Quantificação e Tamanho-profiling de vesículas extracelulares Usando Sintonizável resistiva Pulso Sensing

Summary

Vesículas extracelulares desempenham papéis importantes em processos fisiológicos e patológicos, incluindo a coagulação, as respostas imunes e cancro ou como agentes terapêuticos potenciais na entrega da droga ou medicina regenerativa. Este protocolo apresenta métodos para a quantificação e caracterização tamanho de vesículas extracelulares isolados e não-isolados em vários fluidos usando ajustável sensor de pulso resistiva.

Abstract

Vesículas extracelulares (SVE), incluindo 'microvesículas' e 'exossomos ", são muito abundantes em fluidos corporais. Nos últimos anos temos assistido a um tremendo aumento no interesse em EVs. VE demonstraram desempenhar um papel importante em vários processos fisiológicos e patológicos, incluindo a coagulação, as respostas imunes e cancro. Além disso, VE têm potencial como agentes terapêuticos, por exemplo, como veículos de entrega de drogas, ou como a medicina regenerativa. Por causa de seu pequeno tamanho (50 a 1000 nm) quantificação precisa e tamanho de perfis de EVs é tecnicamente desafiador.

Este protocolo descreve como sintonizável de detecção de impulsos tecnologia resistiva (PG), utilizando o sistema de qNano, pode ser utilizado para determinar a concentração e tamanho de veículos eléctricos. O método, que se baseia na detecção de veículos eléctricos sobre a sua transferência através de um poro de tamanho nanométrico, é relativamente rápido, é suficiente a utilização de pequenos volumes de amostra e não requer a purificação e concentração de EVs. Próxima ao protocolo de funcionamento regular de uma abordagem alternativa é descrita usando amostras contendo esferas de poliestireno de tamanho e concentração conhecida. Este tempo real técnica de calibração podem ser utilizadas para superar problemas técnicos encontrados quando os VE medindo directamente em fluidos biológicos.

Introduction

As vesículas de origem celular são muito abundantes nos fluidos corporais ^1. Essas vesículas chamadas extracelulares (VE) (50 - 1000 nm em tamanho) são formados por fusão de corpos ou de multi-vesicular com a membrana celular ou por brotamento directo no exterior da membrana celular. Nos últimos anos, o interesse científico em EVs aumentou consideravelmente, resultando em uma infinidade de publicações com foco no EV, em que novas funções e características de EVs são descritos ^1. VE estão agora acreditava estar envolvido numa grande variedade de processos fisiológicos e patológicos tais como a transdução de sinal, regulação imune, e a coagulação do sangue ^1-4. No cancro, VE parecem desempenhar um papel na formação de nichos premetastatic ^5,6, transferência de conteúdo pró-canceroso ^7,8 e estimulação da angiogénese ^8. Além disso, VE são explorados como agentes de entrega de agentes terapêuticos ^9.

Apesar destes developments, quantificação confiável de EVs continua sendo um desafio. Tradicionalmente, são utilizados métodos de quantificação indiretos, que contam com a quantificação do teor de proteína total ou proteínas específicas. Embora amplamente utilizado, estas técnicas não são responsáveis ​​por diferenças proteína-per-EV, e não discriminam entre contaminando agregados proteicos e proteínas em EVs. Além disso, essas técnicas requerem isolamento de veículos eléctricos, que em muitos casos torna a comparação das concentrações de VE em amostras biológicas impossível.

Portanto, os esforços são empreendidos para desenvolver novos métodos que permitem a medição EV mais precisa e direta ^10. Este relatório descreve o uso de sensoriamento pulso ajustável resistiva (TRP) para a quantificação confiável e tamanho de perfis de EVs.

Actualmente, o qNano instrumento (Figura 1a) é a plataforma única disponível comercialmente para PG. Em TRP, uma membrana elástica não-condutor pontuado with um poro de tamanho nano está separando duas células do líquido. Uma das células do fluido é enchido com a amostra de interesse, enquanto que a outra célula é preenchido com electrólito livre de partículas. Através da aplicação de uma tensão, uma / fluxo de corrente eléctrica é estabelecida iónico, que é alterado no momento da transferência das partículas através do poro (Figura 1b). A magnitude deste bloqueio actual ('pulso resistiva') é proporcional ao volume da partícula ¹¹ (Figura 1c). A duração do bloqueio pode ser utilizada para avaliar o potencial zeta das partículas, que se baseia em características das partículas, tais como a carga ou a forma ^12. Tamanho das partículas de perfis desconhecidos pode ser realizada por comparação dos impulsos resistivos causadas pelas partículas desconhecidas, com os impulsos de resistivos causadas por partículas de calibração com um diâmetro conhecido. Além da magnitude de um evento de bloqueio, a taxa de que estes ocorrem é medido. Esta taxa contagem relies relativas a concentração de partículas. Uma vez que a concentração e taxa de bloqueios são linearmente proporcional ^13, usando uma única amostra de calibração com partículas de concentração conhecida e tamanho de partícula permite a medição da concentração de ¹⁴ e ^{11 de} distribuição de tamanho de uma amostra desconhecida.

O movimento das partículas através do nanoporo é determinado por electro kinetic- forças electroforéticas (e electro-osmótico) e fluidos ^15. Ao utilizar o módulo de pressão variável (VPM) de uma diferença de pressão entre as células do líquido pode ser induzida como uma força adicional. Aplicando pressão positiva aumenta a taxa de fluxo de partículas, o que pode ser benéfico quando a concentração das partículas é baixa. Além disso, a pressão pode ser aplicada para reduzir o efeito das forças de electro-cinético. Isto é especialmente importante quando se utiliza nanoporos com diâmetro pequeno em relação poro (NP100, NP150 e NP200 possivelmente) utilizado com freqüência para a detecção de EVs.Para esses nanoporos, mesmo quando se aplica uma pressão significativa, as forças eletro-cinética pode, dependendo da carga da superfície da partícula, permanecem nonnegligible ^16. Através da medição da taxa de partículas em várias pressões, uma electro-cinético corrigido, e, portanto, mais precisos, a concentração EV pode ser calculado.

Aqui, os protocolos detalhados são fornecidos para determinar a distribuição do tamanho e concentração de veículos eléctricos. Junto ao protocolo de funcionamento regular, uma abordagem alternativa é descrito onde as amostras são incrementadas com esferas de poliestireno de tamanho e concentração de ¹⁷ conhecido. Esta técnica de calibração em tempo real pode ser utilizado para ultrapassar alguns dos problemas técnicos encontrados quando se mede os VE directamente em fluidos biológicos, tais como urina, plasma e sobrenadante de cultura celular, ou quando a estabilidade do nanoporo durante um longo período de tempo de medição não pode ser assegurada.

Protocol

1 Protocolo Padrão Operacional

1.1 Configuração do instrumento e Preparação de Amostras

1. Conecte o instrumento a um computador com o software Izon Control Suite instalado.
2. Escolha o tamanho nanoporos de usar: para o tamanho e concentração de medição de EVs um NP150 (alvo da escala de tamanho 85-300 nm) ou NP200 (alvo da escala de tamanho 100-400 nm) são os mais utilizados. Quando se trabalha com veículos eléctricos que foram isolados utilizando um protocolo que envolve a remoção de VE de maiores dimensões, por exemplo, por passar a amostra através de um filtro de 220 nm, uma poro NP100 (gama alvo de tamanho 70-200 nm) pode ser utilizado. Ao trabalhar com EVs em uma amostra biológica ou EVs isolados usando um protocolo diferente, o NP200 pode ser usado, como ele vai ficar entupidos com menos frequência. Outras, tais como a nanoporos NP300 (gama de tamanhos alvo 150-600 nm) ou o NP400 (gama de tamanhos alvo 200-800 nm), ou nanoporos ainda maiores, pode ser utilizada para tipos maiores de VE.
3. Escolha o calibr poliestirenopartículas ation que complementam o nanopore selecionado no passo 1.1.2. Para uma NP100, NP150 e NP200 nanoporo usar o CPC100, partículas e CP100 CPC200, respectivamente. Para estimar o tamanho exato, garantir que as partículas de calibração têm um tamanho semelhante ao das partículas desconhecidas.
4. Para assegurar a homogeneidade das partículas de calibração, brevemente vortex (30 seg). Opcionalmente, aplicar ultra-sons para remover agregados.
5. Dilui-se as partículas de calibração em PBS para a concentração desejada num volume de pelo menos 40 ul. Nota: A concentração alvo varia de acordo com o nanopore selecionado no passo 1.1.2. Concentrações alvo são fornecidos com os nanoporos.
6. Aplicar e remover diretamente 78 mL de PBS na célula fluido inferior; esta molhagem da célula de fluido inferior reduz o risco de formação de bolhas de ar sob a nanoporo ao aplicar um electrólito para a célula, quando o fluido inferior nanoporo está em posição.
7. Coloque a nanoporo para os quatro braços do aparelho. Usepaquímetro para medir a distância entre dois braços opostos e introduzir a distância em mm para o "Stretch" campo de entrada e clique em "calibrar trecho" para calibrar o trecho nanoporos.
8. Estique os nanoporos a 47 mm, rodando a roda lateral e, assim, aumentando a distância entre os braços opostos do aparelho, antes de repetir 78 ul de PBS para a célula de fluido inferior.
   Nota: Interferência elétrica pode influenciar substancialmente a qualidade das medições. Ao usar um laptop para executar o software Izon Control Suite, certifique-se de que o laptop é conectado à rede elétrica usando uma tomada aterrada e plugue. Os telefones móveis mantido perto do instrumento também pode ser uma fonte de interferência eléctrica. Interferência elétrica é observado como picos constantemente utilizadas na atual linha de base, muitas vezes com raiz quadrada (RMS) Ruído> 10 pA dizer.
   Nota: Quase todo o buffer pode ser usado para diluir partículas de calibração e EVs para TRPS caracterização. A presença de sais é um pré-requisito para o estabelecimento de uma corrente elétrica. Para as medições de VE usar como um tampão PBS. Partículas de calibração devem sempre ser diluído no mesmo tampão como os veículos eléctricos para assegurar medições precisas.

1.2. Determinar as configurações ideais para a medição

Nota: Antes da gravação, é importante para estabelecer as configurações de medição ideais. A magnitude do bloqueio causado por uma partícula que passa através da nano-poros é dependente da extensão aplicada e da tensão aplicada. Para medições fiáveis ​​o ruído RMS deve ser <10 pA eo bloqueio magnitude modo deve ser> 0,1 nA.

1. Colocar a célula de fluido superior e gaiola de blindagem no nanoporo e introduzir 40 ul de partículas de calibração diluídos na célula de fluido superior. Use VPM aplicar ≥0.8 pressão positiva kPa.
2. Reduzir o trecho aplicada lentamente para 44 milímetros, enquanto a análise dos eventos de bloqueio causados ​​pela calibraçãopartículas. Nota: Quando se reduz o diâmetro dos poros o movimento das partículas através do nanoporo será menos provável e, assim, a taxa de partículas vai diminuir. No entanto, devido ao aumento do bloqueio relativo da poro de bloqueio maior evento ocorra resultando numa melhor relação sinal-para-ruído. Aumentando a tensão pode aumentar ainda mais a magnitude do bloqueio, mas também pode aumentar o ruído RMS.
3. Reduzir o trecho até eventos de bloqueio apropriadas (Figura 1C) são observadas no painel "Signal Trace". (Modo de> 0,1 nA) e a taxa correspondente de partícula> 100 / min. Nota: A taxa de partículas é um menos rigoroso de corte, no entanto, como medidas de pelo menos 500 partículas são ideais, as taxas de partículas de <100 / min fará gravação durações de pelo menos 5 min. Partículas maiores do que as taxas de 2,000 / min, pode resultar em menos medições precisas (no caso presente, a diluição da amostra deve ser realizada).

1.3 Medição de calibraçãoPartículas, Lavagem do celular Fluid Uper e medição da amostra

1. Nesta secção VE do sobrenadante da cultura celular da linha celular de glioblastoma multiforme U87-MG / EGFRvIII são caracterizados. O isolamento e a preparação desses veículos eléctricos tenha sido previamente descrito e visualizado ^18.
2. Coloque as partículas de calibração da célula de fluido superior. Aplique uma pressão (por exemplo, 0,8 kPa) usando o VPM e gravar> 500 partículas.
3. Se a execução de uma medição de pressão de múltiplos, aumentam a pressão aplicada (por exemplo, para 1,0 kPa) e gravar um segundo ficheiro de calibração. Nota: Um mínimo de 0,2 kPa diferença é necessária.
4. Retirar a amostra de calibração a partir da célula de fluido superior. Lava-se a célula de fluido superior 3 vezes com 100 ul de PBS para remover partículas residuais. Antes de introdução da amostra na célula de fluido superior, utilize tecido que não solte fiapos para remover qualquer PBS residual da célula fluido superior.
5. Introduzir a amostra de fluido para a célula superior. Certifique-se a corrente da linha de base é a menos de 3% da corrente da linha de base observada na medição das partículas de calibração. Se não menos de 3%, aplicam-se a estratégia descrita abaixo para estabilizar a corrente de linha de base. Aplicar as pressões exatas como aplicado às partículas de calibração e gravar os arquivos de exemplo.
   Nota: A taxa de trama de partículas deve apresentar detecção de partículas constante (Figura 2a). Em caso de interrupção repentina de detecção de partículas, uma queda súbita da corrente de linha de base, ou um aumento repentino na RMS de ruído, os poros podem ser obstruídos; assim, interromper a gravação. No fim de restabelecer a linha de base, da torneira ou torcer a tampa de protecção, aplicar o êmbolo, ou remover completamente os nanoporos e lavá-lo com água desionizada e substituí-la sobre o instrumento.
   Observação: Como alternativa, aumentar o alongamento nanoporo a 47 mm, combinada com a pressão máxima do VPM durante aproximadamente 5 min.

Análise de Dados 1.4

1. Clique no botão "; Guia Analisar dados "para entrar na seção de análise do software. Processo de calibração e arquivos de exemplo clicando com o botão direito no "Arquivos do processo" "Arquivos não processados" e selecione.
2. Clique na caixa ao lado da amostra na coluna "calibrado" para acoplar os arquivos de exemplo para as gravações de calibração. Selecione os arquivos de amostra e calibração correspondentes e clique em "OK". Observação: ao usar a opção de calibração multi-pressão, selecione a guia "Calibração Multi-pressão" sobre a esquerda para alguns vários exemplos para vários arquivos de calibração.
3. Uma vez acoplado com sucesso, o software de controlo Izon Suite irá apresentar diferentes características de amostras, tais como uma distribuição de tamanho (Figura 2b), a duração da linha de base, metade do valor máximo de largura total (FWHM) e uma análise de concentração. Opcionalmente: Para cada amostra, os pontos de dados individuais podem ser exportados como um arquivo separado por vírgulas.

2.lternative Protocol - Spiking amostras com calibração Beads

Nota: Em geral, o procedimento operacional padrão pode ser utilizado quando se trabalha com EVs isoladas. Ao trabalhar com EVs não-isolados em amostras biológicas, ou preparações EV isoladas contaminados com grandes agregados de proteínas, a operação do aparelho pode ser um desafio. Estes desafios consistem principalmente de uma alta taxa de bloqueio de nanoporos (queda súbita da corrente de linha de base), impossibilidade de recuperar as correntes de linha de base dentro de 3% da medição de calibração ou diferenças significativas nas taxas de partículas entre amostras idênticas (Figura 3A). Para as amostras que apresentam estas dificuldades um protocolo alternativo para quantificar EVs foi desenvolvido ^17. Esta metodologia baseia-se na introdução de grandes contas de calibração de poliestireno para a amostra de interesse (Figura 3b). Um procedimento pormenorizado para este protocolo alternativo é discutido abaixo.

2.1. AmostraPreparação

Nota: Quando a preparação de amostras utilizando o método alternativo, é desejado que a estabelecer uma relação de VE-a-gota de cerca de 1 Além disso, é essencial incluir uma "pérola de calibragem só" amostra, para permitir "gating" exactas do Esferas de calibração e determinar o número de partículas de fundo (para agregados de proteína exemplo) presentes no buffer.

1. Centrifugar 100 ul de sobrenadante de cultura celular durante 7 minutos a 300 xg
2. Adicionam-se 20 ul do sobrenadante a 20 ul de PBS e 10 uL de 75 vezes diluído 335 nm esferas de poliestireno (estoque 7e10 / ml).

2.2. Medição Amostra

1. Use a estratégia descrita na seção 1.2 para determinar as configurações de instrumentos ideais.
2. Meça o 'talão de calibração apenas "amostra em primeiro lugar. Assegure-se que a detecção de pequenas partículas de não-fundo do grânulo é a mais baixa possível (<10% dos grânulos).
3. Meça cada indivíduo sample uma vez antes que a gravação se replica de modo a distribuir em condições de flutuação nanopore igualmente sobre as diferentes amostras. Medir pelo menos 3 repetições de cada amostra.
4. Meça novamente o "talão de calibração apenas" amostra depois de terminar a gravação de todas as amostras.

2.3. Análise de Dados

Nota: Ao utilizar o protocolo alternativo, de uso exclusivo do software Izon Control Suite não é suficiente para o cálculo de concentração. Software de folha de cálculo adicional é necessária. Quadro 1 indica um exemplo do cálculo da concentração de amostras descritas na Figura 3.

1. Abra o "talão de calibração apenas" amostra e um ou mais arquivos de exemplo.
2. Determine quais bloqueio evento tamanho (em nA) pode ser usado como um ponto de corte para a distinção entre EVs e esferas de poliestireno. Determinar o valor de bloqueio (nA), que corresponde à base esquerda da população esferas de poliestireno ( Figura 3b). Nota: garantir a igualdade de configuração da caixa-tamanhos de todas as medições (pode ser ajustado em 'ViewSettings' que é acessado clicando no botão "pop-up" abaixo "Traço Blockade Individual").
3. Recuperar os valores da contagem total de partículas para cada amostra clicando na aba "Análise de Partículas Resumo" da amostra.
4. Filtre os conjuntos de dados que utilizam o nível de corte determinado no passo 2.3.2. selecionando a opção "Filtragem de dados" pop-up. Mostrar só partículas menores que o cut-off.
5. Recuperar os valores da contagem de VE para cada amostra a partir da "Análise de Partículas Resumo".
6. Subtrair o valor de VE de partículas totais para determinar a quantidade de grânulos de calibragem.
7. Determinar a relação VE-a-bead, dividindo pela contagem VE contagem dos grânulos de calibração.
8. Determinar a relação média de fundo pela média das proporções determinadas para cada um e# 8220; talão apenas "amostra de calibração. Subtrair este valor de cada amostra individual.
9. Multiplicar o valor ajustado da VE-a-pérola por a concentração de esferas de calibração para determinar a concentração de VE para cada amostra.
10. Multiplicar a concentração encontrada no passo 2.3.9 pelo factor de diluição VE introduzido pela adição de grânulos de calibração para a amostra de VE. Nota: No exemplo de configuração de exemplo, a diluição total de amostra em PBS e grânulos de calibragem é de 2,5 vezes e, portanto, a concentração encontrada no passo 2.3.9 deve ser multiplicado por 2,5 para determinar a concentração da amostra em bruto VE.
11. Calcular as estatísticas, como as médias, desvio padrão e erro padrão da média para cada grupo de repetições.
    Nota: em alguns casos, se sobrepõem entre EVs e esferas de poliestireno perfurantes é observado. Se for necessária uma correção para a subestimação da concentração EV, amostras sem esferas de poliestireno perfurantes também devem ser medidos. Use o mesmo cutfora, conforme determinado no passo 2.3.2 para determinar uma relação de "pérola-a-VE", para calcular a proporção de veículos eléctricos que se encontram no intervalo de contas de poliestireno perfurantes. Esta relação de talão para VE deve ser adicionado à razão de VE-a-bead determinada no passo 2.3.8.

2.4. Opcional: EV Distribuição do Tamanho de utilizar o método alternativo.

1. Abra uma gravação da amostra duas vezes na Suite Software de controle.
2. Defina as opções de filtro de uma das amostras para apenas partículas display maior do que o ponto de corte acima determinado. Isto irá exibir apenas as partículas de calibração.
3. Definir a amostra filtrada para "arquivo de calibragem" e digite o tamanho das esferas modo de calibração.
4. Casal do arquivo de amostra eo "arquivo de calibragem" criado no passo 2.4.3 conforme descrito em 1.4.2. O arquivo de amostra irá agora mostrar uma distribuição de tamanho de ambos os EVs e contas de calibração com base nas contas de calibração perfurantes.
   Nota: A ópera padrãoprotocolo ting na maioria das vezes suficiente para a determinação do tamanho-distribuição de EVs. Por vezes, no entanto, os componentes do tampão exactas não são conhecidas (por exemplo, no plasma ou urina), o que torna impossível preparar uma amostra de grânulos de calibração no mesmo tampão como os veículos eléctricos de interesse. Uma amostra enriquecida com partículas de VE de calibração pode ser usado para a VE-estimativa tamanho nestas condições específicas.

Results

Para utilizar o instrumento PG, um nanoporo não condutor tem de ser colocado nas quatro braços da máquina (Figura 1-A) e uma voltagem (Figura 1b) tem de ser aplicado. Uma vez que uma corrente eléctrica da linha de base é estabelecida, pulsos resistivos causadas por partículas que passam através dos poros vai ser detectado, tal como ilustrado na Figura 1c.

VE foram purificados a partir do sobrenadante de cultura de células da linha de células de glioblastoma U87-MG / EGFRvIII por ultracentrifugação. Uma partícula de taxa de trama estável é observado quando se mede os veículos eléctricos isolados (Figura 2a) em um nanoporo NP100. Esta partícula de taxa de trama estável é necessário para uma medição da concentração do VE fiável. Após o emparelhamento da gravação VE-amostra para uma gravação de 115 nm de calibração de poliestireno, esferas de uma distribuição de tamanho (Figura 2b) e estimar a concentração do VE-amostra pode ser obtida (dados não mostrados).

(Figrue 3a). Isso resulta em estimativas de concentração EV imprecisas. Ao cravar a amostra com esferas de poliestireno de tamanho e concentração conhecida, uma relação VE-a-esferas pode ser determinada. Figura 3b ilustra os resultados obtidos após a cultura sobrenadante de células com esferas de poliestireno de cravação de 335 nm de tamanho. Duas populações claras são observados. As partículas que induzem um bloqueio de menos de 0,46 nA são determinados EVs, as partículas maiores são determinadas esferas de poliestireno. A proporção de VE para esferas de poliestireno é usado para calcular a concentração de matéria-VE (Tabela 1). Figura 3c ilustra o cálculo do tamanho das duas populações com base nos grânulos de poliestireno perfurantes. A re configuração nanoporos usadoconsultados na detecção de VE> 140 nm em tamanho. Este pode ser reduzido através da redução da abertura nanoporo, no entanto, isto irá também resultar em mais eventos de entupimento.

Figura 1: qNano instrumento e modo de funcionamento. (A) Fotografias do instrumento. Um nanoporo é posicionado no aparelho, a separação de uma célula de fluido inferior de uma célula de fluido superior. As células do líquido são protegidos de interferências elétricas ambiental pela tampa de proteção. (B) Ilustração delineando ajustável sensor de pulso resistiva (TRP). A nanoporos elástico não-condutor é separar duas células do líquido. Através da aplicação de uma tensão de uma corrente eléctrica é estabelecida através da poro furado no nanoporo. Como vesículas extracelulares mover através do nanoporo, o fluxo iónico é alterada e detectada como um pulso resistiva. Em TRP o tamanho da abertura pode ser nanoporo sintonizado (redução ou aumento), alongando a nanoporo, aumentando a distância entre os braços opostos do instrumento, ou reduzir esta distância. (C) Exemplo ilustrativo de pulsos resistivos. A magnitude de um único pulso resistiva é proporcional ao volume da partícula:. Pulsos maiores indicam partículas maiores por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Particle contar-enredo e tamanho distribuição obtida a partir da medição EVs isoladas de U87-MG / EGFRvIII sobrenadante de cultura de células (A) Particle contar-plot indicando detecção geral de partículas constante.. Breve redução de particObservou-se detecção le entre 80 e 100 segundos de gravação. Após interromper a gravação e batendo na tampa de proteção, a taxa estabilizou depois de partículas que a gravação foi retomada. (B) A distribuição de tamanho de EVs isoladas é traçado depois de calibrar a amostra desconhecida (EVs) a 115 nm esferas de calibração de poliestireno. (5 nm tamanho bin). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: TRPS quantificação de EVs em cultura celular sobrenadante utilizando o protocolo alternativo. (A) tramas de taxa de partículas típicos, obtidos durante a medição VE directamente num fluido biológico. Entupimento dos poros provoca breves interrupções e flutuações na taxa de detecção de partículas. Cadatrama representa uma medição repetição da mesma amostra. gráficos (B) três réplicas de distribuição de tamanho das células obtidas após a cultura sobrenadante picos com 335 nm grânulos de calibração de poliestireno. Todas as partículas que induzem um pulso resistiva de menos de 0,46 nA são seleccionados como VE. (C) As esferas de poliestireno cravado podem ser utilizados para se obter um tamanho de distribuição da amostra. (5 nm tamanho bin). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Medição	Só Calibração # 1	Só Calibração # 2	Sobrenadante # 1	Sobrenadante # 2	Sobrenadante # 3
Corrente média (NA)	117	120	116	118	120
Taxa de Partículas	172	194	250	246	196
corte utilizado (NA)	0,46	0,46	0,46	0,46	0,46
Total de partículas	303	317	489	488	454
Vesículas extracelulares	3	1	213	215	213
Grânulos de calibragem cravado	300	316	276	273	241
EVs / contas de calibração	0,01	0.003	0,772	0,788	0.884
Amostra - fundo			0.765	0,781	0,877
Vesículas extracelular (10 7) / Ml			7.14	7,29	8.18
Amostra 2.5x diluído
EVs concentração Raw (10) 7 / ml			17.85	18.22	20.46

Tabela 1:. Cálculo Exemplo de concentração EV usando o protocolo alternativo Um valor de cut-off é determinado para distinguir os VE de grânulos de calibragem. Posteriormente, o número total de veículos eléctricos e os grânulos podem ser recuperados. Para cada medição do rácio de VE-a-pérola é calculada. A quantidade de partículas de base do electrólito (por exemplo, os agregados de proteína) é calculada a média da razão de VE-a-pérola para as medições individuais da 'apenas grânulos de calibragem de' amostra. Para cada amostra, o rácio de fundo é subtraído a partir do índice obtido. Este adjusterelação d é multiplicado pela concentração dos grânulos de calibração para a amostra (neste exemplo: 9.33e7 / ml). Para determinar a concentração de matéria-VE, a concentração obtida é multiplicada pelo factor de diluição total VE (neste exemplo: 2,5).

Discussion

Os protocolos descritos neste metodologias oferta manuscrito para quantificação e caracterização do tamanho de EVs usando TRP. As principais vantagens da plataforma TRP são o pequeno tamanho da amostra, duração da medição relativamente curto ea ausência de manipulação de amostra necessário.

Pré-requisito para a medição TRPS preciso é manter condições idênticas entre calibração e amostras de medições. Isso engloba o uso de tampões idênticos, bem como as configurações do instrumento idênticas, tais como tamanho nanoporos, tensão e pressão aplicada. O VPM inicial carece de um mecanismo de ajuste exacto da pressão aplicada, fazendo assim com que pequenas diferenças na pressão aplicada entre as amostras. Além disso, a evaporação do fluido de escorvamento no VPM pode induzir pequenas diferenças de pressão quando a medição em diferentes pontos de tempo e, por conseguinte, o VPM deve frequentemente ser re-condicionadas. Estas limitações foram potencialmente resolvidos pela introdução do VPM2, quetem um aumento de escala baseado clique, e baseia-se pressão de ar.

O protocolo alternativo descrito neste artigo é particularmente adequado para a medição de VE em amostras biológicas não purificadas ^17. Acreditamos que os componentes do tampão, tais como, açúcares, lípidos, proteínas e outros detritos maiores, pode, em alguns casos, influenciar as condições de medição demais para o protocolo padrão a ser aplicável. A adição de contas de calibração para a amostra em vez de comparar duas medidas separadas introduz 'calibração em tempo real ". Este método é especialmente adequado quando se comparam as amostras (por exemplo, plasma de sangue de dadores diferentes que têm diferentes) e / ou desconhecidos conteúdo fundo fluídicos. Embora existam diferenças entre os EVs e partículas de poliestireno (por exemplo, densidade de partículas e de carga superficial), modelos teóricos, bem como dados experimentais ressaltam a usabilidade de esferas de poliestireno para a quantificação eo tamanho de perfis de EVs,sob a condição de que a pressão é aplicada significativa ^15,19. Para minimizar a influência de forças eletrocinéticos, o uso do relativamente maior NP150 / NP200 nanoporos e pressão positiva significativa é aconselhável.

EVs e contas de calibração são distinguidos pelo tamanho. Por conseguinte, o nanoporo tem de ser aberto por aplicação de estiramento, para um diâmetro, onde é observada a detecção de ambos os veículos eléctricos e as partículas maiores de calibração. Uma vez que a abertura do poro irá diminuir a sensibilidade em relação a partículas mais pequenas, só EVS maior do que um certo tamanho está gravado (geralmente VE> 120 nm, quando se utiliza um cordão de calibração 335 nm). O limite mínimo de detecção de veículos eléctricos pode ser reduzida para cerca de 90 nm, utilizando 203 nm em grânulos de calibragem de um nanoporo NP150. No entanto, essa configuração pode ser inviável quando EVs maiores induzir obstrução freqüente do nanopore. A presença destes VE obstruindo pode obrigar à utilização de uma configuração em que uma população de VE, demasiado pequena para reach o limiar de detecção, e não será detectado.

A dificuldade de operar o sistema aumenta quando se tenta medir partículas menores do que 100 nm em tamanho. Em tais casos, a detecção pode ser melhorada aumentando a concentração de sal de electrólito. Um aumento da concentração de iões irão induzir o aumento relativamente grandezas bloqueio de partículas pequenas (maior relação sinal-ruído). A viabilidade desta técnica para medições de EVs tem de ser validado, porém, como concentrações elevadas de sal pode influenciar o volume de EVs.

Em conclusão, a plataforma de PG pode ser utilizado para a quantificação directa e caracterização do tamanho do VE. Uma vez que não é necessário qualquer isolamento ou manipulação VE (anticorpo rotulagem de ligação ou fluorescente), a plataforma é adequado para a quantificação directa VE em fluidos biológicos. Um protocolo alternativo está previsto que pode ser benéfico para as amostras em que os componentes do tampão induzir cloggin poro significativaeventos g, tornando a utilização segura do protocolo padrão inviável.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
qNano instrument	Izon Science Ltd.	N/A
Módulo de pressão variável	Izon Science Ltd.	N/A
Nanopore	Izon Science Ltd.	NP100, NP200	A escolha do nanoporo varia de acordo com a partícula alvo. Diferentes nanoporos estão disponíveis para diferentes tamanhos de alvo.
Calibração de Partículas	Izon Science Ltd.	CPC100, CPC200, CPC400	estão disponíveis em diferentes tamanhos.
Banho de sonicação	Múltiplo disponível		O banho básico de sonicação é suficiente
(Mini) vórtice	Vários disponíveis
Tecidos sem elevação	Múltiplos disponíveis
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Vários disponíveis
Computador
em Windows Izon Control Suite 2.2	Ciência Izon Ltda.	N/A
Software de planilha	Múltiplos disponíveis	N/A