Um Método de Esclarecimento Novo para Visualize biliar Degeneração Durante fígado metamorfose em lampreia de mar ( Petromyzon marinus)

Resumo

Mar lampreia perder a vesícula e canais biliares durante a metamorfose, um processo semelhante à atresia biliar humano. Um novo método de fixação e esclarecimento (clareza) foi modificado para visualizar toda a árvore biliar através de microscopia confocal de varredura a laser. Este método fornece uma ferramenta poderosa para o estudo degeneração biliar.

Resumo

A atresia biliar é uma doença rara da infância, com uma estimativa de 1 em 15.000 freqüência no sudeste dos Estados Unidos, mas é mais comum em países do leste asiático, com uma freqüência relatada de 1 em 5000 em Taiwan. Embora muito se sabe sobre a gestão da atresia biliar, sua patogênese ainda é indescritível. A lampreia mar (Petromyzon marinus) oferece uma oportunidade única para examinar o mecanismo e progressão da degeneração biliar. Mar lampreia desenvolver através de três fases da vida distintas: larval, parasitárias e adultos. Durante a transição de larva para juvenil parasitária, lampreia de mar sofrem metamorfose com reorganização dramática e remodelação na morfologia externa e órgãos internos. No fígado, a totalidade do sistema biliar é perdida, incluindo a vesícula biliar e das vias biliares. Um método recém-desenvolvido chamado "clareza" foi modificado para esclarecer todo o fígado e na junção com o intestino em lampreia mar metamórfica. Oprocesso de degeneração das vias biliares foi visualizado e discernir durante lampreia metamorfose mar por meio de microscopia confocal de varredura a laser. Este método fornece uma ferramenta poderosa para o estudo de atresia biliar em um modelo animal único.

Introdução

Lampreia Mar desenvolver-se através de três fases distintas de vida ^1,2. Lampreia mar larval (L) passam a maior parte do tempo em tocas como filtradores bentónicos. Depois de passar por sete estágios metamórficos de mudanças dramáticas na morfologia externa e reorganização em órgãos internos ^3, os juvenis resultantes (JV) entrar numa fase parasitária durante o qual eles se alimentam de sangue e fluidos de tecido de peixe hospedeiro, aumentando a massa corporal mais de 100 vezes . Depois de 1,0 a 1,5 anos se alimentando no peixe hospedeiro no mar ou grandes lagos, os adultos deixam alimentação durante o início da primavera e migram para os rios para desovar e morrer ^1,2.

Durante a metamorfose, o fígado lampreia mar perde a vesícula biliar e toda a árvore biliar, um fenótipo mutante evolutivo que imita a doença bebê humano atresia biliar. Atresia biliar infantil é uma doença hepática pediátrica rara, com graves complicações médicas ^4,5,6,7, 8,9,10, no entanto, a patogênese e etiologia da atresia de vias biliares são em grande parte desconhecida ^4. Os pacientes com atresia biliar morrer dentro de dois anos após o nascimento, a menos que a intervenção cirúrgica (cirurgia de Kasai) é realizada ^5. Posteriormente, estes pacientes necessitam de extensa gestão clínica e muitas vezes o transplante de fígado ^6. Muitas teorias de etiopatogenia atresia biliar têm sido propostas, como infecção viral, malformação congênita, doença auto-imune, e insulto tóxico. No entanto, a contribuição de cada um para o desenvolvimento de atresia biliar permanece inconclusiva ^7,8,9,10.

Ao contrário de crianças que sofrem atresia biliar patológico, lampreia de mar sofrem programada pelo desenvolvimento atresia biliar sem necroinflammation extensa, fibrose ou cirrose ^10. Os animais podem sofrer colestase transitória durante este processo de ^10, mas se adaptar a esta condição de desenvolvimentoVia de síntese de novo e secreção de sais biliares no intestino, após a atresia biliar de desenvolvimento, para além de mecanismos conhecidos, tais como a redução da síntese de sais biliares no fígado ^11. Este processo de maturação na lampreia mar oferece a oportunidade única conhecida para analisar a progressão da atresia biliar.

Um método recém-desenvolvido chamado "clareza" permite imagens de alta resolução no sistema nervoso de mamíferos complexos, transformando tecido intacto em um hidrogel nanoporous opticamente transparente ^12. Usando lampreia fígado mar e um protocolo CLAREZA modificado, de imagem de tecido intacto de degeneração biliar pode ser documentada em toda metamorfose fígado.

Protocolo

1. Solução Preparação

1. Adicione 1 L de 10x de 0,1 M de solução salina de tampão fosfato (PBS, pH 7,4): Pesar 26,2 g de fosfato de sódio (monobásico), fosfato de sódio a 115 g (dibásico), e 87,66 g de NaCl. Dissolver em cerca de 800 ml _{de H2O} destilada, ajustar o pH, e trazer o volume até 1 litro com _H2O destilada
   1. Adicione uma solução salina L 0,1 M de tampão fosfato (pH 7,4): Tome 100 ml 10x PBS, e adicionar 900 mL de _H2O destilada
   2. Adicione 1 L de 0,1 M de tampão fosfato salino (pH 7,4) com 0,1% de Triton X-100: Tome 100 ml 10x PBS, adicionar 1 ml de Triton X-100, e trazer o volume até 1 litro com _H2O destilada
2. Adicione 1 L de tampão de fosfato 0,1 M de 10x (PB, pH 7,4): Pesar 26,2 g de fosfato de sódio (monobásico) e fosfato de sódio a 115 g (dibásico). Dissolver em cerca de 800 ml _{de H2O} destilada, ajustar o pH, e trazer o volume até 1 litro com _H2O destilada
   1. Faça 1 L de 0,1 M de tampão fosfato (pH 7,4): Tomar 100 ml 10x PB,e adicionar 900 mL de água destilada H ₂ O.
   2. Adicione 1 L de 0,1 M de tampão fosfato (pH 7,4) com 0,1% de Triton X-100: Tome 10x 100 ml de PB, adicionar 1 ml de Triton X-100, e trazer o volume até 1 litro com _H2O destilada
3. Adicione 400 ml de solução de monómeros de hidrogel (4% de acrilamida, 0,25% de bis-acrilamida, paraformaldeído a 4%, 0,0075% de persulfato de amónio, 0,0005% de saponina em PBS a 0,1 M): Pesar 0,3 g de persulfato de amónio e 0,2 g de saponina. Adicionar 210 ml _{de H2O} destilada, 40 ml de 40% de acrilamida, 10 ml de 2% de bis-acrilamida, 40 ml de 10x de PBS (pH 7,4), 100 ml de 16% de paraformaldeído, e misturar bem.
4. Faça solução compensação 4 L (4% SDS em ácido bórico 0,2 M): Pesar 49,464 g de ácido bórico e 160 g SDS. Dissolve-se em cerca de 3,5 L _{de H2O} destilada, ajustar o pH para 8,5 com NaOH, e perfazer o volume até 4 L.
5. Faça 1 L solução de glicerol 80%: Medir 800 ml de glicerol, adicionar 200 ml de H ₂ O destilada, e misture bem.

2. Preparação de Tecidos

1. Preparar a solução de monómeros de hidrogel e uma alíquota de 10 ml a cada tubo de centrífuga de 15 ml.
2. Dissecar todo o tecido e fixar no hidrogel durante 2 dias a 4 ° C. Certifique-se de que a solução de hidrogel é, pelo menos, 10 vezes o volume do tecido.
3. Traga o tecido fixado hidrogel (no tubo de centrífuga de 15 ml) para um extractor de fumo.
4. Polimerizar o tecido fixado hidrogel por adição de 5 ul de TEMED, misturar bem, e deixar assentar, na hotte, à temperatura ambiente durante 2-3 horas.
5. Remover o excesso de gel completamente. Nota: gel extra irá dificultar o processo de compensação ea penetração de anticorpos durante a coloração.
6. Incubar o tecido fixado em 10 ml de solução de compensação num agitador de incubador ajustado a 70 rpm e 50 ° C durante vários dias até que o tecido torna-se transparente. Alterar solução limpar pelo menos uma vez por dia e remover o excesso de gel a partir do tecido quando se muda a solução de compensação.
7. Lavar o tecido em 10 ml de 0,1 M PB, com 0,1% de Triton X-100 a 70 rpm e 37 ° C durante a noite. Repetir esta etapa 3 vezes e remover o excesso de gel a partir do tecido quando se muda a solução tampão.
8. Incubar o tecido clarificado na solução de anticorpo primário em PB com 0,1% de Triton X-100 a 70 rpm e 37 ° C durante 2 dias. Nota: Certifique-suficiente solução de anticorpo primário para submergir todo o tecido.
9. Lavar o tecido em 10 ml de PB com 0,1% de Triton X-100 a 70 rpm e 37 ° C durante a noite. Repetir esta etapa 3 vezes e remover o excesso de gel a partir do tecido quando se muda a solução tampão.
10. Execute as seguintes etapas em um quarto escuro ou sob luz fraca. Cubra as amostras com papel alumínio para evitar o branqueamento foto.
11. Incubar o tecido clarificado com a solução de anticorpo secundário fluorescente nas PB com 0,1% de Triton X-100 e soro de bloqueio, a 70 rpm e 37 ° C durante 1 dia.
12. Lavar o tecido em 10 ml de PB com 0,1% de Triton X-100 a 70 rpm e 37 ° C durante a noite. Repita este passo 3 vezes e remover o excesso de gel from o tecido quando se muda a solução tampão.
13. Lavar o tecido em 10 ml de PBS, a 70 rpm e 37 ° C durante a noite. Repetir esta etapa 3 vezes e remover o excesso de gel a partir do tecido quando se muda a solução tampão.
14. Incubar o tecido clarificada em 80% de glicerol, a 70 rpm e 37 ° C durante a noite.
15. Armazenar o tecido manchado fluorescente, a 4 ° C antes de microscopia confocal.

Resultados

Vários eventos importantes do desenvolvimento ocorrem no sistema hepatobiliar durante lampreia metamorfose mar. O ducto biliar e da vesícula biliar em apoptose e degenerado (Figura 1). Combinando o método de clarificação modificado e coloração com marcador de células de fígado de citoqueratina 19 (CK19, presente em ambas as cholangiocytes e hepatócitos, antes e após a metamorfose ¹³⁾ e Bcl2 marcador anti-apoptótica utilizando microscopia confocal, todo o sistema biliar foi capturado ao longo ...

Discussão

Este protocolo modificado a partir de um novo método denominado "clareza" ^12, que reticula tecido intacto com poliacrilamida para formar um hidrogel nanoporoso, e depois tira da membrana plasmática de tecidos para alcançar a transparência óptica e a permeabilidade de macromoléculas. "Clareza" permite imagens de tecidos intactos de projeção de longo alcance e fiação do circuito local no sistema nervoso. Este novo método pode ser usado para visualizar todo o sistema biliar no fígado lampreia...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
40% de acrilamida	Bio-Rad	161-0140
2% bis-acrilamida	Bio-Rad	161-0142
TEMED	Bio-Rad	161-0800
persulfato de amônio	Sigma	A3678-25G
	Sigma	B7901-1KG
	Sigma	47036
dodecil sulfato de sódio	Sigma	L337-500G
fosfato de sódio (monobásico)	Sigma	04269-1KG
fosfato de sódio (dibásico)	Sigma	S5136-1KG
Triton X-100	Sigma	X100-500ML
glicerol	Sigma	G9012-500ML
16% paraformaldeído	Electron Microscopy Sciences	15710-S
	EMD	SX0590-3
15 ml	Ferramentas
	Qualquer marca