Um método de permeabilização de Drosophila Os embriões para Ensaios de pequena molécula Atividade

O embrião Drosophila continua a ser um modelo privilegiado para investigação dos mecanismos fundamentais do desenvolvimento ^2. Este modelo poderoso é suportada por uma grande variedade de técnicas de genética molecular que permitem a manipulação de essencialmente qualquer gene em qualquer ponto de tempo e dentro de qualquer órgão em desenvolvimento. O tamanho pequeno, rápido desenvolvimento, e uma extensa caracterização da morfogênese do embrião Drosophila torná-lo um modelo de escolha para as telas genéticos, muitos dos quais descobertos vias de desenvolvimento fundamentais ^3,4. Numerosos fenótipos no embrião de Drosophila têm sido caracterizados e são facilmente interpretável, frequentemente proporcionar um meio para identificar os mecanismos genéticos moleculares subjacentes responsáveis ​​por um traço anormal.

Historicamente, uma desvantagem do modelo de embrião da mosca tem sido a dificuldade de introdução de moléculas pequenas para tecidos embrionários. Esse obstáculo tem colocado limitações: 1) nosção conhecidos pequenas moléculas bioativas como sondas para interrogar os mecanismos de desenvolvimento e 2) usando este modelo estabelecido para avaliar a atividade teratogênica ou farmacológica de moléculas pequenas descaracterizados. Como conseqüência, o potencial de triagem do embrião da mosca tem sido subutilizada em caracterização de pequena atividade molécula.

Entrega de moléculas pequenas para o embrião da mosca pode ser alcançado com dois métodos: 1) permeabilização da casca do ovo e 2) de micro-injecção. Este artigo apresenta avanços ao método de permeabilização que são fáceis de executar no ambiente de um laboratório de Drosophila convencional. Deve notar-se que os avanços recentes nos métodos de microinjecção com tecnologia de microfluidos contribui também a métodos para a introdução de compostos para o ^5,6 embrião. A introdução de moléculas para o embrião é impedida por uma camada de cera de casca do ovo ^7. A casca de ovo Drosophila é composto por cinco camadas. A partir dedentro para fora que são: a membrana vitelina, a camada de cera, a camada interior coriónica, o endochorion eo Exocório ^8. As três camadas coriônicos exteriores podem ser removidos através de uma breve emersão do embrião em diluída de lixívia, um passo designado por dechorionation. A camada de cera exposta pode ser comprometida por exposição a solventes orgânicos, tais como heptano, octano e ^7,9, o que tornou o embrião dechorionated permeável, enquanto continua a ser envolto na membrana vitelina subjacente. No entanto, o uso desses solventes apresenta complicações devido a sua toxicidade ea dificuldade em regular a sua forte ação permeabilizante, sendo que ambos têm efeitos negativos sobre a viabilidade do embrião stark ^9,10.

Um método de permeabilização usando uma composição denominada permeabilização embrião solvente (EPS) foi previamente descrito ^1. Este solvente consiste de d-limoneno e derivados de plantas surfactantes que permitem que o solvente seja misciblenviar um e com tampões aquosos. A baixa toxicidade de d-limoneno e a capacidade para diluir o solvente para as concentrações desejadas produziu um método eficaz para gerar embriões permeáveis ​​com ^uma alta viabilidade. No entanto, dois factores endógenos têm continuado a trazer limitações à aplicação. Primeiro, os embriões demonstram a heterogeneidade da permeabilidade após o tratamento EPS, mesmo quando o cuidado de manter uma estreita encenação de desenvolvimento. Em segundo lugar, os embriões mais velhos do que aproximadamente oito horas provaram difíceis de permeabilizar, de acordo com um endurecimento da casca do ovo que ocorre após a postura dos ovos, ^11.

Descrito aqui estão os avanços no método EPS que: 1) auxiliar na identificação e análise de embriões quase idêntica permeabilizadas, mesmo após a fixação e positividade passos foram executados e 2) permitir a permeabilização de embriões no final momentos de desenvolvimento (> 8 horas, o estágio 12 e mais velhos). Especificamente, a aplicação de um corante vermelho distante,Ácido carboxílico CY5, está descrito que serve como um indicador da permeabilidade, que persiste no embrião em desenvolvimento, durante e após a sua fixação formaldeído. Além disso, mostra-se que a criação de embriões a 18 ° C mantém a casca de ovo num estado sensível EPS, permitindo a permeabilização de embriões de fase tardia (etapas 12-16).

Esses avanços superar as limitações mencionadas anteriormente à metodologia EPS. Esta aplicação irá, portanto, fornecer aos investigadores um meio para introduzir pequenas moléculas de interesse para o embrião em distintos momentos de desenvolvimento, mantendo a viabilidade.

1. Preparação das Culturas Fly, soluções e dispositivos de manuseio de embriões

1. Prepara-se uma cultura de Drosophila gaiola. Coloque 500 moscas + acasalamento da tensão desejada em uma gaiola população equipado com uma placa de uva-agar 10 centímetros e uma mancha de levedura colar. Manter a cultura numa incubadora controlada de 25 ° C humidade. Nota:   Gaiola culturas requerem um ou dois dias de condicionamento para obter padrões de embriões, que consistentes. Placas de uvas com levedura pasta são mudadas uma vez pela manhã e outra à noite durante o condicionamento.
2. Prepare EPS. As soluções quentes de agentes tensioactivos (cocamida DEA e álcool etoxilado), a 37 ° C. Pipetar 18 ml de d-limoneno para um frasco de cintilação de vidro equipado com uma pequena barra de agitação. Pipete 1 mL de cada um dos dois agentes tensioactivos (5% de concentração final de cada um) para o d-limoneno. Misture bem e retire barra de agitação. NOTA: Esta solução estoque de EPS é bom para aproximadamente 2 meses à temperatura ambiente. A soluçãodeve ser aquecido a 37 ° C e agitada para solubilizar totalmente tensioactivos antes da utilização. EPS e d-limoneno deve ser armazenado num recipiente de vidro em que se dissolverá ao longo do tempo alguns plásticos.
3. Preparar a solução dechorionation embrião, médiuns de incubação, corante e soluções de drogas. Misture 25 ml de água sanitária com 25 ml de _H2O e coloque no prato raso. Prepare meio modificado básica de incubação (MBIM) e MBIM-T de acordo com a receita anterior ^1,12. Prepare Shields e Sang M3 célula meio de cultura e PBS acordo com o protocolo do fabricante (veja a lista de materiais). Preparar a solução estoque de corante permeabilização em 10 mM de concentração em DMSO.
4. Montar dispositivos de manipulação de embriões e de suprimentos:
   1. Prepare dechorionation e cesta tratamento EPS (ver Figura 1A). Corte uma seção 3 centímetros de 50 ml de polipropileno centrífuga / tubo de cultura descartável com uma serra de dentes finos. Faça a superfície nivelada soldagem por fricção da seção de tubo de lixa aderidoa uma superfície em bancada. Solda a secção do tubo de malha de nylon Nitex por fusão do rebordo da secção de tubo sobre uma chama e pressionando a malha de uma placa de vidro. Deixe esfriar e retire malha extra. NOTA: Os lados eo fundo pura permitir lavagem rápida e completa fora de lixívia residual e EPS nas respectivas etapas. Os passos de soldagem deve ser realizada sob uma coifa.
   2. Prepare uma cesta de desenvolvimento. Cortar parte de cima de uma centrífuga de 50 ml / tubo de cultura nivelada com a borda da tampa. Remover e modificar a tampa cortando uma abertura central e entalhes ao longo da borda, como mostrado na Figura 1B. Aperte a tampa sobre a malha e nos tópicos da seção de tubo de cortar e aparar malha extra. NOTA: O tampão contém entalhes na borda que permita ao meio de difusão em massa, quando posicionada no reservatório 60 milímetros prato (Figura 1B).
   3. Prepare componentes de uma câmara de slide. Corte um quadrado de membrana DO que é maior do quea abertura da câmara slide. Aplicar uma camada muito fina de graxa de vácuo para o bordo interior da abertura. Cole a membrana DO na abertura de vedação contra a graxa com o anel de retenção. Apare o excesso de membrana DO cortando-o de volta perto do anel de retenção. NOTA:. Especificações para a câmara de slides podem ser encontrados em Kiehart et al ¹³ Esta câmara não está disponível comercialmente e requer fabricação personalizada por uma oficina mecânica.

2. Staging, Dechorionation e EPS Tratamento de embriões

1. Encenação embriões por coleta cronometrado. Definir uma placa de uva fresca / fermento para a cultura gaiola mosca na AM. Permitir que os embriões para ser colocado durante 1 hora a 25 ° C. Descarte este prato e substituir por uma placa de uva fresca / fermento para uma colocação embrião posterior de 2 horas a 25 ° C. Recolha este prato e coloque em 18 ° C incubadora para posterior preparo de desenvolvimento. NOTA: 1 h de desenvolvimento a 25 ° C é igual a 2 horas de desenvolvimentoa 18 ° C. O efeito de envelhecimento a 18 ° C versus 25 ° C mantendo em EPS permeabilização em embriões de fase tardia pode ser visto na Figura 2.
2. Dechorionation. Delicadamente, lave embriões fora do prato uva na cesta de malha utilizando 25 ° C a água da torneira e um pincel. Lavar o excesso de levedura longe dos embriões na cesta sob um fluxo suave de água da torneira. Mergulhe a cesta em 50% de lixívia por 2 min. Lave embriões completamente sob uma corrente de água da torneira. NOTA: Com cuidado, esguichar solução de água sanitária em embriões de forma intermitente, utilizando uma pipeta de plástico. Enquanto 2 min é geralmente suficiente para dechorionation completa, este tempo de incubação deve ser verificado pelo exame direto e ajustados em conformidade. Manter embriões dechorionated no cesto imerso em água corrente e proceder imediatamente ao passo EPS.
3. Tratamento EPS
   1. Prepare seis pratos com 60 milímetros aproximadamente 10 ml de PBS em cada. Prepare diluição EPS dissolvendo 75 EPS ul em 2.925 ml MBIM (01:40) num copo de vidro de 50 ml com agitação. Nota: Forma-se uma emulsão branca dessa mistura.
   2. Drenar o excesso de água a partir do fundo do cesto de rede com um laboratório de limpar. Imergir carrinho em EPS diluídas em copo e imediatamente rodam para dispersar os embriões na solução EPS no fundo do cesto. Continue girando o movimento por 30 segundos. NOTA: diluições EPS e tempos de exposição pode variar para controlar a permeabilidade. Recomenda-se que as diluições de EPS óptimas e tempos de tratamento ser estabelecida empiricamente com as estirpes de moscas serem utilizados. O aumento do tempo de exposição a 60-90 seg é favorável para a fase 12 e os embriões mais velhos.
   3. Remover cesta, apagar longe EPS excesso com um laboratório de limpar. Continuar com seis lavagens sequenciais em 10 ml de PBS nos pratos de 60 mm. Usar uma pipeta de plástico para esguichar suavemente embriões com PBS em cada um dos seis lavagens. Prossiga para tingir e etapas de tratamento de drogas. Nota: EPS pode ser descartado na pia.

3. Dye and Drug Treatment permeabilizadas de Embriões

1. Tratamento Dye
   1. Adicionar 5 mL de 10 mM de CY5 corante ácido carboxílico * com 1 ml de MBIM-T (50 uM de concentração final) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e vortex para misturar. NOTA: * Escolha de corante depende da análise a jusante. Ácido carboxílico CY5 é eficaz para análises posteriores utilizando fixação e imunomarcação. Rodamina B é útil para a análise de embriões vivos. A emissão vermelho de Rodamina B, ea emissão verde de seus metabólitos ^1, pode apresentar algumas complicações com aplicações a jusante usando fluorescência. Drogas ou toxina pode ser adicionado à solução de corante para iniciar o tratamento, neste fase, ou para limitar o tratamento de droga / toxina a um impulso nesta fase. Cuidados devem ser tomados ao manusear e descartar de drogas e toxinas de acordo com a Ficha de Segurança e normas de segurança ambiental.
   2. Transferir embriões a partir do cesto de rede para a solução de corante utilizando um pincel. Tapar o tubo e inverter várias vezes para assegurar aembriões flutuar livremente em suspensão na solução de corante. Colocar o tubo em um balancim de nutação durante 15 minutos à temperatura ambiente.
   3. Retire o tubo do nutator e deixe embriões resolver. Remover solução de corante com uma pipeta fina e substituir com 1 ml de MBIM-T para lavar. Inverta tubo para re-suspender embriões completamente. Vamos resolver embriões e repita com mais três lavagens MBIM-T. Remova todo MBIM-T de enxaguamento final e proceder à etapa de incubação.
2. A incubação para o desenvolvimento do embrião
   1. Transferência de embriões para uma das duas câmaras: A cesta de desenvolvimento ou a câmara de slide. NOTA: A cesta de desenvolvimento é o preferido para períodos de desenvolvimento mais longos, e é necessário se de fixação e de positividade passos seguintes devem ser executados. A câmara de slide é ideal para resolução maior lapso de tempo de imagem e é mais eficaz para períodos curtos de desenvolvimento (por exemplo, os eventos embrionárias precoces). Drogas ou toxina pode ser adicionado ao meio em várias concentrações e embrião desenvolvimento pode ser monitorado em tempo real com embriões vivos ou em um ponto de extremidade usando fixação padrão e imunomarcação protocolos.
   2. Desenvolvimento em Cestas
      1. Limpe uma cesta de desenvolvimento por esguichando com etanol 70%, lavar abundantemente com água deionizada e secar com laboratório de limpar. Prepare a 6 ml de meio de incubação com a concentração desejada de droga ou toxina. Coloque o cesto desenvolvimento em meio a 60 milímetros tomada prato cuidado para não prender as bolhas de ar sob a base de malha. NOTA: Dois mídia são comumente usados: sozinho MBIM ou MBIM/M3 em uma mistura de 50:50, sendo este último mais eficaz para os períodos de desenvolvimento mais longos.
      2. Transferência de embriões permeabilizadas a malha de superfície na base da cesta com um pincel. Gentilmente esguichar os embriões com a mídia do reservatório circundante. Dispersar os embriões com o pincel de modo a que eles estão dentro de uma monocamada na malha. Nota: Vá para a imagem de microscopia e avaliar as características permeabilização ea viabilidade do preparation (veja o passo 4).
   3. Desenvolvimento na Câmara de slides
      1. Inverta câmara de corrediça e aplicar uma pequena gota de graxa vácuo sobre o perímetro da abertura. Colocar 150 mL de meio com a quantidade desejada de fármaco ou toxina sobre a superfície da membrana DO dentro da abertura. NOTA: Dois mídia são comumente usados: sozinho MBIM ou MBIM/M3 em uma mistura de 50:50, sendo este último mais eficaz para os períodos de desenvolvimento mais longos.
      2. Transferência de embriões permeabilizadas à queda dos meios de comunicação com um pincel. Dispersar os embriões tornando-se estabelecer na membrana dentro da gota.
      3. Cuidadosamente aplicar um 25 milímetros lamela circular sobre a abertura achatamento assim o meio. Pressionar suavemente ao longo do perímetro da lamela de modo a formar uma vedação com a gordura. Nota: Vá para a microscopia de imagem para avaliar as características permeabilização ea viabilidade da preparação (veja o passo 4).

4. Identificação de permeabilizadas embriões viáveis

1. Identificar embriões permeabilizadas. Observe embriões sob epifluorescência, com um microscópio equipado com uma câmera digital. Adquirir imagens (no comprimento de onda azul para determinar o perfil de gema autofluorescência) de vários campos usando microscópio fixa e configurações da câmera.
2. Determinar a permeabilização de embriões com base na intensidade de fluorescência relativa. Usar-se um estereomicroscópio com uma grande distância de trabalho para acomodar o cesto e para permitir as manipulações dos embriões. O microscópio deve ser equipado com um palco XYZ programável, iluminação epifluorescência e uma câmera digital. Imagem os embriões tendo o cuidado de gravar a exposição e parâmetros de posição palco cada imagem embrião de habilitar reavaliação dos mesmos embriões em um ponto mais tarde (ver resultado representativo na Figura 3). Nota: Os padrões de absorção de corante vai variar dependendo do corante utilizado, o tempo de exposição e da idade do embrião. Uma ampla gamade absorção de corante através de uma única preparação é típica e reflecte a variação no grau de permeabilização.
3. Identificar embriões viáveis. Após posição de embriões permeabilizadas marcação, continuar com o desenvolvimento do embrião à temperatura ambiente ou a 25 ° C. Retornar cesta ou câmara de slides para microscópio. Observe em azul canal de fluorescência e adquirir imagem de autofluorescência gema em embriões permeabilizadas previamente identificados. Avaliar a viabilidade de acordo com a progressão normal da distribuição da gema (ver Rand et ai. ¹ e resultado representativo na Figura 3). Nota: Outras características morfológicas do embrião observada por microscopia de campo claro podem ser utilizadas para avaliar a viabilidade. Recomenda-se que o estabelecimento do nível de permeabilidade que é compatível com a viabilidade ser determinada empiricamente com cada corante e tensão de fly usado.
4. Avaliar efeitos de drogas ou toxinas na embriões viáveis ​​permeabilizadas.
5. Embriões processed com o protocolo acima estão prontas para uma série de análises convencionais subseqüente ao de drogas ou exposição a uma toxina. Vários dos vários tipos de análises são consideradas na discussão abaixo e incluir a observação direta de morfogênese em embriões vivos, bem como análises de pós-fixação imunocoloração. Ambas as abordagens são reforçadas pelo uso de corantes vitais (por exemplo, GFP), que revelam os padrões de expressão de genes e linhagem de células e perfis de morfologia.

Dispositivos de manipulação de embriões são apresentados na Figura 1 para auxiliar na visualização dos dispositivos de "home-made" para manipulação de protocolos acima. Os resultados observados na figura 2 ilustram o efeito robusto de criação de embriões a 18 ° C na sua capacidade de ser permeabilizada por EPS nas fases finais de desenvolvimento. Esta condição é aplicada no passo protocolo 2.1. A eficácia do corante ácido carboxílico CY5 para revelar os vários níveis de permeabilidade tipicamente observadas em embriões tratados EPS é visto na Figura 3. Dinâmica de desenvolvimento da distribuição do corante na gema também é visto na Figura 3, que revela um critério utilizado para avaliar a viabilidade , como descrito no protocolo passo 4.2. A utilidade do corante CY5 na determinação subsequente permeabilização embrião para o tratamento da toxina, a fixação de formaldeído e imunocoloração é ilustrado pelos resultados na Figura 4.

Figura 2. Efeito de envelhecimento a 18 ° C em EPS eficácia em embriões de fase tardia. Embriões foram recolhidos durante duas horas, seguido de envelhecimento a 18 ° C durante 20 horas (Painéis AA " (Painel CC"). Os embriões a 18 ° C foram então dechorionated e divididas em duas amostras. A primeira amostra foi tratado directamente com 1 mM de Rodamina B corante em MBIM-T durante 5 minutos, lavadas e visualizadas ao campo claro e de fluorescência azul e vermelho canais (Painel AA "). A segunda amostra foi tratada com EPS (01:10 em MBIM durante 1 min), lavadas e, em seguida, tratada com 1 mM de Rodamina B, durante 5 min e lavadas antes de visualização (Painel BB "). Os embriões criados a 25 ° C foram dechorionated e tratado directamente com EPS (01:10 em MBIM durante 1 min), lavadas e, em seguida, tratada com 1 mM de Rodamina B durante 5 minutos antes de visualização (Painel CC "). Os embriões foram determinados como sendo a fase 14, pelas dobras no intestino revelado por gema de autofluorescência no canal azul (Painel A ', B', C '). Os embriões criados a 18 ° C são impermeáveis ​​antes EPS tratamentt como visto pela ausência de absorção de rodamina B (painel A "). Tratamento de EPS de 18 ° C embriões produz um alto grau de permeabilidade, como visto pela rodamina B captação (Painel B "). Os embriões criados a 25 ° C permanecer impermeável, mesmo com o tratamento de EPS como visto por exclusão de Rodamina B (Painel C ").

Figura 3. Incorporação de CY5 em embriões permeáveis ​​e viáveis. Embriões foram recolhidos a 25 ° C durante 2 horas e envelhecida durante 14 horas a 18 ° C (equivalente a 7-9 embriões hr a 25 ° C, fase 12). Após dechorination, EPS, o tratamento foi feito (1:40 em MBIM durante 1 min), seguido por incubação em corante CY5 (50 uM em MBIM-T durante 15 min). Os embriões foram lavados três vezes em MBIM-T e transferidos para carrinho de desenvolvimento com MBIM no reservatório. Desenvolvimento foi autorizado a proceed durante 8 horas à temperatura ambiente. Captação de CY5 (Red) é trabalhada no canal vermelho distante imediatamente após o tratamento de corante e de lavagem (Painel A) e depois de 8 horas de desenvolvimento (Painel B). Distribuição da gema é visto por autofluorescência no canal azul. A absorção do corante, por conseguinte, a permeabilidade, é visto para variar a partir de embriões de embrião. CY5 corante (vermelho) é vista para localizar a gema (azul), o que se torna concentrada para o lúmen do intestino na fase 16 (roxo, Painel B).

Figura 4. Determinação da permeabilização e metilmercúrio efeitos em embriões fixos e imunomarcadas. Os embriões foram recolhidos a 25 ° C durante 2 horas e envelhecida durante 14 horas a 18 ° C (equivalente a 7-9 embriões hr a 25 ° C, fase 12). Após dechorination, o tratamento foi feito EPS (1:40 em MBIM durante 1 min), seguido por incubação emCorante CY5 (50 uM em MBIM-T, durante 15 minutos) em conjunto com o metilmercúrio (50 uM metilmercúrio, Painel B) ou DMSO de controlo de solvente (0,1% de concentração final, Painel A). Os embriões foram lavados com MBIM-T e colocada num cesto de desenvolvimento com MBIM: meio M3 no reservatório e envelhecida durante 8 horas adicionais à temperatura ambiente. Os embriões foram então fixadas em uma de duas fases de 4% a preparação de paraformaldeído-heptano através de um protocolo padrão 14. A coloração foi realizada com anti-fasciclina II (verde em A, B e branco em A ', B') para rotular os neurônios motores e anticorpos anti-elav (vermelhas em A, B) de rotular todos os corpos celulares dos neurônios. Corante CY5 é revelado por fluorescência direta, que exige exposição prolongada devido à diminuição da intensidade de fluorescência devido à fixação (CY5 é pseudo-cor azul em todos os painéis). Os efeitos de metilmercúrio são vistos na modelação irregular e clusteanel dos corpos celulares dos neurônios chordotonal laterais (elav-positivas, rotulados em vermelho e marcados com setas brancas em B contra um). Além disso, uma característica da ramificação segmentar (SN) (setas verdes sólidos em A ') é vista para ser altamente variáveis, com exposição metilmercúrio (setas verdes sólidos em B ") consistente com os efeitos previamente descritos de metilmercúrio no embrião 15. Projeção do intersegmental e segmentar os nervos em suas raízes são vistos para ser deslocado posteriormente com exposição MeHg (seta verde aberto em B '). Nota: O metilmercúrio é uma neurotoxina potente. Cuidados devem ser tomados ao usar luvas e óculos de protecção ao manusear. O descarte deve ser feito através de uma instalação de segurança ambiental institucional e de serviços.

Os autores não têm nada a divulgar.