suspensão da proteína sob uma ligeira corrente de ar seco até um filme é atingido.
6. Medir o espectro de absorção do filme seco (ver Figura 1).
7. Adicionar cuidadosamente 20-40 ul de um tampão de elevada força iónica para hidratar o filme seco (por exemplo, 4 M de NaCl e 100 mM de NaPi, pH 7,4). Nota: A força iónica elevada impede inchamento excessivo da folha de membrana, o que permite reter o máximo de proteína possível fechar a superfície apalpada (Figura 2).
8. Cobrir o suporte do ATR com uma tampa para evitar a evaporação da água. Opcionalmente, colocar um revestimento de cobertura ligada a um banho de circulatório definido como 25 ° C por controlo da temperatura. Para as proteínas com photocycles longos (& #62; segundos), o controle de temperatura pode aumentar a estabilidade da linha de base.
9. Meça um espectro de absorção. Estimar a percentagem de amostra que permanece perto da superfície após a re-hidratação do filme através da subtracção do espectro de absorção do tampão (Figura 3).
10. Confirmar estabilização da película inchaço gravando os espectros de absorção a 5-20 minutos de intervalo após a re-hidratação (Figura 4). Este passo é opcional, mas recomendado.

3. Realização de experimentos de transmissão de detergente-solubilizado channelrodopsina-2

1. Adicionar 10 ul de ChR2 (~ 10 mg de proteína / ml) dissolvido em mM NaCl 5 mM, HEPES 5 (pH 7,4) e decil-maltósido (DM) no centro de uma janela BaF ₂ de 20 mm de diâmetro. Espalhá-lo com a ajuda da ponta da micropipeta para um diâmetro de 6-8 mm (proteína de densidade superficial de ~ 200 ng / cm ^2).
2. Forma um filme using um fluxo suave de ar seco. Para obter os melhores resultados de assegurar que a película é homogéneo e tem um diâmetro mais ou menos correspondente ao tamanho do feixe de infravermelhos na maior abertura.
3. Hidratar a película através da adição de 3-5 uL de uma mistura de glicerol / água distribuída em 3-5 gotas em torno do filme seco, e com força perto o com uma segunda janela utilizando um silicone plana O-ring de ≥ 1 mm de espessura. Nota: A relação da mistura de glicerol / água controla a humidade relativa entre as janelas ^54. Para amostras hydroscopic usar uma proporção 3/7 ou 2/8 de glicerol / água (w / w). As gotas de glicerol / água nunca deve estar em contato direto com o filme de proteína.
4. Insira os BaF ₂ janelas colada em um suporte. Impedir que a luz directamente a partir do detector, atingindo a tapar a janela da amostra com um material opaco IR, tais como papel, com um orifício que corresponde ao tamanho da película hidratada. Colocar o suporte no compartimento da amostra.
5. Controlar a temperatura do suporte a 25 °C por uma camisa termostática ligado a um banho de temperatura controlada circulatório.
6. Medir um espectro de absorção. Assegure-se que a absorção máxima na região da amida I (~ 1,700-1,620 cm ^-1) está na gama de 0,6-1,0.
7. Estimar a massa ea razão molar de proteína / detergente / água a partir do espectro de absorção do filme hidratado (Figura 5) utilizando extinção referência espectros coeficiente de água, DM, e proteínas de membrana representativos (Figura 6).
8. Aguarde até que o nível de hidratação estabiliza antes de realizar experimentos passo-scan (≥ 1 h).

4. Ajuste e sincronização do Laser Emocionante

Para experiências na BR usar a segunda emissão harmônica de um Nd pulsado: YAG (λ = 532 nm) para acionar o photocycle. Para experimentos envolvendo ChR2, use uma excitação de λ = 450 nm, conforme previsto por uma oposcilador paramétrico tico (OPO) impulsionada pela terceira harmónica (λ = 355 nm) de um laser Nd: YAG. Certifique-se que o pulso de laser é suficientemente curto (~ 10 ns) para minimizar a foto-excitação secundária. Nota: A energia dos pulsos de laser deve ser tão constante quanto possível. Em nossa configuração, a intensidade do laser oscila ≤ 10% em torno da média, como foi confirmado pela medida um reflexo do laser por um fotodiodo conectado a um gravador de transientes e integrando a resposta (Figura 8).

1. Par o laser para a amostra. Ajustar a densidade de energia do laser na amostra de 2-3 mJ / cm ² por impulsos utilizando um medidor de potência.
   1. Para a configuração do ATR, use uma fibra óptica colocado em cima da tampa do ATR.
   2. Para as experiências de transmissão, usar espelhos para trazer o laser para a amostra e, se necessário, para as lentes ou colimar ou divergir o feixe de raios laser para um diâmetro ligeiramente superior ao tamanho da amostra de filme.
2. Sincronize o laser pulsar com a gravação de dados pelo espectrômetro. Use o Q-switch sync-out TTL pulso da eletrônica do laser Nd: YAG para acionar o espectrômetro. Defina a frequência de excitação do laser Nd: YAG a 10 Hz para a BR e 0,25 Hz para ChR2, respectivamente.
3. Usar um gerador de impulsos de atraso (PDG) para controlar a taxa de excitação de laser, se o ritmo de repetição do laser Nd: YAG não é facilmente ajustável.
   1. Ligue a lâmpada sync-para fora do laser Nd: YAG para a entrada de disparo externo PDG. A PDG fornece uma saída de ~ 190 ms de pulso TTL adiada para o Q-switch sync-in de entrada do laser Nd: YAG para acionar o de laser. Portão da PDG para aceitar um gatilho externo somente após certo período de tempo desde o último gatilho aceita (100 ms para a BR ou 4 segundos para ChR2).

5. Preparações Passo-scan Time-resolvidos e configurações

1. Coloque um passe filtro óptico baixo no caminho óptico. Para executar medições passo-scan resolvida no tempo na 1,800-850 centímetros ^-1 gama espectral, usar um filtro de cima opaco 1950 centímetros ^-1 e com boa transmissão (> 50-80%) a seguir 1800 centímetros ^-1 (Figura 7).
2. Altere o detector de AC para o modo DC-coupled. Nota: Após este ajuste o sinal interferogram deixarão de oscilar em torno de zero, mas em torno de um valor conhecido como o nível DC.
3. Utilizar a maior abertura possível de feixe do aparelho para maior fluxo de fotões e, assim, uma melhor relação sinal-ruído, mas dentro dos limites de linearidade do detector.
4. Traga o nível DC do interferograma a zero e reajustar o ganho eletrônico para fazer melhor uso da faixa dinâmica do digital analógico convertido (ADC). Atingir compensada aplicando uma polarização de tensão para o sinal fornecido pelo pré-amplificador DC-nível. Nota: Esta opção é incluída em modernos espectrômetros FT-IR. Caso contrário, um dispositivo externo feito em casa pode ser utilizado em vez disso, colocada entre o pré-amplificador e o ADC ^38. O cuidado é, em seguida,necessária para garantir que os componentes electrónicos de tal dispositivo são rápidos e linear.
5. Comece o menu passo-scan do espectrômetro FT-IR. Defina a largura de banda espectral alvo para a medição passo-scan para 1,975.3-0 cm ^-1. Ajuste a largura de banda espectral para uma fração do número de onda do laser de He-Ne (1/8 ^{º lugar} no presente caso), ligeiramente superior a de corte do filtro óptico.
6. Desative qualquer filtro eletrônico passa-alta para evitar distorções da cinética em momentos posteriores. Um filtro eletrônico passa-baixa pode ser benéfico quando a sua frequência de corte é da ordem ou acima da taxa de amostragem do ADC (aliasing reduz ruído).
7. Defina a resolução espectral e fase a 8 ^cm-1 e 64 ^cm-1, respectivamente. Defina o modo de aquisição interferogram para um único lado para a frente. Com essas opções um interferograma requer cerca de 500 pontos.
8. Defina a taxa de amostragem do ADC para o mais alto disponível no espectrômetro (por exemplo, 160 kHz, ou 6,25 ms). Defina o "gatilho para a experiência" para "externo", ou seja, o laser é o mestre. Defina o número de pontos de dados linearmente espaçados a ser gravado: 7.000 para Br (até 42 ms) e 20.000 para ChR2 (até 125 ms). Nota: mais longas escalas de tempo pode ser coberta sem transbordar a memória ADC usando um quasi-logaritmicamente impulsos TTL externas espaçadas de tempo a partir de um gerador de ondas para accionar a aquisição de dados ^38, ou utilizando dois gravadores de transientes paralelas como substitutos do ADC interno ^{31, 32.}
9. Salve aproximadamente 100 pontos pré-gatilho como uma referência para o estado escuro da amostra. Nota: Na escala de tempo de milissegundos a qualidade dos dados é muitas vezes limitada por flutuações no espelho móvel. Aumentar os pontos de pré-disparador acima de 100 é, por conseguinte, não deverá melhorar significativamente a qualidade dos dados.
10. Defina o número de co-adições, ou seja, número de médias do fotorreação por espelho positião. Para a BR, use 20 colegas de adições (20 min de medir o tempo em 10 Hz taxa de excitação). Para ChR2 usar dois colegas de adições (70 mínimo de medir o tempo em 0,25 taxa de excitação Hz)
11. Repita a experiência de 10x para a BR, e 35x em três diferentes filmes de amostra para ChR2, ter finalmente ~ 200 colegas de adições por posição espelho.

6. Processamento de Dados

1. Confirmar o estado da amostra por meio da comparação do espectro de IV diferença induzida pela luz a partir da primeira e da última medição. Considere descartar quaisquer medições, onde a intensidade do espectro de diferença cai abaixo de 60% da primeira dosagem.
2. Calcular a média dos interferogramas gravados.
   1. Usando o software OPUS do espectrômetro FTIR selecionar os interferogramas resolvido em tempo para a média e adicioná-los à "Spectrum Calculator".
   2. Clique "=" para se obter a média dos interferogramas.
      Nota: Quando a fase do interferogramaé constante durante a medição é indiferente a interferogramas média ou espectros de canal único. A fase constante pode ser confirmada através do cálculo e comparar o espectro de fase para a primeira e a última interferograma gravada.
3. Realizar a transformada de Fourier dos interferogramas resolvida no tempo em média para obter espectros de canal único resolvida no tempo em média.
   1. Usando o mesmo software como no passo 6.2.1, selecione o interferograma resolvida no tempo em média e clique no ícone de "interferograma de espectros". Use o método Mertz fase de correção, um fator zero preenchimento de 2 (dois pontos digitais por resolução instrumental), e uma função de apodização (por exemplo, triângulo, Blackmann-Harris 3-termos, etc.)
   2. Clique em "Convert" inferior para transformar o interferograma resolvida no tempo em espectros resolvida no tempo.
4. Exportar os dados de canal único resolvido em tempo como uma "tabela de pontos de dados" ou um ", "Arquivo usando o" Matlab salvar como "ícone no software OPUS. Continue o processamento de dados em um programa externo.
   1. Média, os espectros de canal único antes do laser, e converter os dados de canal único resolvido em tempo para espectros diferença absorção resolvida no tempo.
   2. Calcular um vector para o desvio padrão do ruído esperada no espectro diferença, como uma função do número de onda (Figura 12), utilizando o desvio padrão do ruído, ε, e significam, S ₀ (ν), dos espectros de canal único 100 precede o laser: ε / S ₀ (ν). O valor de ε é estimado subtraindo espectros de canal único consecutivo e calculando o desvio padrão corrigido por √ 2.
   3. Retirar regiões espectrais demasiado barulhentas para ser de uso (por exemplo, acima de 1.825 centímetros ^-1 e inferior a 850 ^cm-1).
   4. Realize uma quase-logarítmica média (por exemplo, 20 espectros / hora década). O appearance de dados irá melhorar e o número de espectros serão reduzidos a partir de 10 ~ ⁴ a 10 ~ ^2, sem qualquer perda significativa de informação (Figura 9).
   5. Aumento de quatro vezes a densidade espectral de pontos (1 ponto / cm ^-1), utilizando interpolação Fourier (pós-zero enchimento).
      Nota: execute os passos 6.4.1 a 6.4.4 em um programa feito em casa correndo em MATLAB.
5. Processar os espectros de tempo resolvido obtido (Figura 10A), com a decomposição do valor singular SVD, (Figura 13). Realizar a filtragem de dados por meio da reconstrução dos dados com um número limitado de componentes SVD significativas (Figura 10B). Nota: Realizamos SVD em MATLAB, utilizando a função "svd" built-in.

Resultados

A Figura 1 mostra um espectro de absorção de uma película seca de bR depositado sobre a superfície do diamante elemento de reflexão interna utilizados para a espectroscopia de ATR. Bandas características de vibrações da ligação peptídica (amida A, amida I e amida II) são claramente distinguíveis. A espessura aproximada da película seca pode ser estimada como ~ 1 mM, considerando a quantidade de proteína adicionada (18 mg) e a superfície da ATR (~ 0,2 centímetros ^2), e tendo a densidade da proteína como ~ 1,4 g / cm ^{3, 58} e de lípidos como 1.0 g / cm ^{3, 59} e uma proporção de lípido / proteína de 1/3 (w / w) de púrpura membrana ^60.

O filme seco foi re-hidratado com um excesso de 4 M de NaCl, 100 mM de NaPi, pH 7,4 (Figura 3). A concentração de proteína e o nível de hidratação eficaz no volume sondada pela onda evanescente pode ser deduzida a partir do factor de escala necessária para remover digitalmente bandas de absorçãode água. O factor de escala óptima foi de 0,87, o que significa que, neste caso, o tampão ocupa 87% e a amostra de 13% do volume próximo da superfície. Tendo em conta a proteína e densidade lípido e a proporção de lípido / proteína em membranas roxas (ver acima), podemos deduzir uma concentração eficaz da proteína de 125 mg / ml no volume sondada pela onda evanescente. Pode-se deduzir a partir do nível de hidratação, que, neste caso específico, a espessura da película da amostra expandida ~ 6 vezes por re-hidratação, a partir de ~ 1 a ~ 6 um. Para um ângulo de incidência de 45 °, típica para o nosso e para a maioria dos regimes de ATR, a profundidade de penetração de campo evanescente (d _p) para um filme de proteína hidratado varia entre 0,3 e 0,6 mM no 1,800-850 ^cm1 intervalo ^61. Uma vez que o campo evanescente é quase insensível a amostra localizado duas vezes acima d _p ^61, infere-se que a quantidade de proteína utilizada na experiência ATR poderia ser, em princípio, reduzida 5x without qualquer perda significativa de sinal.

Ao usar tampões de baixa força iónica da película expande-se mais, e a quantidade de proteína no volume sondado pelo campo evanescente é reduzida (Figura 2). A dependência exacta entre o inchaço de filmes e a força iónica do tampão irá depender, entre outros factores, da natureza dos lípidos. Por exemplo, uma película semelhante inchaço como aqui obtido por Br em membrana púrpura usando NaCl 4 M foi obtida para uma proteína de membrana reconstituído em polar E. lípidos coli utilizando apenas NaCl 0,1 M ^62. Se a amostra ocupa menos do que 5% do volume de re-sondado considerar fazendo o passo de hidratação através de um tampão de maior força iónica. Filme inchaço após hidratação requer algum tempo para atingir a estabilização (Figura 4). Para Br em membrana roxo o processo é monoexponencial, com uma constante de tempo de 12 min: ele não leva mais de 30-60 min para ter um filme reidratadas estável

A Figura 5 mostra um espectro de absorção no infravermelho de uma película de ChR2 hidratado obtido por transmissão. Aqui, a hidratação foi conseguida através da exposição do filme seco de uma atmosfera de humidade controlada fornecido por uma mistura de glicerol / água. O espectro pode ser decomposto em contribuições de água, detergente e proteína. Podemos estimar a quantidade de cada um deles usando extinção espectros coeficiente, dimensionada para caber o espectro experimental. Para a água que tomou o espectro do coeficiente de extinção da literatura ^63, e por DM medimos a partir de uma solução de 100 mg / ml (Figura 6). Também utilizados os coeficientes de extinção para duas proteínas da membrana mitocondrial representativos: a transportadora ADP / ATP ⁶⁴ e BR (Figura 7). O factor de escala indica uma massa de água e DM densidade de superfície de 260 g / cm ^2, e 200 ug / ^cm2 na película, respectivamente. A absorção remanescente (Figure 5, linha vermelha) vem principalmente da proteína, estimada com uma densidade de superfície de 250 g / cm ^2, usando o coeficiente de extinção da amida II a partir de duas proteínas de membrana diferentes (ver Figura 6). A proporção molar para a proteína / detergente / água foi calculada como sendo de 1/60/2000 utilizando uma massa molecular de 35 kDa, 480 Da, e 18 Da, respectivamente.

Um gráfico 3D a partir do passo de varrimento experimento de FT-IR de resolução por tempo típico de Br é apresentado na Figura 10A, obtida pela ATR e envolvendo 200 min de aquisição de dados. Spectra pode ser extraído em horários específicos, por exemplo, quando o L, M e N intermediários do photocycle bR devem chegar a sua população mais alta (Figura 11). Suas características espectrais foram descritos extensivamente ^13,41,65 e não será discutido aqui. Figura 12 mostra os traços de tempo em alguns números de onda selecionados. Ou seja, o aumento da cinética de 1762 cm ^-1 (t _1/2 ~ 60 ms) relatórios sobre a dinâmica do Asp85 protonação da base Schiff retina ^66, e sua decadência a zero indica sua desprotonação após a recuperação do solo-sate ^67. O aumento negativo da cinética de 1740 centímetros ^-1 (t _1/2 ~ 1 mseg) relata sobre a desprotonação da cadeia lateral de Asp96, o dador de protões para a base de Schiff ^68. O decaimento da intensidade a zero relatórios sobre a sua reprotonação do citoplasma ^67. A dinâmica das alterações de conformação da proteína podem ser sondados por alterações de absorção na região de amida I e II de amida, que atinge uma alteração máxima no ~ 3 mseg à temperatura ambiente ^67,69.

A aplicação de SVD para espectroscópicas problemas foi revisto antes ^55,56. Resumidamente, SVD fatoriza os dados experimentais, dispostas numa matriz A, tal como: A = L S V ^T. Esta fatoração pode ser modificado para ter em conta a dependência do ruído em número de onda e penalizar flutuações / desvios na linha de base ^57. As colunas de U e V contêm espectros ortonormal e tempos traços vectores para cada componente SVD, respectivamente. S é uma matriz diagonal contendo os chamados valores singulares. Os componentes (resumo) espectro-temporais em U e V são apresentadas na diminuição relevância para descrever os dados experimentais, no sentido dos mínimos quadrados, quantificada pelo valor singular associado. Figura 13A mostra os valores singulares como uma função do número de componentes, e reproduz os primeiros oito colunas / componentes do U (espectros abstrato, Figura 13B) e V (abstrato de tempo traços, Figura 13C). O sinal é concentrado nos primeiros cinco componentes (tal como esperado para um photocycle contendo cinco estados intermediários), com componentes acima amplamente dominado pelo ruído aleatório e outras fontes de erros. Os dados experimentais foram reconstruídos usando apenas as cinco primeiras colunas de U e V, e os primeiros cinco colunas e linhas de S. Os dados reconstruídos por SVD representa a melhor aproximação de mínimos quadrados dos dados experimentais para uma matriz de classificação de cinco. Os dados reconstruídos mostra a melhoria da qualidade (Figura 10B). Ou seja, o ruído é, em grande parte reduzidos, bem como algumas flutuações quase imperceptíveis e desvios na linha de base (comuns em espectroscopia passo-scan resolvida no tempo ^25). SVD processamento é especialmente vantajosa para melhorar a qualidade dos tempos traços experimentais no intervalo milissegundo (linhas vermelhas na Figura 12).

Dados passo-scan resolvida no tempo para a photocycle ChR2 foram obtidos utilizando o protocolo descrito acima para transmissão experimentos Sion (Figura 14a), envolvendo cerca de 120 horas de medições acumuladas. Os dados resolvido em tempo recolhidos pelo passo-scan estende de 6,25 ms a 125 ms. O photocycle de ChR2 requer cerca de 60 s para a recuperação total. A última parte do photocycle podem ser cobertos com rápida-scan FT-IR, e ambos passo-scan e conjuntos de dados de rápida varredura fundidos, tal como apresentado em outro lugar ^48. As mudanças espectrais de ChR2 são ~ 10 vezes menores do que os obter da BR, tornando as medições mais desafiador. Especialmente, as oscilações na linha de base na escala de milissegundos se tornar evidente a essas mudanças de baixa absorção. Estes são devido a pequenas oscilações no espelho móvel na escala de tempo de milissegundos ^25. As oscilações, juntamente com parte do ruído, pode ser, em grande parte removido por SVD, melhorar de forma significativa a aparência dos dados (Figura 14B).

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Espectro de absorção Figura 1. Da BR na membrana roxo seco sobre a superfície do diamante de um acessório ATR. Bandas de vibrações da ligação peptídica (amida I, II, e A) são indicados.

Espectro Figura 2. Absorção de uma película de bR após rehidratação utilizando tampões de várias forças iónicas (diluições de 4 M de NaCl, 100 mM de Na ₂ HPO ₄ / NaH ₂ PO _4, pH 7,4). Observe o decréscimo da banda da amida II, ou seja, o aumento inchaço filme, com a diminuição da força iônica do tampão. (Insert) quantidade relativa de proteína próximo da superfície, quantificados pela intensidade da absorvância a 1541 centímetros ^-1 (amida II máximo) após subtractisobre a contribuição da absorção do buffer.

Espectro de Absorção de Figura 3. De um filme de re-hidratados com tampão bR granel (4,3 M força iónica) e, após subtracção da contribuição de tampão. O factor de subtracção, 0,87, foi escolhido para eliminar a absorção de água forte entre 3,700-3,000 cm ^-1 e para obter uma linha de base plana entre 2,700-1,800 cm ^-1.

Espectro de Absorção de Figura 4. De bR após re-hidratação com um tampão de 4,3 M de força iónica (absorção tampão foi subtraído para maior clareza, como na Figura 3). A inserção mostra a evolução da película de inchaço após rehydratde iões, seguindo-se a absorvância da proteína amida II em 1541 centímetros ^-1. Um ajuste de uma única exponencial indica uma constante de tempo para a película inchaço estabilização de 12 min.

Espectro Figura 5. Absorção de um filme hidratado de ChR2 medido pela transmissão (linha azul). A extinção espectro coeficiente de água (linha laranja tracejada) e DM (linha tracejada cyan) foi escalado e subtraído (linha vermelha).

Figura 6. Reproduzido extinção de massa Os espectros de coeficiente de 25 ° C para a água no estado líquido (http://www.ualberta.ca/ ~ jbertie / JBDownload.HTM # Spectra) e por uma película hidratada da portadora / ATP a ADP (AAC) ⁶⁴ . trong> O espectro do coeficiente de extinção de massa foi medida em solução para a MS (100 mg / ml), e em um filme hidratado para bR.

Figura 7. Transmitância do filtro óptico utilizado na varredura-scan medições FT-IR resolvido em tempo.

. Figura 8 Desempenho dos pulsos de laser fornecidos pelo segundo harmônico (532 nm) de um Nd:. YAG Histograma da variação da energia relativa de 1.000 pulsos de laser, e apto para uma distribuição normal com um desvio padrão de 0,05.

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Figura 9. Light-induziu alterações de absorção da BR em três números de onda representativos a tempo de espaçamento uniforme intervalos (verde, preto e linhas azuis) e após uma média de quase-logarítmica para ~ 20 pontos / década (linhas vermelhas). Observe a redução de ruído depois média logarítmica, revelando oscilação do tempo traça na gama dos milissegundos.

Representação em 3D Figura 10. De mudanças de absorvência de luz induzida pela BR gravadas por ATR a pH 7,4 (NaCl 4 M, NaPi 100 mM). A) Os dados brutos. B) Os dados reconstruídos com cinco componentes SVD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11. FT-IR espectros de absorção da diferença photocycle bR em três momentos seleccionados, onde o L (12,5 ms), M (300 ms), e N (6 ms) são intermediários mais enriquecidos.

Figura 12. Transferência de prótons e proteína dinâmica de backbone no photocycle bR como resolvidos por passo-scan FT-IR diferença espectroscopia resolvida no tempo. As mudanças de absorbância em 1762 centímetros ^-1 relatórios sobre a dinâmica de protonação / desprotonação do Asp85, e em 1741 centimetro ^-1 na dinâmica desprotonação / reprotonação de Asp96 (incluindo alterações H-colagem antes de 300 ms). O prazo-traços em 1670 e 1,555 centímetros ^-1relatam mudanças em amida I e II vibrações, tanto sensíveis para a conformação do esqueleto do péptido. Os traços de volta correspondem aos dados brutos, e os vermelhos aos dados tratados com SVD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 13. Decomposição em valores singulares (SVD) dos passo-scan dados experimentais resolvido em tempo FT-IR da photocycle Br (ver Figura 10A). SVD foi realizada depois de pesar os dados experimentais tendo em conta a relação entre o desvio padrão do ruído em número de onda (Figura 15); combinada com o derivado 1 ^r para reduzir o peso estatístico da variação da linha de base, tal como descrito antes ^57. A) & #160; Lote dos valores singulares relativas dos 50 primeiros componentes (círculos pretos). Os primeiros cinco componentes são designados para sinalizar componentes (círculos vermelhos). O resto dos componentes do decaimento exponencial como esperado para barulho componentes (ver linha cinza tracejada). B) Primeiro oito espectros abstrato (U ₁ a U _8). C) Primeiro oito abstratas temporais traços (V ₁ a V _8). Os espectros de abstrato e de tempo traços atribuídos ao sinal são retratados em linhas vermelhas, e com linhas pretas de outra forma. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Representação Figura 14. 3D de IR alterações de absorção de luz induzida para ChR2 gravadas por passo-scanno modo de transmissão. Os dados passo-scan se estende até 125 ms, apenas cobrindo uma parte do photocycle. A) Os dados brutos. B) Os dados reconstruídos com cinco componentes SVD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 15 nível. Ruído estimado em um Diferença espectro FT-IR. Absorção em 6,25 ms temporais e 8 ^cm-1 de resolução espectral para um experimento envolvendo uma posição co-addition/mirror (500 fotoreações) ou ~ 200 posição co-addition/mirror (10 ⁵ fotoreações). Os valores são apresentados para a reflexão total atenuada (ATR) ea configuração da transmissão.

Discussão

Um dos primeiros aspectos que deve ser considerado quando se realiza o passo de varrimento experiências FT-IR resolvidos no tempo de uma proteína é a preparação de uma amostra de uma forma adequada para a espectroscopia de infravermelho. A absorção de IV dos outros do que a proteína de interesse substâncias tem de ser reduzida, especialmente a partir de água. A abordagem mais comum é a evaporar a água da amostra a granel de modo a formar um filme. O filme pode ser re-hidratado, quer por adição de algumas gotas de uma solução aquosa ou por exposição da película a uma atmosfera de humidade controlada. Nós mostramos como em ambos os casos, é possível calcular o nível de hidratação obtido por meio de espectroscopia de absorção de infravermelho (ver Figura 3 e Figura 5). Embora os níveis de hidratação obtidos podem aparecer baixa em comparação com aqueles que em solução, eles são realmente perto aos encontrados em células vivas ^70, fazendo com que o estudo dos filmes hidratados de proteínas funcionalmente relevantes. Além de água, eleTambém é importante conhecer e controlar a quantidade de lípidos ou detergentes na amostra. Ambos devem ser mantidos baixos o suficiente para ter um impacto na redução da espectroscopia de absorção de infravermelho, mas suficientemente alta para preservar a integridade e funcionalidade da proteína de interesse.

Espectroscopia passo-scan resolvida no tempo só é diretamente aplicável às proteínas que mostram reações reversíveis que podem ser acionados reproduzível pela luz (mas ver o progresso em acoplamento passo-scan com troca rápida buffer) ^71. No passo-scan a reação precisa ser reprodutível por pelo menos ~ 500x, o número mínimo para completar um interferograma cobrindo 1,800-850 cm ^-1 região em 8 ^cm-1 de resolução. Na prática, contudo, a média de dados adicional é geralmente necessária para empurrar o nível de ruído. Para 200 posição co-additions/mirror (10 ⁵ repetições da reação) um espectro de 6.25 ms resolução diferença de absorção pode exibir uma sta ruídodesvio ndard entre 2 x 10 ^-5 e 2 x 10 ^-4 por um ATR e entre 5 x 10 ^-6 e 3 x 10 ^-5 para um experimento de transmissão (Figura 15). Graças à sua maior taxa de transferência de fótons, a transmissão permite a ~ 7 níveis de ruído mais baixos do ATR, um aspecto fundamental para o estudo com sucesso amostras que deram alterações de absorção fracas, como ChR2. Por outro lado, a ATR exige 5 a 25 vezes menos do que uma amostra de ensaio de transmissão.

A aplicação de passo-scan espectroscopia FT-IR resolvida no tempo é problemático para as proteínas que exibem photocycles lentas: gravar um interferograma a passo-scan pode se tornar impraticável longo. Algumas soluções têm sido apresentadas para lidar com esses casos ^72,73, muitas vezes baseados em usar várias amostras de troca para acelerar medidas à custa do aumento do consumo de proteínas e complexidade experimental ^27,74. Em alguns casos, é possível contornar este problema por excitando a amostra antes da photocycle é estritamente concluída. Para ChR2, com photocycle exigindo após foto-excitação de 60 segundos para a recuperação de 99%, a recuperação em 4 seg já de 80% é ^48. Com uma eficiência de excitação de 10% por pulso de laser, de 98% de moléculas CHR2 estão no estado escuro 4 seg após foto-excitação, tornando possível realizar experiências com uma taxa de repetição de laser de 0,25 Hz.

O processamento de dados é um aspecto técnico final necessárias para atingir os melhores resultados possíveis. Média logarítmica reduz o ruído e, também importante, reduz o tamanho dos dados, sem distorções, uma característica essencial para a análise de dados posteriores através de decomposição em valores singulares ou montagem global. Média logarítmica é, no entanto, não é muito bem sucedido em média as flutuações no tempo-traços causados ​​por oscilações no espelho móvel e outras fontes de ruído 1 / f durante as medições (Figura 9). Estas flutuações na linha de basepode exceder o ruído no intervalo milissegundo e corrompido a qualidade dos dados. Decomposição de valor singular aproveita a redundância de dados para reduzir o ruído, e com algumas modificações ⁵⁷ pode reduzir assim as flutuações na linha de base.

Finalmente, a maior parte mais difícil e demorada de um passo de varrimento experimento de FT-IR de resolução por tempo corresponde à atribuição de bandas e a interpretação do espectro e cinética dos dados. Para bacteriorodopsina muitas das bandas que aparecem na diferença espectros IR foram atribuídos ou interpretados graças ao trabalho acumulado de muitos grupos de pesquisadores ao longo de décadas. Para uma proteína muito menos estudado, tais como canal-2, os experimentos IR resolvido em tempo acima apresentados têm de ser acompanhadas por experiências paralelas em mutantes sítio-dirigidas e combinados com informações de técnicas complementares para chegar a uma interpretação mecanicista ^48.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Espectrômetro FT-IR	Bruker	Vertex 80v	Equipado com detector fotovoltaico-MCT, um global externo e uma bomba isenta de óleo. Firmware 2.3.
Janelas BaF2	korth Kristalle
Diamond ATR Acessório	Smiths detecção		DuraDisk de nove reflexos
Mesa desacoplada	de vibração Julabo	F25
com um segundo gerador harmônico	Eletro-Óptica Contínua	Minilite
Oscilador paramétrico óptico (OPO)	OPTA	BBO-355-VIS/IR S/N 1009
Gerador de pulso/atraso digital	Stanford Research Systems	DG535
Laser Nd:YAG pulsado com um terceiro gerador harmônico	Spectra-Physics	Quanta-Ray
Vários espelhos ópticos e lentes	ThorLabs
OPUS 7.0	Bruker		Software para controlar o espectrômetro Vertex 80v
MATLAB tempo de execução	Mathworks		Usado para executar programas executáveis caseiros para Pré-processe os dados