Descrevemos aqui o método de imagem baseada em microscopia fluorescente confocal de fibra (FCFM), que fornece um modo inovador para entender fenômenos fisiológicos nos níveis celular e subcelular em animais.
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Artigo de método
Induzida pela quimioterapia Vascular Toxicidade - em tempo real
Neste artigo
Resumo
Resumo
Certas classes de quimioterapias podem exercer alterações vasculares agudas que podem evoluir em condições de longo prazo que podem predispor o paciente a um risco aumentado de morbidade vascular. No entanto, embora a evidência clínica de montagem, há uma escassez de estudos claros de toxicidade vascular e, portanto, a etiologia de um grupo heterogêneo de distúrbios cardiovasculares vasculares / continua a ser elucidado. Além disso, o mecanismo que pode ser a base toxicidade vascular pode completamente diferentes dos princípios da cardiotoxicidade induzida por quimioterapia, a qual está relacionada a lesão directa dos miócitos. Nós estabelecemos um tempo real, in vivo plataforma de imagem molecular para avaliar a toxicidade vascular aguda potencial de terapias anti-cancerígenas.
Criámos uma plataforma de in vivo, imagiologia molecular de alta resolução em camundongos, adequado para a visualização de vasos dentro de órgãos confinados e blo de referênciavasos od dentro dos mesmos indivíduos, enquanto que cada indivíduo servir como seu próprio controle. Paredes dos vasos sanguíneos foram prejudicadas após a administração de doxorrubicina, o que representa um único mecanismo de toxicidade vascular que pode ser o evento no início de lesão de órgãos-alvo. Aqui, o método de microscopia de fluorescência (FCFM) imagiologia confocal baseado fibered é descrito, o qual fornece um modo inovador para compreender os fenómenos fisiológicos nos níveis celulares e subcelulares nos sujeitos animais.
Introdução
A evidência clínica indica que várias classes de quimioterapias provocar uma variedade de patologias vasculares manifestadas por fenômeno de Raynaud, hipertensão, infarto do miocárdio, ataque cerebrovascular, e veno-occlusivedisease hepática 1,2. "As drogas anti-angiogênicos" acidental "" é um termo relativamente novo, que descreve agentes quimioterápicos convencionais que atuam como inibidores da angiogénese possíveis, embora não originalmente desenvolvido para este fim de 3-5, mas projetado para eliminar as células tumorais através da imposição de tão pouco "colateral danos "para as células normais quanto possível 3. Vários quimioterapias têm sido implicados como vasculo-tóxicos como observado em estudos clínicos utilizando biomarcadores séricos. Entre estes estão os agentes (tais como ciclofosfamida), compostos de platina, tais como cisplatina () e antraciclinas 1,2,5-7 alquilação.
Complicações cardiovasculares agudos podem ocorrer como result de toxicidade vascular induzida por quimioterapia. Eles podem evoluir para doenças crónicas como a aterosclerose e conta para o aumento do risco de morbidade vascular tarde. No entanto, apesar de montagem evidência clínica, há uma escassez de estudos designados enfatizando o mecanismo de toxicidade vascular e, portanto, maior elucidação da patogênese exata que infligem se justifica.
Um grande desafio para revelar o mecanismo de toxicidade vascular induzida por quimioterapia resulta da complexidade de investigar a função vascular in vivo. Descrevemos aqui uma plataforma de alta resolução em imagem molecular in vivo em ratinhos que permite capturar características dos navios, o fluxo de sangue e. Esta plataforma facilita a detecção de efeitos directos vasculares induzidas pelo tratamento: em tempo real, bem como a segui-los durante um período de tempo dentro dos mesmos indivíduos.
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Protocolo
Declaração de Ética: Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional. Cuidados com os animais foi de acordo com as diretrizes institucionais. Camundongos ICR feminino (7-8 semanas de idade; 25 - 30 g) foram alojados em ar condicionado, luz controlada biotério da Faculdade de Medicina Sackler na Universidade de Tel-Aviv. Pelo termo, os animais foram sacrificados com overdose de anestesia.
1. Fibred microscopia de fluorescência confocal (FCFM) Calibração
- Ligar o dispositivo.
- Ligue a microssonda (mini0 / 30).
- Calibrar o dispositivo de acordo com as instruções do fabricante.
2. Ratos Preparação for Imaging
- Anestesiar por uma injecção subcutânea de ambas Ketaset (100 mg / kg) e XYL-M2 (6 mg / kg). Confirme anesthetization adequada por falta de resposta aos toe-pinch.
- Faça uma incisão na pele abaixo da virilha, a fim de revelar os vasos arteriais femorais. Manter o local da incisão úmido com solução salina após a incisão.
- Aqueça a cauda, usando um saco (ou uma luva) cheia de água quente (não muito quente ao toque) durante aproximadamente 30 segundos. Prepara-se uma (IV) para a administração intravenosa de derivação de FITC dextrano (um agente de contraste) e de um ou outro agente quimioterapêutico ou de solução salina, por inserção de uma agulha (30 L, 1/2 polegada) na veia da cauda e ligando uma seringa de 1 ml a ele . Garantir a veia está aberto ao injetar soro fisiológico.
NOTA: Uma administração IV de FITC dextrano (peso molecular elevado; 100 ul; 10 mg / ml; 2,000 kDa) facilita a visualização da microvasculatura femoral por FCFM. Doxorrubicina (100 ul; 8 mg / kg, adriamicina) ou solução salina também será mais tarde administrados IV na veia da cauda de pré-aquecida. - Posicione o mouse supinely em um palco de poliestireno. Prenda o mouse para a almofada e manter a posição usando fita adesiva cirúrgica.
NOTA: O microscópio confocal desfibrado utilizado neste estudo é composto por duas unidades: (1) microssonda (mini0 / 30). (2) unidade de digitalização a laser (LSU-488; 488 nm de comprimento de onda).
- Executar todas as datas-voltas análises utilizando o laser de comprimento de onda nm LSU 488.
NOTA: O principal detector unidade detecta o filtrado (500-650 nm) fluorescência emitida. As imagens obtidas são reconstruídos depois e exibido a uma taxa de 12 frames / seg. - Desligue cuidadosamente a seringa da agulha e anexar uma nova seringa contendo FITC dextrano. Administrar (IV) 100 uL de FITC dextrano.
- Deslocar a microssonda (mini0 / 30) para um campo de vista apropriado e fixar-lo, após um ajuste para o eixo z, a fim de se obter a imagem correspondente. Aguarde até que o sinal inicial a desvanecer-se, até que um sinal claro e focado é visible.
- Grave um fluxo de sangue linha de base para um curto período de estabilização (~ 30 segundos). Em seguida, conectar-se a agulha outra seringa, contendo doxorrubicina ou soro fisiológico. IV administrar doxorrubicina a 100 ul de solução salina ou.
- Monitorar o fluxo de FITC-dextrano injectado continuamente durante 20 min. No software associado-FCFM, use o botão de diâmetro na régua superior, a fim de medir os vasos sanguíneos e categorizá-los como pequenos (<15 mm) ou grande (> 15 mm).
- Eutanásia do animal com anestesia overdose.
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Resultados
Em imagiologia contínua in vivo em tempo real
O aparelho de imagem usada aqui é uma alta definição, microscópio confocal fibered, equipado com uma sonda que permite a visualização da vascularização e a sua resposta a vários estímulos como a quimioterapia. Este método é minimamente invasivo, uma vez que, embora possa facilitar a imagiologia de vasos profundos ou órgão, que exige uma pequena incisão para a sonda. Os feixes de sonda consistem em dezenas de milhares de fibras ópti...
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Discussão
Avaliar a toxicidade vascular induzida por quimioterapia é um desafio devido à dificuldade em visualizar a dinâmica da vasculatura em resposta a um estímulo em tempo real. Numerosos estudos clínicos têm implicado que várias quimioterapias causar lesão vascular direta, mas o mecanismo e as características desta toxicidade ainda não foi esclarecido. Nós estabelecemos um tempo real, in vivo plataforma de imagem molecular para avaliar a toxicidade vascular potencial de quimioterapia em ratos que compreendem de micr...
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| anestesia geral | Fort Dodge Animal Health, IA, EUA e Biove Laboratories, França | 100 mg/kg de cetaset e 6 mg/kg de | |
| creme depilatório | ReckittBenckiser, Bristol, Reino Unido | ||
| 30 G, agulha de 1/2 polegada acoplada a uma seringa | |||
| FITC dextrano (10 mg/ml; MW 2.000 kDa) | Sigma | FD2000S | 100 μ l volume |
| Doxorrubicina | Teva, Israel | 8 mg/kg, Adriamicina | |
| paclitaxel | Taro, Israel | 1,2 mg/kg, solução | |
| salina |
Referências
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Reimpressões e permissões
