Análise de Composição Nephron e função no rim adulto Zebrafish

Summary

O rim adulto do peixe-zebra é um excelente sistema para os estudos de regeneração e de doenças renais. Um aspecto essencial dessa pesquisa é a avaliação da estrutura e função de néfrons. Este protocolo descreve várias metodologias que podem ser implementadas para avaliar a composição de néfrons túbulo e avaliar a reabsorção renal.

Abstract

O modelo de peixe-zebra tem emergido como um sistema relevante para estudar o desenvolvimento do rim, a regeneração e a doença. Ambos os rins de peixes-zebra embrionários e adultos são compostas de unidades de nefrónios funcionais conhecidos como, que são altamente conservadas com outros vertebrados, incluindo mamíferos. Pesquisa em zebrafish demonstrou recentemente que dois fenômenos distintos transpire após néfrons adultos estão sujeitos a danos: primeiro, não há regeneração robusta dentro de néfrons existentes que substitui as células epiteliais do túbulo destruídos; segundo, inteiramente novos nefrónios são produzidos a partir de células progenitoras renais em um processo conhecido como neonephrogenesis. Em contraste, os seres humanos e outros mamíferos parecem ter apenas uma capacidade limitada de regeneração epitelial nefrónio. Até à data, os mecanismos responsáveis ​​por esses fenômenos de regeneração renal permanecem pouco compreendidos. Desde rins peixe-zebra adulto sofrer tanto a regeneração epitelial néfrons e neonephrogenesis, eles fornecem um par experimental excelentedigma para estudar esses eventos. Além disso, há uma grande variedade de ferramentas genéticas e farmacológicos disponíveis no modelo de peixe-zebra que podem ser utilizadas para delinear os mecanismos celulares e moleculares que regulam a regeneração renal. Um aspecto essencial dessa pesquisa é a avaliação da estrutura e função de néfrons. Este protocolo descreve um conjunto de técnicas de marcação que podem ser usadas para medir a composição e funcionalidade renal teste nefrónio do rim adulto peixe-zebra. Assim, estes métodos são amplamente aplicáveis ​​para o futuro caracterização fenotípica dos paradigmas de peixe-zebra adultos de lesão renal, que incluem mas não estão limitados a, os regimes de exposição nephrotoxicant ou métodos genéticos de morte celular-alvo, tais como a nitro-redutase mediada técnica de ablação celular. Além disso, estes métodos podem ser utilizados para estudar a formação de perturbações genéticas em rim de adultos e pode também ser aplicado para avaliar o estado da doença renal crónica durante a modelação.

Introduction

O rim é um órgão complexo que cumpre uma série de funções fisiológicas no corpo. A função mais importante do rim é a excreção de resíduos metabólicos, e esta tarefa está intimamente entrelaçada com a manutenção da homeostase dos fluidos. O rim executa esses trabalhos por filtração do sangue e formação de urina, enquanto concomitantemente regulação da pressão arterial, os níveis de eletrólitos e equilíbrio ácido-base. Túbulos epiteliais altamente especializadas chamadas nefrónios servir como a unidade funcional de base do rim ^1,2. Nos vertebrados adultos, néfrons são normalmente organizados em um arranjo bem enrolada em torno de um sistema de drenagem centralizada, permitindo, assim, muitos túbulos de embalar para o relativamente pequeno órgão. Por exemplo, cada rim humano pode conter mais de 1 milhão de néfrons ^3. Outros mamíferos como o mouse possuem na ordem de 8-10000 néfrons por renal ^4. O grau de complexidade renal difere entre esses mamíferos e outras vertebrates devido a variações no número total de néfrons e seu layout arquitetônico dentro do rim. Espécies de vertebrados formar até três sucessivas estruturas renais durante o desenvolvimento, e cada forma exibe uma complexidade crescente em relação à dotação de néfrons e disposição: os pronephros, mesonephros e metanefro. A última estrutura renal a ser retida serve como o rim adulto tipicamente um órgão ou um mesonefros metanefros ^2. Cada forma de rim, no entanto, tem uma composição à base de nefrónio ^2.

O néfron é o carro-chefe do rim e é responsável pela filtragem do sangue, juntamente com secreção metabólito e reabsorção. Néfrons são estruturas tubulares simples formadas por células epiteliais e têm uma organização segmentar, em que domínios discretos, altamente especializados e de epitélios diferenciados executar tarefas específicas. Na ordem do fluxo de filtrado através do néfron, normalmente há três partes principais que comprise cada uma das unidades: (1) o corpúsculo renal, (2) um túbulo proximal com, intermédia, e distais, e (3) uma conduta de recolha ^1. O túbulo proximal é responsável pela reabsorção de solutos orgânicos, mais notavelmente glicose e os aminoácidos ^1. O túbulo intermediário (ou alça de Henle) é um importante local de sal e água a regra ^1. Finalmente, ajuste fino de sal e outros íons ocorre no túbulo distal e ducto coletor e é altamente regulado pelo sistema endócrino ^1. A partir daí, o filtrado viaja através do ureter e da bexiga, em última análise, que sai do corpo como um produto residual ^1.

A perda da função renal pode ser resultado de uma multiplicidade de causas que impedem a atividade de néfrons normal. Essas causas podem ocorrer durante o desenvolvimento do rim, por exemplo, defeitos congênitos que levam à má formação de néfrons ⁵ ou causas de diferentes tipos de lesão (decorrente tanto genética e environmeorigens ntal). Lesões adquiridas são amplamente classificados como lesão renal aguda (IRA) ou lesão renal crônica (DRC). LRA envolve uma perda abrupta da função renal, muitas vezes resultante de isquemia ou toxina exposição ^6,7. Nos mamíferos, reparação epitelial de néfrons é possível após tais lesões ^8, e muitas pessoas exibem a restauração completa da função renal após AKI. No entanto, AKI também está associada com alta morbidade e mortalidade que foram relatados através de uma ampla 30 - 70% de incidência ^6,7. DRC, em contraste, está associada com a perda progressiva da função renal que resulta de anos de danos prolongado, tipicamente associada com fibrose ^8,9. Além disso, existe uma interação entre AKI e CKD, como qualquer um pode predispor um indivíduo para o outro ^10-12. Por exemplo, aqueles que sofreram AKI são mais suscetíveis à doença renal crônica e mesmo a morte ^13. A incidência da doença renal, em ambos os EUA e em todo o mundo, atingiu epideproporções de microfone e está prevista a aumentar como a população idosa expande-, portanto, há uma necessidade crescente de identificar intervenções de medicina regenerativa para o rim ^14,15.

Apesar do conhecimento de que pacientes com LRA pode se recuperar, há muito tempo se pensou que o rim é um órgão sem poderes regenerativos inatas. Esta visão tradicional foi revisado drasticamente nos últimos anos ^16. Estudos investigando dano renal em camundongos e ratos após AKI têm mostrado que as células epiteliais do túbulo do néfron podem proliferar e reconstruir néfrons funcionais ^17-20. Embora os mamíferos possuem essa capacidade adaptativa para regenerar néfrons, existem limitações notáveis ​​e respostas inadaptadas podem ser desencadeadas que levam a fibrose renal e CKD ^21. Por exemplo, um estudo recente demonstrou que a ablação das células epiteliais repetido em nefrónios murino foi associada com a regeneração diminuída e nefrónios-sugerindo fibrose renal havea limitada limiar regeneração ^22. Não há nenhuma evidência de que o rim de mamífero adulto forma novas nefrónios para substituir os perdidos ou danificados, assim, a sua destruição leva a um défice de ^8,9 nefrónio permanente. Curiosamente, alguns vertebrados respondem a AKI regenerando néfrons epitélio e por também produzir novos néfrons, um processo conhecido como neonephrogenesis ou néfrons neogênese ^23. Neonephrogenesis ocorre em peixes após exposição a uma toxina ou ressecção parcial e modelos de lesão incluíram historicamente o peixinho ^24,25, tilápia ^26, patim ^27, medaka ²⁸ e, mais recentemente, o peixe-zebra ^29,30. Destes, peixe-zebra fornecer um modelo de pesquisa genética viável para descobrir as vias celulares e moleculares responsáveis ​​pela regeneração renal.

Neste artigo de vídeo, demonstramos como rotular segmentos dos néfrons em peixe-zebra adulto. O conhecimento da anatomia de néfrons, as características moleculares,e características funcionais são essenciais para estudos renais futuro de sucesso usando zebrafish. O rim adulto do peixe-zebra é uma estrutura mesonefros e é inerentemente menos complexo, em termos de número de nefrónios e organização do que a estrutura de metanefros encontrada em mamíferos adultos, aves, répteis e ^31. Contudo, a organização segmento nefrónio do peixe-zebra é análogo aos mamíferos, e foi documentada no rim embrionário com base em estudos de expressão de genes ^31-35. Nefrónios de embriões de peixes-zebra conter segmentos lineares tubulares que incluem o túbulo proximal (PCT), túbulo proximal recta (PST), distal precoce (DE), e distal tarde (DL) ^31-35 (Figura 1). Nefrónios adultos Zebrafish possuem segmentos tubulares semelhantes ^30,31,36,37 (Figura 1). O PCT, também podem ser identificados por um fenótipo funcional: As células epiteliais na PCT irá incorporar compostos de dextrano marcados com fluorescência (10-70 kDa em tamanho) presentes nocirculação, que foi usado tanto no rim embrionário do peixe-zebra e adulto para avaliar a absorção de endocitose por essas células do túbulo proximal, ^38-41 (Figura 1). Uma diferença em segmentos dos néfrons entre peixe-zebra e mamíferos é que carecem de um peixe-zebra túbulo intermediário, ou alça de Henle ^30-37; uma vez que este segmento funciona em mamíferos para conservar a água e peixe-zebra são uma espécie de água doce, sem a urgência de concentrar a urina, não é de estranhar que zebrafish falta neste segmento ^32,33. Assim, a composição global nefrónio é largamente conservada entre o peixe-zebra e rim de mamífero ^32,33. Estas semelhanças permitiram peixe-zebra para ser uma ferramenta eficaz de investigação para investigar as funções dos genes expressos-renais durante nefrogênese desenvolvimento ^32-35,42 e modelar inúmeras doenças renais ^43,44, o que agrava a lista substancial das condições humanas que podem ser investigada usandozebrafish ^45,46.

Hoje, o rim adulto peixe-zebra é um modelo atraente para estudos comparativos de regeneração renal devido à sua rastreabilidade genética eo palato expansão dos recursos tecnológicos disponíveis para interrogar a função do gene e vias de sinalização nesta espécie. Vários estudos têm utilizado os mesonephros peixe-zebra para investigar os mecanismos de regeneração após AKI ^29,30,37. Para a pesquisa AKI continuou usando o rim adulto peixe-zebra, é essencial dispor de métodos requintados para rotular diferentes regiões e métodos de néfrons para examinar a funcionalidade de néfrons. Existem vários métodos de análise de rim adulto foram adaptados a partir de protocolos de rim embrionário. A injecção intraperitoneal de dextrano marcado fluorescentemente no peixe-zebra adultos rótulos do epitélio em PCT Mesonefros nefrónios via endocitose ^30, como em embriões de peixe-zebra ^38-41 (Figura 1). Este método tem sido utilizado para visualize quando túbulos proximais recuperar a sua propriedade reabsorvendo seguinte AKI, o que permite uma avaliação das restaurado função fisiológica ³⁰ (Figura 1). Outra característica do túbulo proximal nefrónio é que as células epiteliais deste segmento possuir uma borda em escova ³⁷ que apresenta elevados níveis de actividade de fosfatase alcalina endógena. Assim, o epitélio proximal pode ser localizada visualmente no rim adulto peixe-zebra utilizando uma técnica de fluorescência com base conhecido como ELF- (Enzyme-Labeled Fluorescência) -97 ^47.

Aqui, nós descrevemos como realizar ensaios de captação de dextrano fluorescentes ^30,48 no rim adulto peixe-zebra, de modo a obter uma avaliação funcional do túbulo proximal e mapear o tamanho e os contornos do segmento tubular. Em seguida, descreve-se técnicas para identificar as regiões do túbulo proximal do nefrónio adulto com a fosfatase alcalina marcador fluorescente. Em terceiro lugar, mostramos pela primeira vez que o Rhodamina marcada com lectina de aglutinina de Dolichos biflorus (DBA), a qual tem sido utilizada como um marcador geral das condutas de recolha no rim de mamíferos ^49, marca os túbulos distais do rim adulto peixe-zebra. Como DBA é mutuamente exclusiva à coloração da fosfatase alcalina, esses rótulos fornecem uma maneira de distinguir amplamente pan-proximal contra trechos pan-distais do néfron zebrafish adulto. Ao longo da implementação destas manchas fluorescentes em todo tanto montagem e cortes histológicos criostáticas, nós correlacionar esses rótulos com domínios de genes transportadores de soluto que identificam cada um dos segmentos de néfrons de expressão. Portanto, este protocolo também contém um guia para os procedimentos de processamento de tecidos modificados para todo tecido adulto montagem de hibridação in situ (desejo) a análise com base em nosso protocolo DESEJO embrião ^50. Estes procedimentos podem ser utilizados em combinações diferentes (Figura 2) para documentar características morfológicas e funcionais of adultos néfrons nos rins do peixe-zebra. Assim, estes protocolos podem ser aplicados a estudos de regeneração, a caracterização fenotípica dos outros modelos de doenças renais, e até mesmo utilizado para estudar a formação de rim adulto.

Protocol

Os procedimentos para trabalhar com peixe-zebra descrito neste protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucional da Universidade de Notre Dame. Nota: Um guia para os rins e néfrons anatomia do peixe-zebra é fornecida (Figura 1). Uma visão geral das metodologias descritas no presente protocolo é fornecido como um fluxograma (Figura 2) para ilustrar como os procedimentos de marcação múltiplas podem ser realizadas na mesma amostra de rim. Para a parte 7 em preparação desejo para estudos renais adultos, as etapas fornecidas aqui indicam como modificar o processamento de embriões de peixes-zebra, como publicou recentemente ^50, para fornecer um guia técnico para análise DESEJO sucesso do órgão renal.

1 Adulto Zebrafish intraperitoneal com Dextran de Interesse

1. Preparar o material de dextrano marcado com fluorescência desejado (s) por dissolução do pó de dextrano em água destilada a uma concentraçãode 50 mg / ml e em seguida armazená alíquotas em tubos de microcentrífuga a -20 ° C no escuro. Nota: Vários dextranos marcados com fluorescência estão disponíveis comercialmente. Selecione o dextrano para uso com base na combinação de outros rótulos que são desejados, e certifique-se os filtros fluorescentes apropriados estão disponíveis com os microscópios que serão utilizados. Dextrans lisina-solucionáveis ​​mostrar fluorescência, sem quaisquer outras medidas de rotulagem em amostras de vida, amostra de tecido não fixado a partir de espécimes sacrificados, e espécimes fixados.
2. Descongele o estoque dextrano desejado e armazenar no gelo no escuro durante a execução de passos 1,3-1,5. Enrole o tubo de microcentrífuga em papel alumínio para proteger da luz durante o manuseio.
3. Anestesiar um peixe-zebra adulto entre 5-7 meses de idade, colocando o peixe em um prato contendo ou 0,02% ou 0,001% tricaina 2-fenoxietanol para cerca de 1-2 min. Nota: É preferível usar peixe-zebra adulto desta faixa etária porque os peixes mais jovens pode ter small rins que são difíceis de dissecar e amostras de rim a partir de peixes de idade pode conter massas de tecido cicatricial, que não podem ser analisadas. Quando apropriadamente anestesiados, o peixe-zebra adulto não apresentam uma resposta ao toque de estimulação, o qual pode ser testado utilizando uma colher ou uma sonda romba para tocar suavemente o caudal do peixe.
4. Usando uma colher de plástico, levante o peixe do prato, decantar a solução e coloque cuidadosamente o animal em um molde de esponja molhada, ventral voltada para cima.
5. Usando um 31 L 1,0 cc seringa de insulina, injectar 20 mL de solução de estoque descongelado dextrano no espaço intraperitoneal. Orientar a agulha de modo que a inserção ocorre em um ângulo raso na linha média ventral do abdômen. Para evitar a perfuração órgãos, inserir a agulha então elevá-la levemente, de modo a levantar a parede do corpo do peixe e criar um espaço no qual a injectar a solução de dextrano ^48. Observação: Como alternativa, o banco de dextrano pode ser diluída, por exemplo, numa proporção de 1: 2 e 2: 1 (dextrano: diságua destilada), para reduzir a fluorescência de fundo da amostra.
6. Suavemente devolver o peixe para o tanque para permitir a recuperação da anestesia. Nota: A absorção de dextrano por o segmento de túbulo proximal ocorre dentro de 8-12 horas e pode ser detectada por, pelo menos, até 3 dias pós-injecção (dpi). Análise em 3 dpi fornece sinal túbulo forte com baixa fluorescência de fundo nas populações estromais renais. Vá para a parte 2 para o exame todo monte de captação dextrano sozinho, se a rotulagem adicional não é desejado. Para a rotulagem combinatória, prosseguir para a Parte 3 para preparar o tecido para exame todo monte de captação dextrano, em seguida, Parte 4 double-label com fosfatase e / ou Parte 5 alcalina, a realizar duas vezes DBA ou rotulagem triplo. Para a pesquisa com cortes histológicos, prosseguir para a Parte 6 para instruções sobre como fazer cortes finos do rim usando um criostato e como a mancha-las com vários rótulos e / ou imuno-histoquímica com ANTIB primária e secundáriaodies.

2 Dissecção e Plano Monte Preparação do rim adulto Peixe-zebra de uma amostra animal Unfixed a Visualize fluorescente Dextran rotulagem do Proximal Tubule

1. Eutanásia do peixe-zebra adulto com injecção de dextrano, colocando-o em um prato com 0,2% tricaina pH 7,0 por 4-5 min. Nota: Certifique-se de que o peixe tenha sido sacrificados antes de prosseguir, através da monitorização cuidadosa se ​​as guelras cessaram movimento eo coração parou de bater ^36.
2. Usando uma colher de plástico, levantar o peixe a partir da solução tricaina, decanta-se a solução e coloca o animal sobre uma toalha de papel ou tecido.
3. Utilizar um par de tesouras de dissecação afiado para fazer um corte por detrás do opérculo branquial e remover a cabeça.
4. Imediatamente abrir o corpo do peixe com as tesouras de dissecação, fazendo uma incisão ventral longo da cabeça para a base da aleta caudal.
5. Remover os órgãos internos do peixe usando um par de fórceps finos.
6. Use agulhas dissecação super-finos de prender as paredes de abertura do corpo de forma a permitir a visualização do órgão de rim, que é aderente à parede dorsal do animal.
7. Use uma pinça fina para retirar o rim da parede dorsal.
8. Suavemente colocar o rim para um frasco de vidro contendo 5 ml de PBS 1X e lavar três vezes com 3-5 ml de fresco 1X PBS durante 5 minutos cada. Nota: O uso de um frasco de vidro para o manuseamento de amostras de rim adulto facilita a visualização de tecido e permite lavagens com grandes volumes (relativamente à massa de tecido) de aproximadamente 3-5 ml. Alternativamente, um de 12 poços de cultura de células pode ser utilizado prato. Embora um tubo de microcentrífuga de plástico poderia ser usado, os tubos de tamanho padrão (1,5 ml) poderia restringir a lavagem.
9. Remover o rim com uma pipeta de transferência e local sobre uma lâmina de vidro limpa com 1-2 gotas de 1X PBS.
10. Use uma pinça fina para alisar o rim no slide, certificando-se de não tecido foi enrolado ou não anuladasobre si mesmo. Nota: Alternativamente, uma ferramenta de arame de tungsténio pode ser usado para fazer pequenas incisões no tecido conjuntivo para facilitar o posicionamento plana do rim.
11. Colocar pequenos pedaços de massa de modelar em cada canto de uma lamela de 18 x 18 mm de vidro e lentamente ajustado a lamela para o rim. Nota: Um pouco ângulo a lamela durante a colocação para minimizar bolhas de interceptação na solução ^50. Os torrões de argila de modelagem são de aproximadamente 2 mm de diâmetro (Figura 2A). Alternativamente, torrões de graxa de vácuo pode ser substituído, em vez de massa de modelar. Adicionar uma queda adicional de 1X PBS para encher o espaço entre a lamela de vidro deslizante e, se necessário.
12. Observe e / ou imagem do rim, colocando a lâmina de vidro para o campo de visão em um estereomicroscópio ou composto microscópio com o filtro apropriado. Nota: Consulte a Figura 2A para macroscópica desta preparação.

3. Fixação, Dissection, permeabilização e remoção da pigmentação do rim adulto Zebrafish

1. Prepara-se uma solução fresca de fixador de 4% de paraformaldeído (PFA) / 1X PBS / 0,1% de DMSO ou descongelar uma alíquota congelada de 4% PFA / PBS 1 X e adiciona-se 0,1% de DMSO. Atenção: PFA é tóxico e soluções PFA deve ser tratado em um capuz químico enquanto usava equipamento de proteção individual adequado, incluindo luvas e jaleco. Além disso, a PFA em pó devem ser manuseados com cuidado ao fazer a solução estoque.
2. Encher um tabuleiro de dissecação com uma solução fixadora suficiente para submergir a todo o animal.
3. Eutanásia e monte o peixe-zebra selecionado na solução de fixação (consulte as etapas 2,2-2,6). Nota: O peixe pode ser seleccionada uma amostra não tratada de rim do peixe-zebra, ou um rim isolado de um peixe-zebra que previamente receberam uma injecção intraperitoneal de dextrano (Parte 1).
4. Fixar a amostra O / N (12 - 16 horas) a 4 ^o C.
5. No dia seguinte, use uma pinça fina para cuidarseparar totalmente o rim a partir da parede do corpo da dorsal e colocar o órgão em um frasco de vidro usando uma pipeta de transferência. Observação: Como alternativa, um de 12 poços ou 24 poços de cultura prato pode ser usado. Embora um tubo de microcentrífuga de plástico poderia ser usado, os tubos de tamanho padrão (1,5 ml) poderia restringir a lavagem.
6. Lavar o rim dissecados três vezes com 3-5 ml de 1X PBS com Tween a 0,05%, durante 5 minutos cada.
7. Remover o 1X PBS com 0,05% de Tween e enxaguar o rim com 3 ml de uma solução de sacarose a 5% (em 1X PBS) durante 30 min.
8. Substituir com 3 ml de solução de sacarose a 30% (em PBS 1X) e armazenamento de O / N (12 - 16 horas) a ⁴ ° C. Nota: As soluções de sacarose a permeabilizar as membranas celulares, permitindo posteriormente marcação específica de reagentes à medida que penetram no tecido.
9. No dia seguinte, remover a solução de sacarose a 30% e lava-se o rim duas vezes com 5 ml de 1X PBS com Tween a 0,05% durante 5 min cada.
10. Substitua o 1X PBS com 0,05% de Tween com 3 -5 ml de solução de branqueamento para remover a pigmentação dos melanócitos presente no órgão de rim.
11. Coloque frasco de vidro em um rotador e observar cuidadosamente como pigmentação desaparece. Nota: despigmentação normalmente leva cerca de 20 minutos quando realizado após o tratamento sacarose, mas, ocasionalmente, pode levar até 60 min. Se a solução de branqueamento é deixada sobre o rim durante demasiado tempo, o órgão de desintegração pode ocorrer; é aconselhável monitorar a amostra a cada 10-15 minutos para verificar a integridade dos tecidos.
12. Quando a pigmentação tenha sido removido a partir do rim, lavar duas vezes com 3-5 ml de 1X PBS com 0,05% de Tween.
13. Substituir a 1X PBS com 0,05% de Tween com 3-5 ml de solução de PFA a 4% durante 1 h à TA.
14. Remover a solução de 4% de PFA e lavar o rim três vezes com 3-5 ml de 1X PBS com Tween a 0,05% durante 5 min cada. Observação: Uma vez que a fixação é completa, o rim, também pode ser montado em uma lâmina de vidro e avaliou sans para captação de dextrano a Pigm melanócitoentação, executando os passos 2,8-2,12.
15. Remover o 1X PBS com 0,05% de Tween e substitua com 3-5 mL de solução de bloqueio, em seguida, a rim incubar à TA no bloco durante 2 horas.
16. Quando o bloqueio é completo, prossiga diretamente para o protocolo de coloração selecionada. Nota: O rim pode agora ser processado através de um ou mais procedimentos para a realização de estudos de marcação com diferentes reagentes. Para a rotulagem toda montagem do túbulo proximal, com apenas fosfatase alcalina, vá para a Seção 4 Para a rotulagem inteira montagem de apenas túbulo distal vá para a Seção 5 Alternativamente, secções 4 e 5 podem ser realizadas em sucessão linear para a detecção dupla em toda montagem .

4. rotular o rim adulto segmentos proximal túbulo com Alkaline detecção de fosfatase

1. Remova o bloco e lavar o rim 3 vezes com 3-5 ml de 1X PBS com 0,05% de Tween por 5 minutos cada um, e, em seguida, substituir o 1X PBS com 0,05% de Tween com 3-5 mlde 1X PBS. Deixe o rim de molho por pelo menos 10 min. Nota: Durante este tempo, transferir o rim para um de 12 poços ou 24 poços de cultura de tecidos, se o prato foi mantida num frasco de vidro para os passos de processamento anteriores.
2. Substituir o PBS 1X com a solução de substrato de fosfatase alcalina suficiente de trabalho (vide kit de detecção localizados na Tabela de Materiais) para cobrir a amostra, em seguida, colocar a amostra num rotador durante 30 minutos à temperatura ambiente. Manter a amostra protegida da luz.
3. Parar a reacção por lavagem do rim em solução tampão de lavagem alcalina fosfatase.
4. Lavar o rim, com 3 mudanças de solução tampão de lavagem mais de 10-15 min. Nota: Após este passo, vá diretamente para a Parte 5, Passo 5.1 (portanto omitindo temporariamente Passos 4,5-4,6) Se a rotulagem com DBA também é desejado. Etapa opcional: Para identificar e visualizar os núcleos das células no órgão, mergulhe o rim em solução de iodeto de propídio. Preparar um estoque de iodeto de propídio por dissolução do pó a uma concenção de 1 mg / ml (1,5 mM) em água destilada. Dilui-se o material a 500 nM em 2X SSC e incubar o rim nesta solução durante 30 min. Lavar com PBS 1X e avance para o Passo 4.5.
5. Remover a solução tampão de lavagem e montar o rim numa lâmina de vidro limpa no meio de montagem fosfatase incluído no kit de rotulagem (consulte os passos 2,9-2,12). Nota: O meio de montagem tem substituído a 1X PBS a partir do passo 2.9.
6. Visualize a fosfatase alcalina manchado renal utilizando um microscópio estereoscópico ou microscópio composto com um conjunto filtro / DAPI Hoechst. Nota: Passo opcional: Visualizar o iodeto de propídio usando um tetrametil-rodamina (TRITC) ou filtro vermelho Texas.

5. delimitam as rim adulto segmentos distais dos túbulos com Rhodamine DBA

1. Preparar uma solução de trabalho de DBA 200 ul diluindo DBA (2 mg / ml) a 1: 100 em PBS 1X.
2. Substituir a 1X PBS com Tween a 0,05%, com a solução de DBA 200 ul.
3. Coloque em rotator para1 hora à temperatura ambiente.
4. Remover a solução de DBA e lavar o rim três vezes com 3-5 ml de 1X PBS durante 5 minutos cada. Nota: Passo opcional: Para identificar e visualizar os núcleos das células no órgão, juntamente com o rótulo de DBA, embeber o rim em solução DAPI para detectar, com um filtro de Hoechst / DAPI (rodamina DBA mancha pode ser detectado com um ou TRITC Texas filtro vermelho). Prepara-se uma lingua DAPI dissolvendo pó com uma concentração de 5 mg / ml (14,3 mM). Dilui-se o material a 300 nM em 2X SSC e incubar o rim nesta solução durante 20 min. Lavar com PBS 1X e vá para o passo 5.5. Se a Parte 4 de processamento foi realizada, tenha em mente que DAPI e fosfatase alcalina foram ambos detectados com um filtro / DAPI Hoechst.
5. Retire a 1X PBS e montar o rim numa lâmina de vidro limpa (consulte as etapas 2,9-2,12).
6. Visualize os segmentos distais manchado de DBA do rim, usando um filtro vermelho TRITC ou Texas padrão definido em uma lupa ou microscópio composto fluorescente. Nota: s opcionaistep: Visualize o DAPI usando um filtro / DAPI Hoechst.

6. Embedding, cryosectioning e coloração (corantes vitais e imunohistoquímica Labeling) de Zebrafish Adulto Kidney Tissue

1. Selecione peixe para análise, em seguida, a eutanásia, corrigir e permeabilizar como descrito (Passos 3,2-3,8). Nota: Fix peixes adultos de 9: 1 de etanol: formaldeído DMSO / 0,1%, em vez de paraformaldeído a 4% / PBS 1X / DMSO a 0,1% para o procedimento de criocorte para produzir secções de dextrano, a fosfatase alcalina, e a visualização de DBA. No entanto, tenha em mente que as fixações à base de paraformaldeído pode ser compatível para alguns procedimentos de imuno-histoquímica. Além disso, o branqueamento de rim adulto não é necessária para a análise criocorte, porque os melanócitos são superficiais e não afectar a visualização de células de nefrónios que compreendem o "interior" do órgão de rim.
2. No dia seguinte, remover a solução de sacarose a 30% e substitua com 1: 1 de meio de congelamento de tecidos: 30% sucrose durante 4 horas à temperatura ambiente.
3. Remover a solução de 1: 1 e incorporar amostras de rim em tecido 100% em meio de congelamento e cryomolds lugar à temperatura de -80 ^{° C} durante pelo menos 1 hr.
4. Transversalmente cortar secções em série, de aproximadamente 12 mm de espessura, através de todo o rim adulto.
5. Montar criocortes congelados em lâminas de microscópio adesivas e deixar secar ao ar durante 1 hora a ⁵⁰ ° C.
6. Loja desliza a -80 ^{° C} até à sua utilização.
7. Quando criosecções está pronto para ser etiquetados, retire a lâminas de microscópio de -80 ^o C e colocar em slides mais quente a ⁵⁰ ° C por 45 min.
8. Usando uma caneta bloqueador líquido, desenhar um círculo em torno das criosecções e deixe secar por 15 min no slide mais quente a ⁵⁰ ° C.
9. Retirar as lâminas do slide mais quente e colocar o plano em uma câmara de umidade em temperatura ambiente.
10. Re-hidratar os criocortes adicionando 1X PBS com Tween a 0,05% para a porção rodeada das lâminas durante 20 minutos. Nota: Cerca de 200-300 &# 956; l é necessário para cobrir cada porção cercado em um slide.
11. Substitua o PBS 1X com solução Tween 0,05%, com fresco 1X PBS e incubar por 10 min.
12. Remover 1X PBS e incubar criocortes numa solução de bloqueio, durante 2 h. Nota: Para a 10 ml de solução de bloqueio, combinar 8 ml de 1X PBS com Tween a 0,05%, 2 ml de soro de vitela fetal e 150 ul de DMSO. Para efectuar imuno-histoquímica, após o passo de bloqueio, o diapositivo incubar com o anticorpo primário diluído em fresco desejado bloco de O / N a ^{4 °} C, lavar uma vez com 1X PBS com 0,05% de Tween, incubar durante 2 horas à temperatura ambiente com uma solução de anticorpo secundário diluído 1X PBS com Tween a 0,05%, lavagem uma vez com 1X PBS com Tween a 0,05%, e de montar uma lamela sobre a placa com meio de montagem. As diluições necessárias irão variar e os ensaios devem ser realizados para selecionar as diluições ideais. Recuperação de antigénios pode também facilitar a imunomarcação, e é realizado antes do bloqueio. Imediatamente após as lâminas são descongeladas a ⁵⁰ º C(Passo 6.8) incubar os criosecções entre 95 ^{º C-100 º C} por 40 min em tampão citrato de sódio 10 mM pré-aquecido. Esfriar as lâminas por 30 min, em seguida, lave duas vezes em 1X PBS com 0,05% Tween, e vá para a Etapa 6.11.
13. Remover a solução de bloqueio e lavar 3 vezes com criocortes 1X PBS durante 5 minutos cada.
14. Substituir 1X PBS com solução de coloração de DBA e incubar durante 1 hora. Nota: Diluir 1 mL de DBA, em 99 mL de 1X PBS para fazer uma solução de coloração de 100 ul.
15. Remover a solução de coloração de DBA e lavar 3 vezes com criocortes 1X PBS durante 5 minutos cada.
16. Aplicar marcador de fosfatase alcalina e incubar em criocortes durante 10 min.
17. Lavar fosfatase alcalina fora criocortes com uma série de três lavagens de tampão de lavagem durante 10 minutos cada. Nota: Para uma solução de 100 ml de tampão de lavagem, combinar 5 ml de 0,5 M de EDTA e 120 mg de levamisol em 95 ml de PBS 1X. Para identificar núcleos, incubar as seções com iodeto de propídio ou DAPI no diluções anteriormente observado (Passos 4.4 e 5.4, respectivamente) durante 30 minutos à temperatura ambiente. Seleccionar um corante nuclear compatível com a combinação de outros corantes fluorescentes que foram escolhidos.
18. Retire todo o líquido das criosecções e coloque duas gotas de meio de montagem na lâmina de microscópio.
19. Com cuidado, coloque micro tampa de vidro sobre a lâmina de microscópio. Criosecções agora está pronto para imagem com o filtro (s) apropriado.

7 Processamento de desejo para Adulto peixe-zebra amostras de rim

1. Selecione o espécime de peixe-zebra (s) desejado, eutanásia, corrigir e dissecar o rim como descrito (Passos 3,1-3,5). Nota: É essencial a utilização de uma solução de fixador de 4% de paraformaldeído (PFA) / 1X PBS com 0,1% de DMSO para permeabilizar o rim. Inserir o rim para um frasco de vidro para facilitar a visualização durante os passos de processamento subsequentes.
2. Retirar o fixador e lava-se o rim duas vezes com 5 ml de 1X PBST.
3. Remover o PBS 1X e lavar duas vezes o rim wiº 100% de metanol, em seguida, incubar o rim a -20 ^{º C} durante pelo menos 20 min para permeabilizar. Nota: Dissected rins podem ser armazenados indefinidamente -20 ^o C.
4. Re-hidratar o rim através da realização de uma série de lavagens de 5 min com 3 - 5 ml de metanol a 50% / PBST 1X, 30% de metanol / 1X PBST e duas vezes com 1X PBST.
5. Bleach o rim para remover a pigmentação, como descrito (Passos 3,10-3,14).
6. Tratar o rim com 10 ug / ml de proteinase K / PBST 1X com 0,1% de DMSO durante 20 min, em seguida, lavar duas vezes com PBST e 1X pós-correcção, em PFA a 4% / PBST 1X durante 20 minutos a S / N. Nota: Sempre preparar a proteinase K, a solução de trabalho imediatamente antes da digestão da amostra através da combinação de 50 ul de proteinase recentemente descongelado estoque K (10 mg / ml), 50 ml de PBST 1X, e 50 ul de DMSO.
7. Processar o rim para DESEJO simples ou dupla, seguindo os passos de síntese riboprobe, a pré-hibridação, hibridação, anti-digoxigenina / anti-fluoroscein incubação de anticorpos e detecção como descrito recentemente ^49. Nota: Whole mount imagens de manchas de rim deve ser realizada dentro de alguns dias após a realização da reacção de coloração. Manchas Nephron tendem a desaparecer muito rapidamente, especialmente rótulos substrato vermelhas. Para fotografia de néfrons, montagem plana da amostra de rim, como descrito acima, em Passos 2,10-2,12 e imagem usando um microscópio estéreo ou composto. Filtros de contraste de interferência diferencial pode ser utilizada para visualizar melhor as linhas celulares de nefrónios para facilitar a análise de uma amostra.

Results

Cada um dos protocolos foi realizado em peixes-zebra tipo selvagem. Exemplos dos dados obtidos documento da composição estrutural normal e propriedades dos nefrónios dentro do peixe-zebra adulto saudável do rim. O peixe-zebra adulto possui um mesonephros ou segunda forma de rim que está localizado na parede do corpo dorsal (Figura 1A). O rim adulto é relativamente plana e inclui uma cabeça de chamada, do tronco, e a região da cauda com melanócitos superficiais dispersos ao longo destas regiões (Figura 1A). O tecido renal contém matrizes de néfrons que se conectam e drenam para dutos coletores centrais (Figura 1A) ramificada. Cada nefrónio é polarizada ao longo do seu comprimento, com um filtro de sangue (ou corpúsculo renal) numa extremidade, seguido por uma série de segmentos tubulares, e terminando finalmente numa conduta que recolhe a solução que irá ser excretada (Figura 1A). Cada túbulo adulto néfron contém Segmen proximal e distalst de células, demarcada pela expressão de transportadores de soluto específicos ^30,31,36,37, que é conservado com o padrão exibido por segmentar nefrónios embrionários ^31-35 (Figura 1B). Por exemplo, os transcritos cubilina marcar o túbulo proximal ³⁹ (PCT e PST) e transcritos clcnk marcar o túbulo distai ³² (DE e DL) (Figura 1B). Além disso, o segmento de PCT distingue-se por expressão da slc20a1a, a PST é distinguido pela expressão de slc13a1, a DE é distinguida pela expressão de slc12a1, e DL é distinguido por expressão de ³² slc12a3   (Figura 1B). As diferenças entre os túbulos dos néfrons adulto em comparação com as embrionárias são que os segmentos distais exibir circunvoluções (DE, DL) e os ramos do segmento DL extensivamente no adulto, que é distinta da linear, anatomia não-ramificada destas regiões na embryo ^30,31,36,37 (Figura 1A). Em ambos os adultos e ³⁰ embrionário ^38-41 túbulos de nefrónios, o epitélio PCT podem ser distinguidas devido às suas propriedades de endocitose e podem ser visualizadas e avaliadas para a função de reabsorção com base na capacidade de absorção de dextrano conjugados fluorescentes (Figura 1B). Além disso, como demonstrado nas figuras subsequentes, do túbulo proximal adulto (PCT e H, ou pan-região proximal) é marcado por fosfatase alcalina, enquanto que o túbulo distai (DE e DL, ou a região pan-distal) é marcado por DBA (Figura 1B). Os métodos aqui usado para rotular adultos segmentos dos néfrons zebrafish utilizando o consumo dextrano, fosfatase alcalina, DBA, imuno-histoquímica ou desejar pode ser realizado em várias combinações, no todo ou montagem com cortes histológicos de tecido renal (Figura 2). Isto permite uma grande flexibilidade e variedade quando a composição de néfrons é para ser avaliada (Figura 2).

O rim adulto pode ser montado horizontalmente em uma lâmina de vidro para análise, com torrões de argila de modelação (ou, em alternativa, vácuo graxa) utilizados para suspender a lamela sobre o tecido (Figura 3A). À medida que o comprimento do rim normal é de aproximadamente 5-7 mm, que tem um tamanho favorável para imagiologia de uma aparelhagem ou composto microscópio (Figura 3A). Sob a iluminação de campo claro, numa população de melanócitos superficial com pigmentação preta pode ser visualizado em associação com o tecido do rim e a vasculatura, tal como a aorta pode ser vista, porque os eritrócitos circulantes tem uma tonalidade vermelha (Figura 3B). A seguir à injecção intraperitoneal de dextrano-FITC, os domínios de PCT localizados ao longo dos mesonefros ainda foram marcadas 3 dias mais tarde, e visualizada utilizando um filtro FITC num microscópio de fluorescência (Figura 3C). Enquanto melanócitos obscurecer parcialmente a visualização de túbulos renais individuais (Figu3C re '), os melanócitos não impedem a quantificação do número de nefrónios ou a avaliação do diâmetro e comprimento do túbulo. A seguir à injecção intraperitoneal de dextrano fluoro-rubi, branqueamento da amostra fixada eliminado a pigmentação dos melanócitos, e segmentos de PCT foi observada apenas com a iluminação de campo brilhante (Figura 3D). Gotículas lipídicas a partir da cavidade abdominal do corpo pode, por vezes, ser visto em associação com preparações de rim de órgãos inteiros (Figura 3A) segmentos .Individual PCT mostram convoluções, bobinas (Figura 3D "), mas também pode ser caracterizado por trechos relativamente lineares (Figura 3D").

Diferentes conjugados dextrano desde diferentes níveis de clareza total na marcação túbulo proximal. Em particular, o dextrano-FITC ou dextrano fluoro-rubi levou a nitidez rótulos nefrónios com fundo mínima (Figuras 3C-D "). Tanto o blu cascata dextranoe e conjugados amarelo lucifer mostrou absorção túbulo proximal no rim adulto (Figura 4A, 4B). Curiosamente, rins expostos ao azul cascata dextrano mostrou fluorescência PCT relativamente específica com algum fundo (Figura 4A, 4A '), enquanto que os rins expostos a amarelo lucifer dextrano tinha marcado segmentos PCT mas mostrou sinal de fundo visível, com presente não específica em toda a marcação fluorescente estroma renal, ou o espaço entre os nefrónios (Figura 4B, 4B '). Finalmente, a utilização de dextrano-fluoro rubi de rotulagem túbulo proximal superior, com pouca ou nenhuma base mesmo quando vista de uma gama de ampliações diferentes (Figura 4C, 4C '). Em todos os casos, o padrão característico de absorção tubular conjugado dextrano correlacionada com a expressão de transcritos que codificam DESEJOS slc20a1a, um marcador específico da PCT estabelecida ^30-32 (Figura 4D). Nephrem segmentos de PCT coradas com slc20a1a ribossonda anti-sentido apresentado PCT bobinas em forma de S, assim como os segmentos de forma menos acentuada PCT enrolada (Figura 4D), como observado durante os ensaios de conjugado de dextrano rotulado (Figura 3D ", 3D").

Outras preparações dos rins, tais como a detecção da actividade da fosfatase alcalina túbulo proximal (Figura 5A, 5B, 5C) foram realizadas de forma semelhante, após a remoção da pigmentação dos melanócitos. Isto permitiu proximal imagem túbulo do néfron e análise, sem qualquer obstrução. Endógeno reatividade fosfatase alcalina no néfron é uma grande marca do túbulo proximal ^1,47. Coloração da fosfatase alcalina é altamente específico para as regiões proximais de nefrónios, em comparação com o padrão de expressão DESEJOS pan-proximal do gene cubilina ³⁹ (Figura 5D, 5E). Alkaline reatividade fosfatase foi mais intensa no firr secção do túbulo proximal, que corresponde ao PCT (Figura 5B), semelhante ao padrão de expressão cubilina (Figura 5D, 5E), o qual também tinha níveis elevados de transcritos relativos no PCT. O PCT foi distinguido pelo seu diâmetro ligeiramente maior, expressão específica do fator de transcrição mafba (Figura 5E, 5E), e expressão específica do gene slc20a1a soluto transportador (Figura 4D, 4D). Fosfatase alcalina reactividade também rotulado como um trecho de túbulo proximal, com um diâmetro mais fino que corresponde ao segmento de PST (Figura 5B), com base em comparação com a expressão de transcrição específicos do segmento do gene slc13a1 soluto transportador (Figura 5F, 5F). Os domínios da slc20a1a marcador PCT e PST marcador slc13a1 expressão DESEJO são mutuamente exclusivos (Figura 5G cubilina (setas pretas em. Figura 5G ', 5G ", 5G"' ).

Para confirmar ainda mais a relação de reactividade da fosfatase alcalina com a identidade do túbulo proximal, montar todo o co-marcação de coloração da fosfatase alcalina foi realizado em peixes-zebra a partir de rins que receberam uma injecção intraperitoneal de dextrano fluoro-rubi 3 dias antes (Figura 6A-C). Dextrano fluoro-rubi mostrou sobreposição com fosfatase alcalina, em apenas a porção mais larga diâmetro do domínio túbulo proximal que corresponde ao PCT (exemplos na Figura 6D-I). O domínio de dextrano-positivo abruptamente interrompido no local onde o diâmetro do túbulo proximal diluído, ou seja, onde o PCT e PST satisfeitas, (seta brancacabeças na Figura 6) e fosfatase alcalina apenas reactividade foi observada no segmento posterior (PST exemplos na Figura 6D-I). Antecedentes de fluorescência a partir da reacção de fosfatase alcalina também vagamente delineado a par de grandes faixas de recolha de condutas paralelas encontrado no rim adulto ^29,30 -ducts que se distinguem por terem o diâmetro mais largo do tubo de qualquer renal associada (asteriscos na Figura 6A, 6E, 6E, 6G, 6H). Em seguida, o co-rotulagem dos túbulos dos néfrons com fosfatase alcalina e dextrano absorção foi observada em análise cryosection (Figura 6J, perímetros dos túbulos contornados com pontos brancos). Em secção transversal, a reactividade da fosfatase alcalina foi observado em uma banda de espessura na superfície apical do epitélio tubular, de acordo com a ultraestrutura da borda em escova, enquanto o espaço citosólico de células tubulares correspondentes mostrou dextrano fluoro-rubi reactividade (Figura 6J). Notavelmente, stained túbulos eram ou dupla positiva para fosfatase alcalina e dextrano, levando a sua identificação como segmentos de PCT, isoladamente ou positiva para fosfatase alcalina (Figura 6J, túbulo perímetro delineado em pontos amarelos), que conduz a uma identificação como um segmento de PST (nota: as outras túbulos presentes foram negativos para ambas as manchas, dados não apresentados) (figura 6J). Além disso, a fosfatase alcalina de coloração (Figura 6K) foi combinada com êxito com um marcador nuclear, iodeto de propídio (Figura 6D), facilitando a contagem de células (sobreposição na Figura 6 M).

O túbulo distal do adulto nefrónio peixe-zebra foi marcado com rodamina conjugada DBA (Figura 7). Whole mount-marcação dupla com DBA e fosfatase alcalina foi realizada nos rins a partir de peixe-zebra de tipo selvagem (Figura 7A-C). DBA e fosfatase alcalina reatividade mostrou nenhuma sobreposição nos túbulos dos néfrons ( Figura 7G, 7H, 7J), enquanto ramificação nunca foi observada em segmentos tubulares corados com fosfatase alcalina. Criocortes renais foram recolhidos a partir do peixe-zebra de tipo selvagem que contenham um transgene, em que o promotor dirige enpep eGFP (Tg: enpep: eGFP), como rótulos GFP ambas as extremidades proximal e distal ⁵¹ nefrónios túbulos (Figura 7I). A imuno-histoquímica foi realizada para detectar a GFP, de forma a marcar todos os túbulos renais (verdes, a Figura 7I), seguido de marcação fluorescente com fosfatase alcalina e DBA (turquesa e vermelho, respectivamente, Figura 7I). Análise de secções tubulares revelou que túbulos eram positivas para a fosfatase alcalina ou DBA, mas não ambas as etiquetas (Figura 7I). Apenas banheira raraules mostrou reactividade com nenhum fosfatase alcalina nem DBA mancha, possivelmente devido ao ângulo da secção tubular (seta branca, Figura 7I). Além disso, a coloração DBA foi combinado com sucesso em montar coloração todo renal com a etiqueta nuclear DAPI (Figura 7J), mais uma vez enfatizando a natureza característica ramificada dos segmentos do túbulo distal (setas brancas, Figura 7J).

Em seguida, para comparar adicionalmente os padrões de absorção de dextrano-FITC, fosfatase alcalina, e DBA, marcação tripla foi examinada injectando por via intraperitoneal com o peixe-zebra adultos de dextrano-FITC, seguido pelo isolamento do rim 3 dias mais tarde, seguido por coloração para cryosectioning e fosfatase alcalina e DBA (exemplos fornecidos na Figura 8A-E). Túbulos renais mostraram três categorias de combinações de etiquetas: túbulos que estavam dupla positiva para fosfatase alcalina e dextrano denotado segmentos PCT (linhas pontilhadas brancas), Tubules positivas para fosfatase alcalina sozinho denotado segmentos PST (linhas pontilhadas amarelas), e túbulos distais foram marcados por apenas DBA (pontilhada vermelha descreve Figura 8A-E). Pontos de ramificação Além disso, só DBA positivo túbulos expostos (Figura 8E). Pela análise DESEJO, este padrão distinto de ramificação da distal, DBA túbulos positivos correlacionados com os padrões de transcrições soluto transportadores que são específicos para os segmentos do túbulo distal (Figura 8F-I) de expressão gênica. Os transcritos que codificam clcnk, que marca a totalidade do túbulo distal (DE e DL) eram finas de diâmetro, abundante no rim, e pontos de ramificação contidos (seta preta Figura 8F, 8F '). Em comparação, os segmentos tubulares que mostrou a expressão de slc12a1 ou slc12a3, que é um marcador de DE e DL, respectivamente, eram menos abundantes em amostras de rim geral comparada com clcnk expressão (comparar com a figura 8 G e 8F, 8H). Além disso, os segmentos do túbulo que expressavam slc12a1 eram raramente, ou nunca, ramificada (Figura 8G, 8G '), enquanto que as regiões do túbulo que expressavam slc12a3 eram freqüentemente ramificada em arranjos característicos pinwheel-like (Figura 8H, 8H', 8H ", 8H" ' , pontas de flechas pretas). Por fim, desejo em dobro para o slc20a1a marcador PCT eo marcador clcnk distal mostrou que essas manchas não foram sobrepostos (Figura 8I). Notavelmente, os trechos de slc20a1a -expressing segmentos PCT não foram anexados ao clcnk túbulos -expressing, o que era esperado uma vez que o PST está situado entre estas regiões (Figura 8I). Tomados em conjunto, os ensaios de rotulagem túbulos renais com a captação de dextrano, alcalino fosfatase reatividade, DBA, e desejo de transcritos do gene específicos, permite o discernimento de proximal contra segmentos distais.

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Figura 1 Nephron anatomia no rim adulto zebrafish. Desenhos esquemáticos da (A) adulto renal peixe-zebra e (B) um gráfico de comparação de características moleculares segmento exibidos por adulto e néfrons peixe-zebra embrionárias. (A) (canto superior esquerdo) O rim adulto é um órgão plana localizada na parede do corpo dorsal. (Canto superior direito), Quando visto de uma perspectiva ventral, o rim tem uma morfologia distinta curvo, constituído por regiões da cabeça, do tronco e da cauda, ​​e também tem uma população de superfície dos melanócitos associados. O alargamento (inferior esquerdo) mostra um diagrama esquemático de uma árvore de nefrónio típico no rim adulto peixe-zebra, no qual cada um dos nefrónios possui um filtro de sangue (corpúsculo renal) numa extremidade, seguido de um túbulo proximal, túbulo distai, e a conduta. Colorido esquemática (bottom direita) mostra um diagrama de um adulto linear nefrónio árvore para comparar as características de segmentos com os dos nefrónios embrionárias (B). Os néfrons embrião de peixe-zebra contêm segmentos tubulares que incluem o túbulo convoluto proximal (PCT), proximal túbulo reto (PST), distal precoce (DE), e distal tarde (DL), com domínios de expressão respectivo gene listados abaixo. Néfrons no peixe-zebra adulto têm uma composição segmentar e assinatura molecular análoga baseada nos domínios de genes que codificam transportadores de soluto expressão semelhante, embora uma distinção notável em comparação com o embrião é que vários néfrons podem ser unidos através de um segmento DL ramificada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 fluxograma mapa indicando a relação entre os processos descritos no presente protocolo, indicando como os métodos podem ser realizados isoladamente ou em combinações variadas. Seguir à injecção intraperitoneal de dextrano marcado com lisina-fixável no peixe-zebra adultos, o rim pode ser visualizado numa montar toda a preparação, quer isoladamente ou em combinação com a fosfatase alcalina e / ou manchas de DBA. Alternativamente, o rim do peixe-zebra pode ser seleccionado do tecido examinado após o seccionamento histológico com um criostato. As secções podem ser coradas para marcar numerosas combinações de atributos, utilizando imuno-coloração nuclear, DBA coloração, e / ou fosfatase alcalina reactividade. Além disso, as secções renais pode ser visualizado directamente para a presença de dextrano de absorção lisina-fixável em segmentos de PCT. Finalmente, os rins selecionados podem ser tratados para a expressão espaço-temporal da expressão gênica usando desejo. Os números entre parênteses referem-se a correspoencontrando peças de protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Adulto rim do peixe-zebra de montagem plana preparação e aplicação de visualizar a absorção de dextrano conjugado no segmento PCT de nefrónios renais. (A) imagem de campo claro de uma amostra de rim planas preparação montagem, na qual o órgão está posicionado horizontalmente em uma lâmina de vidro, com uma lamela colocado na parte superior do tecido que repousa sobre quatro torrões de argila de modelação (cor-de-rosa quente). Aqui a preparação renal é fotografada ao lado de uma régua métrica para fornecer uma comparação em escala. O rim adulto típico é de aproximadamente 5-7 milímetros (mm) da cabeça à cauda. (B) imagem de campo claro de um crusrim. A pigmentação preta corresponde à população dispersa de melanócitos encontrados em associação com o rim, e a aorta é executado ao longo da linha média do rim. (C) Visualização de segmentos de nefrónios PCT três dias após injecção intraperitoneal de 40 kDa de dextrano-fluoresceína (FITC) , sem branqueamento de rim adulto. Segmentos PCT são vistos em todo o rim, mas são parcialmente obscurecida devido aos melanócitos. (C ') Zoom digital de um único néfron, com melanócitos (seta branca). (D) Imagem de um rim adulto 3 dias após a injecção intraperitoneal de 10 kDa dextrano flúor-rubi, fixação do rim, e de branqueamento. A pigmentação dos melanócitos foi removida e as regiões de PCT foram visualizados aqui com base na sua captação endocítica do dextrano em condições de iluminação de campo claro. Gotículas lipídicas (seta) a partir de do abdómen pode ser visto, por vezes em associação com amostras de tecidos renais. (D ', D ") Representativas imagens mostram pequenas variações morfológicas entre os segmentos PCT. Enquanto muitos PCT néfrons são bem enrolada (D '), outros néfrons conter regiões PCT que têm o mínimo de enrolamento (D "). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

. Rotulagem Figura 4 Adulto PCT néfron renal segmento túbulo zebrafish tipo selvagem foram injetadas por via intraperitoneal com um único conjugado dextrano fluorescente; em seguida, o rim foi examinado três dias após a injecção para visualização PCT. (A, A ') de dextrano azul cascata, de 10 kDa (B, B') dextrano amarelo lucifer, 10 kDa e (C, C ') f dextrano luoro-rubi, 10 kDa tudo preferencialmente rotular os segmentos de PCT em néfrons renais. Tanto a cascata de dextrano azul e amarelo lucifer mostra alguns marcação não específico de populações de células estromais localizados entre nefrónios, com muito mais elevada observada no fundo amarelo lucifer rins tratados. Em contraste, dextrano fluoro-rubi mostrou reduzida drasticamente fundo com rotulagem PCT intensa. (D, D ') Um rim adulto coradas pelo desejo de detectar a localização de transcritos que codificam slc20a1a, um marcador específico do tipo de célula transportador PCT. O domínio de slc20a1a expressão corresponde ao padrão característico de absorção dextrano observada no rim, com uma distribuição de vários / loop domínios PCT firmemente em espiral, bem como trechos de PCT mais alongadas que apresentam um diâmetro de largura consistente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5 resultado representativas da coloração para a fosfatase alcalina, um marcador de pan-túbulo proximal no rim adulto em comparação com peixe-zebra outros marcadores do túbulo proximal avaliadas com o desejo. Coloração da fosfatase (AC) Alcalina (turquesa) ilumina o túbulo proximal do néfron, destacando tanto o PCT e PST. (DF ') DESEJO único para os genes relacionados (cada um na coloração roxo). (D, D') O padrão de expressão cubilina , um marcador pan-proximal (PCT-H), correlaciona-se com fosfatase alcalina (D, D '). Em comparação, o desejo para mafba marca o PCT (E, E ') e slc13a1 marca o PST (F, F'). Em (GG "') DESEJO duplo para o marcador PCT slc20a1a </ Em> (vermelho) eo marcador slc13a1 CET (roxo) mostra que os segmentos marcados por esses marcadores não se sobrepõem, e sim que os seus domínios de expressão ocupam posições adjacentes quando néfrons individuais estão intimamente examinados (G'-G "). Setas pretas indicam a junção entre os segmentos de PCT e PST, que é tipicamente associada com uma mudança no diâmetro tubular de grande a pequeno, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6 fosfatase alcalina e dextrano absorção mostram sobreposição no segmento PCT de nefrónios de rim do adulto, e fosfatase alcalina de coloração é compatível com o co-marcação nuclear com iodeto de propídio. (AI) (AC) imagem mesclada e imagens separadas da região de sela de um único rim. (DF) e (GI) Dois conjuntos de imagens fundidas e imagens separadas de exemplo néfrons. (I) análise cryosection confirma co-rotulagem de fosfatase alcalina e dextrano flúor-ruby em segmentos de PCT (descritas no pontos brancos), enquanto que a fosfatase alcalina só rotula o PST segmento (descritas no pontos amarelos). (KM) Um rim foirotulados com (K) fosfatase alcalina (turquesa) e iodeto (L) propidium (roxo), possibilitando a (M) fundiu a visualização de células do túbulo proximal e seus núcleos, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7 fosfatase alcalina e DBA são mutuamente exclusivos rótulos de segmentos que marcam a região pan-pan-distal proximal e, respectivamente, presentes em néfrons nos rins peixe-zebra adulto. (AH) preparações integrais de montagem de um rim zebrafish corados com fosfatase alcalina e rodamina-DBA. A fosfatase alcalina (turquesa) e DBA (vermelho) não mostram sobreposição nos rins. Níveis de fundo de fosfo alcalinatase iluminar a par dos principais dutos coletores em cada rim (asteriscos, *), que são distintos, devido ao seu grande diâmetro. DBA túbulos positivas são mais finas de diâmetro e frequentemente caracterizados pela presença de pontos de ramificação (pontas de seta brancas). (AC) Fundiu-se imagem e as imagens separadas da região de sela de um único rim. (DF) Um conjunto de imagens fundidas e separadas de imagens exemplo néfrons. (G, H) Exemplos adicionais, com túbulos ramificados DBA ao lado de fosfatase alcalina túbulos positivos, fundido imagens. análise (I) cryosection confirma que as seções tubulares distintas fosfatase alcalina e etiqueta DBA, e apenas túbulos raros mostrar nenhum rótulo (seta branca ), provavelmente devido ao ângulo da seção para que túbulo. Para esta análise, os peixes transgénicos de tipo selvagem, Tg: enpep: eGFP, foram utilizados e todos os túbulos renais neste rim foram immunolabeled com um anticorpo primário, para detectar a GFP (J). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8 marcação tripla de criocortes de rins adultos com absorção de dextrano, a fosfatase alcalina, e em comparação com a análise de DBA DESEJOS segmento distal. Rins (AE) adultos foram injectados por via intraperitoneal com dextrano-FITC (verde), e os rins recolhidos 3 dias mais tarde para a incorporação e cryosectioning. A coloração com fosfatase alcalina (turquesa) e DBA (vermelho) revelou três populações de túbulos: segmentos de PCT que foram positivas para fosfatase alcalina reatividade e DEXTcorreu (descritas no pontos brancos), os segmentos de PST que foram positivos apenas para reatividade fosfatase alcalina (descritas no pontos amarelos), e os segmentos do túbulo distal que foram positivas para DBA só (descritas no pontos vermelhos), que também mostrou característicos pontos de ramificação distal. ( AD) imagem mesclada e imagens separadas de um exemplo seção. (E) Incorporada imagem de outra seção exemplo. (FI) Comparação dos padrões de expressão gênica dos túbulos distais por único (FH '") e dê um duplo I) DESEJO (. O (FH ') DESEJO único para os genes relacionados (cada um na coloração roxo). (F, F') O padrão de clcnk expressão, um marcador pan-distal (DE-DL), foi detectada em túbulos finos que continham pontos de ramificação (seta preta). (G, G ') Em comparação, desejo para slc12a1 marca o DE, sem pontos de ramificação detectados, e (HH' ") slc12a3 marca a DL, um segmento caracterizado por numerosos pontos de ramificação ao longo do órgão renal (setas pretas). (I) DESEJO Duplo para o slc20a1a marcador PCT (vermelho) eo clcnk pan-distal (roxo). Os segmentos marcados por esses marcadores não se sobrepõem, e sim os seus domínios de expressão ocupam posições não adjacentes, de tal forma que as bobinas individuais PCT (canto inferior direito) não encostam túbulos distais, e este último ocupar locais discretos e possuem pontos de ramificação da indicação (seta preta ). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Aqui, descrevemos métodos que permitem a visualização dos componentes do segmento nefrónio no peixe-zebra adultos. A injeção de conjugados de dextran fluorescentes permite rotulagem PCT preferencial devido as propriedades de endocitose dessas células do túbulo proximal ^30,38. Este método pode ser realizado com grande flexibilidade, devido à existência de dextranos que pode ser obtida com um grupo de diferentes conjugados fluorescentes. Além disso, a utilização de dextranos de lisina-fixável é uma forma especialmente conveniente para rotular PCT segmentos, como procedimentos de marcação secundárias não são necessários. Isso permite a detecção do sinal relativamente simples e é compatível com muitas outras marcas fluorescentes, imunomarcação e uso de linhas repórter transgênicos. Rotulagem de fosfatase alcalina também marca o túbulo proximal, com forte reação no PCT e reactividade ligeiramente mais fraco no PST. Finalmente, a coloração com DBA permite rotulagem dos segmentos tubulares distais, que exibem um characteristic ramificada morfologia. Várias moléculas de lectina, que são proteínas de ligação de açúcar de origem não-imune, têm sido amplamente utilizados para distinguir os segmentos de nefrónios de mamíferos ^47. É interessante que no peixe-zebra DBA correlaciona-se com os segmentos do túbulo distai, uma vez que é utilizado para marcar ductos coletores em rins de mamíferos ^47.

Tomados em conjunto, estes métodos podem ser utilizados em várias combinações para documentar composição e função renal. Uma vez que todos estes métodos podem ser usados ​​em preparações de rim de inteiros, eles fornecem ferramentas para avaliar estrutura nefrónios e função ao longo do órgão, sem depender exclusivamente a utilização de mais demorado, métodos tediosas, por exemplo, o trabalho de criocorte e imunomarcação. No entanto, os corantes descritos neste artigo métodos são viáveis ​​no criocorte. Análise cryosection gera amostras (em comparação com todo mount) que são mais adequadas para imunohistoquímica para detectar Pepti específicosdes, embora, naturalmente, este tipo de análise requer a disponibilidade de anticorpos primários adequados. Infelizmente uma grande limitação em trabalhar com o modelo animal peixe-zebra continua a ser a fraca disponibilidade de anticorpos. Assim DESEJO continua a ser o mais utilizado, ou seja, "go-to", procedimento para a análise da expressão gênica. DESEJO usando reações de substrato BCIP, NBT, e / ou INT para produzir precipitados roxo ou vermelho não é compatível com coloração fluorescente em criossecções. Uma opção seria a utilização de invocar a detecção DESEJOS fluorescente, um procedimento que foi optimizado para as amostras de peixes-zebra embrionários e pode ser adaptado para uso com o rim de adulto. A descrição dos métodos neste artigo de vídeo deve permitir uma maior experimentação com técnicas como DESEJO fluorescente em combinação com linhas de peixes-zebra transgénicos em que os segmentos individuais são marcadas com um repórter como eGFP ou mCherry. Alternativamente, os métodos descritos aqui could ser testados em combinação com outros corantes vitais, por exemplo, outras lectinas. Assim, uma nova adaptação e ampliação dos métodos descritos aqui poderia ser invocado para atender às necessidades do investigador para preparações integrais renais montagem e análise.

Como tal, estes métodos têm larga aplicação potencial de peixe-zebra com o modelo para os estudos de regeneração em curso e também em modelos de doença genética. Há uma necessidade premente de pesquisas inovadoras e tratamentos para males renais. Milhões de pessoas sofrem de algum tipo de doença renal a cada ano que resulta de causas congênitas, agudas e / ou crônicas. Além disso, a prevalência da doença renal continua a aumentar em todo o mundo, fazendo com que essas doenças um problema global de saúde pública ^14,15. Tratamentos como a hemodiálise estão disponíveis através do qual uma máquina de diálise externo serve para livrar o sangue de resíduos metabólicos do paciente, se os seus rins não são capazes de desempenhar esse papel. Infelizmente, Esta intervenção tem limitações, como é necessário para a sobrevivência de tratamento contínuo. Além disso, os doentes irão eventualmente necessitar de um transplante de rim, o que pode levar anos para receber uma vez por paciente é colocado em uma lista de espera. Mesmo depois da obtenção de um transplante de rim, muitos pacientes sofrem efeitos adversos, como resultado do procedimento e deve lutar esses efeitos para o resto de suas vidas. Essas dificuldades demonstram a grande necessidade para o desenvolvimento de novos tratamentos para ajudar a prevenir qualquer doença renal ou talvez aumentar a regeneração dos tecidos ^8,16,52,53. Dadas as limitações óbvias éticos da utilização de cobaias em laboratórios biomédicos humanos, os modelos animais são essenciais para o estudo da patogénese da doença humana e para o ensaio de novos tratamentos. Como um resultado da sua semelhança e proximidade anatómica evolutiva, o ratinho se tornou o modelo o mais amplamente usado para a doença humana ^45. No entanto, existem algumas limitações com este animal, incluing incapacidade de visualizar o desenvolvimento de órgãos in vivo e praticidade de completar telas genéticos de larga escala. Peixe-zebra é um organismo modelo relevante e útil para o estudo do desenvolvimento dos órgãos e modelagem de doenças humanas ^45,46. Em relação à doença humana, homólogos funcionais no peixe-zebra existem para quase 70% de todos os genes humanos ^54,55.

Trabalhos recentes destacaram a utilidade do peixe-zebra para muitas áreas de ^31,37,56 pesquisa renal. Estudos de regeneração e reparo no peixe-zebra após AKI sugerem que a regeneração epitelial tubular e neonephrogenesis são dois processos que ocorrem e se sobrepõem ao longo da regeneração timecourse ^30,37. A utilização de um antibiótico aminoglicósido gentamicina chamada tem sido utilizada como um paradigma da lesão, através do qual a estudar os resultados de LRA ^29,30,37 em peixes-zebra adultos. Ao longo de aproximadamente duas semanas de período após lesão de gentamicina, a Tubul proximales regenerar, e, entretanto, novos néfrons formar por todo o órgão ^29,30,37. Em geral, os mecanismos que regulam a regeneração epitelial permanecem altamente controversa. Em um mecanismo proposto para o processo de reparação, não é o evento lesão aguda inicial, seguido por um desprendimento de células mortas para o lúmen. Em seguida, há uma série de desdiferenciação, proliferação e migração de eventos, após o qual as novas células se diferenciam, o repovoamento da membrana basal lesada e restaurar a função para o local ferido. Alternativamente, outros estudos sugeriram que as células de substituição surgem a partir de células estaminais / progenitoras que residem dentro dos túbulos dos néfrons. No que respeita ao processo de neonephrogenesis no peixe-zebra, agregados celulares foram observadas após AKI pela injeção de gentamicina ^29,30. Estes agregados depois amadurecer em novos néfrons que sondar em túbulos já existentes ^29,30. O traço comum que une néfrons regeneração epitelial e neonephrogenesis é seu fator de mistério pura: no momento não são exponencialmente mais perguntas sobre como esses feitos regenerativos ocorrer do que há idéias disponíveis.

Até o momento, no entanto, várias linhas emocionantes de evidências sustentam a noção de que a pesquisa de regeneração renal usando zebrafish pode realmente fornecer informações comparativas pertinentes para AKI humano que também pode ter direto de translação potencial ^56-58. Rastreio químico para identificar pequenas moléculas que aumentam a proliferação das células progenitoras renais no embrião do peixe-zebra recentemente conduziu à identificação do inibidor de histona desacetilase butanoato de metilo-4 (feniltio) (m4PTB) ^56,57. A administração desse composto de larvas do peixe com induzida por gentamicina AKI revelou que a sobrevivência larval aumentou e que a proliferação tubular renal foi melhorada ^56,58. Quando os ratos com lesão renal aguda induzida por isquemia moderada foram tratados com m4PTB, sua recuperação foi acelerada em association com uma redução tanto atrofia e ciclo celular tubular prisão de proliferação de células tubulares renais ^58. Estas descobertas sugerem que as vias responsáveis ​​para o normal desenvolvimento do peixe-zebra renal e / ou a resposta regenerativa de LRA será conservada com mamíferos ^56.

Assim, embora mais estudos são necessários para separar os mecanismos de regeneração, ou seja identificar as vias de sinalização que estão envolvidos e entender suas interações-o peixe-zebra fornece um caminho promissor para perseguir este objetivo importante na área de nefrologia. As ferramentas tais como as etiquetas de células nefrónio descritos neste protocolo representa um grupo de ensaios que podem ser utilizados para avaliar a composição e funcionalidade renal em modelos LRA. Além disso, eles podem ser utilizados para caracterizar os modelos transgénicos de doença renal e podem proporcionar formas para identificar agentes terapêuticos químicos capazes de promover a restauração da estrutura depois de nefrónio barragem renalidade.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X PBS			Feito diluindo 10 X PBS em água destilada.
1X PBST			0,1% Tween-20 detergente em 1 X PBS.
1X PBS com 0,05% de detergente Tween-20			Tween-20 em 1 X PBS.
Tween 20	American Bioanalytical	AB02038
4% PFA/1X PBS			Dissolva 4% PFA (p/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) em 1 X PBS, leve para ferver em uma placa quente em uma capela de exaustão. Resfrie e congele as alíquotas para armazenamento no freezer a -20 graus C. Descongele imediatamente antes de usar e não congele novamente os estoques.
Pinça Fina	Roboz	RS-1050	Dumont Padrão de Pinça #55
Lâmina	de vidro Thermo-Fisher	4445	Branco Frost
Lamínula de vidro	Thermo-Fisher	12-540A	18 x 18 mm
Massa de modelar	Hasbro	Playdoh	Outras massas de modelar podem ser substituídas e funcionam de forma semelhante
Porta-lâminas	Thermo-Fisher	12-587	Opcional: bandeja de papelão para armazenar lâminas planas
Solução de			branqueamentoFórmula de mistura de alvejante (para uma solução de 20 ml): 1,6 ml de solução de hidróxido de potássio a 10% 0,6 ml de solução de peróxido de hidrogênio a 30% 100 μ l de 20% Tween Encher até 20 ml com água destilada
Hidróxido de potássio	Sigma	221473
Peróxido de hidrogênio	Sigma	H1009
Solução			Solução de bloqueio (para uma solução de 10 ml): 8 ml de PBS 1X com 0,05% de Tween 2 ml de soro fetal de bezerro 150 μ l de DMSO
Detecção de atividade de fosfatase alcalina	Invitrogen	E6601	Utilizamos o Kit de Detecção de Fosfatase Endógena ELF 97.  Para preparar a solução de substrato de trabalho, dilua o substrato 20 vezes no tampão de detecção, de acordo com as instruções do fabricante.
Solução de lavagem			Receita para solução tampão de lavagem (para uma solução de 100 ml): 5 ml de 0,5 M EDTA 120 mg de Levamisol 95 ml de 1X PBS
Dextran, fluoresceína, 40.000 MW	Invitrogen	D1844	Diluir com água destilada para fazer uma solução estoque de 50 mg/ml, e armazenar alíquotas no freezer a -20 graus C.
Dextrana, azul em cascata, 10.000 MW	Invitrogen	D1976	Diluir com água destilada para fazer uma solução-mãe de 50 mg/ml e armazenar alíquotas no freezer a -20 ° C.
Dextrano, amarelo de lúcifer, 10.000 MW	Invitrogen	D1825	Diluir com água destilada para fazer uma solução-mãe de 50 mg/ml e armazenar alíquotas no freezer a -20 graus Celsius.
Dextrano, tetrametilrodamina (fluoro-rubi), 10.000 MW	Invitrogen	D1817	Diluir com água destilada para fazer uma solução-mãe de 50 mg/ml e armazenar alíquotas no freezer a -20 ° C.
Dolichos biflorus aglutinina (DBA)-rodamina	Vector laboratories	RL-10-32	Solução de Coloração DBA (para um 100 μ l solução): 1 μ l de DBA 99 μ l de 1X
PBS Propidium iodeto	Invitrogen	E6601
DAPI	Invitrogen	P1304MP
Vectashield hard set montagem média	Vector laboratories	H-1400
Micro vidro de cobertura	VWR	48393081
Dimetil sulfóxido, DMSO	American Bioanalytical	67-68-5
Sacarose	Sigma	S0289
EDTA, solução 0,5 M, pH 8,0	American Bioanalytical	AB00502
Levamisol	Sigma	L-9756
Meio de congelamento de tecidos	Triangle Biomedical Sciences, Inc.	TFM-C
Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10 x 10x 5 mm	Sakura Finetek	4565
TruBond 380 lâminas de microscópio adesivas	Tru Scientific	0380W
Bloqueador de líquidos - caneta super PAP	Electron Microscopy Sciences	71312
Câmara de umidade de imunocoloração	Evergreen Scientific	240-9020-Z10
Cryostat	Therm	Microm™ Estereomicroscópio Criostato
	Nikon	SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Azul GFP/DAPI; 83457 P-Dotar GFP/FITC; 83457 O conjunto de filtros P-TRITC	usado foi o seguinte: O filtro Hoechst / DAPI foi usado para detecção de DAPI, iodeto de propídio, azul de cascata de dextrana e fosfatase alcalina. O filtro GFP/FITC foi usado para detecção de dextran-FITC, amarelo de lúcifer dextrano e anti-GFP. O filtro TRITC foi usado para detecção de dextrano-fluoro-rubi, PI e DBA.
Microscópio composto	Nikon	96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red	O conjunto de filtros usado foi o seguinte: O filtro Hoechst/DAPI foi usado para detecção de DAPI, iodeto de propídio, azul de cascata de dextrana e fosfatase alcalina. O filtro GFP/FITC foi usado para detecção de dextran-FITC, amarelo de lúcifer dextrano e anti-GFP. O filtro Texas Red foi usado para detecção de dextrano-fluoro-rubi, PI e DBA.