Artigo de método
Descrito aqui é um procedimento para a obtenção de longos trechos de gravação atual de um canal iônico com a técnica de patch-clamp anexado à célula. Este método permite observar, em tempo real, o padrão de open-close conformações dos canais que estão na base do sinal biológico. Estes dados informar sobre as propriedades dos canais nas membranas biológicas não perturbadas.
Proteínas de canais iônicos são dispositivos universais para comunicação rápida através das membranas biológicas. A assinatura temporal do fluxo iónico geram depende das propriedades intrínsecas de cada proteína de canal, bem como o mecanismo pelo qual é gerada e controlada e representa uma importante área de pesquisa actual. Informações sobre a dinâmica de funcionamento de proteínas de canais iónicos pode ser obtida observando longas extensões de corrente produzidos por uma única molécula. Descrito aqui é um protocolo para a obtenção de ligado de células de patch-clamp gravações actuais um canal para um canal de iões fechado ligando, o receptor de NMDA, expresso de forma heteróloga em células HEK293 ou nativamente em neurónios corticais. Também são fornecidos instruções sobre como adaptar o método para outros canais de íons de interesse, apresentando o exemplo do canal Piezo1 sensível ao mecano. Este método pode fornecer dados sobre as propriedades de condutância do canal ea seqüência temporal de opeconformações n fechados que compõem mecanismo de ativação do canal, ajudando a compreender as suas funções na saúde e na doença.
Comunicação rápida através das membranas biológicas depende quase que exclusivamente em proteínas de membrana oligoméricas poros formando, comumente referido como canais. Estas proteínas são muito diferentes em sinais de ativação, mecanismos de propagação e as propriedades de condutância. Proteínas canal cujo poros são seletivos para os íons são classificados como canais iônicos; sua ativação produz correntes iônicas através da membrana, e suas respostas podem ser gravados com alta resolução em tempo real, usando técnicas eletrofisiológicas. Os sinais de ativação abrangem uma ampla gama de insumos químicos e físicos, incluindo gradientes de concentração, forças mecân....
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1. Cultura de células e Protein Expression
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Recombinante receptores NMDA
Receptores NMDA ligar e responder à ação concomitante de dois co-agonistas: glutamato e glicina. Eles montam como heterotetrâmeros de duas subunidades glicina GluN1 e duas subunidades GluN2 ligação do glutamato de ligação. GluN2 subunidades são codificadas por quatro genes (AD) e de estas formas mais amplamente transcritos no cérebro são GluN2A no adulto e GluN2B em animais jovens. Devido à diversidade de subtipos de receptores de NMDA em prepara.......
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No campo canal iônico, uma importante área de pesquisa é dedicado à compreensão da seqüência de eventos que leva ao canal de abertura ou mecanismo de propagação do canal. Para a maioria dos canais, este processo é complexo e envolve várias etapas cinéticas, que não pode ser deduzida a partir de um sinal multicanal macroscópica. Em contraste, os experimentos podem ser projetados em observar a seqüência de eventos aberto / fechado no registro de canal único pode produzir informações mais detalhadas sobre gating mecanismos.......
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Os autores deste manuscrito declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Este trabalho foi apoiado por F31NS086765 (KAC), F31NS076235 (MAP), e R01 NS052669 (GKP) e EIA9100012. Os autores agradecem Eileen Kasperek para perícia e assistência com a biologia molecular e cultura de tecidos; e Jason Myers para a partilha de dados obtidos a partir primeiros neurônios corticais pré-frontais.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Produtos químicos | Sigma | Various | |
| Borosillicate Glass | Sutter | BF-150-86-10 | |
| Microscópio invertido de campo brilhante | Olympus | 1x51 | Nikon também possui microscópios semelhantes |
| Caixa fluroescente | X-cite | Série 120 | |
| Guia de luz líquida | X-cite | OEX-LG15 | |
| Micromanipulador | Sutter Instruments | MP-225 | |
| Osciloscópio | Tektronix | TDS1001 | |
| Amplificador | Dispositivos Moleculares | Axônio Axopatch 200B | |
| Tabela | TMC | 63561 | |
| Cartão NIDAQ | National Instruments | 776844-01 | |
| Extrator | Narishige | PC-10 | |
| Polidor | Narishige | Microforge MF-830 | |
| Faraday Cage | TMC | 8133306 | |
| Braçadeira de pressão de alta velocidade | ALA Scientific Instruments | ALA HSPC | |
| Bomba de pressão / vácuo | ALA Scientific Instruments | ALA PV-PUMP | para HSPC-1 |
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