Utilizando Proteínas Fluorescentes para monitorar glicossomo Dynamics do Trypanosoma Africano

Resumo

A dinâmica dos glicossomos em tripanossomas africanos é difícil de estudar por técnicas tradicionais de biologia celular, como microscopia eletrônica e fluorescência. Como meio de observar o comportamento dinâmico das organelas, um sistema repórter de organelas fluorescentes tem sido usado em conjunto com a citometria de fluxo para monitorar a dinâmica dos glicossomos em tempo real em parasitas vivos.

Resumo

Trypanosoma brucei é um parasita que causa cinetoplastida tripanossomíase humana Africano (HAT), ou doença do sono, e uma doença debilitante, nagana, em bovinos ^1. Os suplentes do parasita entre na corrente sanguínea do hospedeiro mamífero eo vetor mosca tsé-tsé. A composição de muitas organelas celulares muda em resposta a essas condições extracelulares diferentes ^2-5.

Glicossomos peroxissomas são altamente especializados, em que muitas das enzimas envolvidas na glicólise estão compartimentados. Mudanças na composição glicossomo de uma forma de desenvolvimento e regulamentada ambientalmente ^4-11. Atualmente, as técnicas mais comuns usadas para estudar glicossomo dinâmicas são microscopia eletrônica e de fluorescência; técnicas que são caros, tempo e mão de obra intensiva, e não é facilmente adaptada para análises de elevado rendimento.

Para superar essas limitações, um sistema repórter fluorescente glicossomo emo que aumentou a proteína fluorescente amarela (EYFP) é fundido a uma sequência de direccionamento de peroxissoma (PTS2), que dirige a proteína de fusão para glicossomos ^12, foi estabelecido. Após a importação da proteína de fusão PTS2eYFP, glicossomos se tornar fluorescente. Degradação organelo e reciclagem resulta na perda de fluorescência que pode ser medido por citometria de fluxo. Um grande número de células (5000 células / seg) podem ser analisados ​​em tempo real, sem grande preparação de amostras, tais como a fixação e montagem. Este método oferece uma maneira rápida de detectar mudanças na composição de organelas em resposta às variações das condições ambientais.

Introdução

Trypanosoma brucei causa a doença do sono Africano em seres humanos e uma doença debilitante, nagana, em bovinos. As drogas utilizadas no tratamento das referidas doenças são antiquado e extremamente tóxico, as vacinas não estão disponíveis, e o potencial para o desenvolvimento de resistência às drogas necessita da busca de novos alvos de medicamentos ^1.

Durante seu ciclo de vida, T. brucei, alterna entre um inseto vetor e hospedeiro mamífero; dois hosts que se apresentam muito diferentes ambientes em que o parasita deve sobreviver. Uma série de alterações metabólicas e morfológicas ocorrer como o parasita est....

Protocolo

1.-Geral Trypanosoma Pecuária

1. Pesar sólidos para a preparação dos meios SDM79 (Tabela 1).
2. Armazenar a 4 ° C em 50 mL cónico ou um saco plástico. NOTA: Os reagentes são estáveis ​​durante pelo menos 6 meses.
3. Descongelar soro fetal bovino (FBS) em um banho de água a 37 ° C, e misturar periodicamente por inversão. NOTA: FBS é recebida do fornecedor, como uma solução estéril. Filtro de esterilização FBS reduz a sua capacidade para suportar o crescimento do parasita.
4. Uma vez que toda a garrafa é descongelada, calor inactivar soro durante 30 minutos num banho de água a 56 ° C, a mistura periodicamente para minimizar....

Resultados

Neste sistema, uma alteração dependente de glucose em glicossomo composição foi observado. Quando as células são cultivadas em meios contendo glucose, duas populações são observados; um brilhante e uma fraca (Figura 2A). Células Dim abrigar glicossomos imaturas, que não tenham importado a PTS2eYFP enquanto as células vivas abrigam uma mistura de maduros e imaturos glicossomos ^12. Quando a glicose está presente na mídia, mislocalization de glicossomo proteínas é letal ^15,28 e glicos.......

Discussão

Glicossomos são, dinâmico, organelas essenciais específicos do parasita. Os processos que regulam a biogênese, manutenção, proliferação e remodelação dessas organelas provavelmente incluem alvos de medicamentos que poderiam ser exploradas para fins terapêuticos. Apesar do elevado potencial de abundância de tais alvos de drogas, o campo de glicossomo biogênese ficou para trás o estudo de processos similares em outros organismos, predominantemente, devido à falta de um sistema tratável, de alto rendimento para o acompanha.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Adenosina	Avocado Research Chemicals Ltd	A10781	SDM79 Ingrediente
L-Alanina	Avocado Research Chemicals Ltd	A15804	SDM79 Ingrediente
L-Arginina	CalBiochem	1820	SDM79 Ingrediente
ácido p-aminobenzóico	ICN Biomedicals	102569	SDM79 Ingrediente
Solução de Vitamina de Águia Média Basal (100x)	Sigma	B6891	SDM79 Ingrediente
Biotina	Fisher	BP232-1	SDM79 Ingrediente
Cloreto de cálcio	VWR	BDH0224	Cytomix
EDTA	Fisher	S311-100	Ingrediente Cytomix
EZNA Gel Kit de extração	Omega Biotek	D2500-01	Purificação de DNA
Soro de grau de pesquisa	Fisher	03-600-511	SDM79 Ingrediente
Ácido fólico	ICN Biomedicals	101725	SDM79 Ingrediente
Glucosamina HCl	ICN Biomedicals	194671	SDM79 Ingrediente
Glicose	GIBCO	15023-021	SDM79 Ingrediente
L-Glutamina	CalBiochem	3520	SDM79 Ingrediente
Glicerol	Acros Organics	Ac15892-0010	Mídia de congelamento
Graces pó de mídia de célula de inseto	GIBCO	11300-043	SDM79 Ingrediente
Hemin	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingrediente
Guanosine	Avocado Research Chemicals Ltd	A11328	SDM79 Ingrediente
HEPES	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingrediente
Cloreto	de magnésioFisher	BP214-500	Ingrediente Cytomix
L-Metionina	Fisher	BP388-100	SDM79 Ingrediente
Aminoácidos MEM (50x)	Cellgro	25-030-CI	SDM79
Ingrediente Mistura NEAA (100x)	Lonza	13-114E	SDM79 Ingrediente
Meio Essencial Mínimo (1x) com L-glutamina	Cellgro	10-010-CM	SDM79 Ingrediente
MOPS	Fisher	BP308-500	SDM79 Ingrediente
Biocarbonato de sódio	Fisher	S233-500	SDM79 Ingrediente
de penicilina-estreptomicina	Cellgro	30-002-CI	SDM79 Ingrediente
L-fenilalanina	ICN Biomedicals	102623	SDM79 Ingrediente
Cloreto de potássio	Fisher	P217-500	Cytomix ingrediente
Fosfato de potássio dibásico anidro	Fisheer	P290-212	Ingrediente
Cytomix L-Prolina	Fisher	BP392-100	SDM79 Ingrediente
L-Serina	Acros Organics	56-45-1	SDM79 Ingrediente
Ácido pirúvico, sal de sódio	Acros Organics	113-24-6	SDM79 Ingrediente
L-Taurina	TCI América	A0295	SDM79 Ingrediente
L-Treonina	Acros Organics	72-19-5	SDM79 Ingrediente
L-Tirosina	ICN Biomedicals	103183	SDM79 Ingrediente
E.Z.N.A. Cycle Pure kit	Omega Biotek	D6492-02	Purificação de DNA
Tampão de ligação	Omega Biotek	PDR041	Purificação de DNA
SPW tampão de lavagem	Omega Biotek	PDR045	Purificação de DNA
Gene Pulser Xcell	Biorad	165-2660	Transformação de tripanossomas
4 mm Cubetas de eletroporação	VWR		Transformação de tripanossomas

Solução