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Summary

This study demonstrates the successful establishment of magnetic resonance microscopy imaging as a non-invasive tool to assess the cardiac abnormalities in mice affected with autoimmune myocarditis. The data indicate that the technique can be used to monitor the disease-progression in live animals.

Abstract

Miocardite é uma inflamação do miocárdio, mas apenas ~ 10% dessas manifestações clínicas mostram afetados da doença. Para estudar os eventos imunológicos das lesões do miocárdio, vários modelos de mouse de miocardite têm sido amplamente utilizados. Este estudo envolveu experimental miocardite auto-imune (EAM) induzida com miosina cardíaca cadeia pesada (MyHC)-α 334-352 em camundongos A / J; os animais afetados desenvolvem miocardite linfocítica mas sem sinais clínicos aparentes. Neste modelo, a utilidade de microscopia de ressonância magnética (MRM) como uma modalidade não invasivo para determinar as alterações estruturais e funcionais do coração em animais imunizados com myhc-α 334-352 é mostrada. EAM e ratos saudáveis ​​foram fotografadas usando um 9.4 T (400 MHz) 89 milímetros scanner de núcleo furo vertical, equipado com uma sonda de imagem de rádio-freqüência 4 centímetros centopéia e 100 g / cm gradientes eixos triplos. Imagens cardíacos foram adquiridos a partir de animais anestesiados utilizando uma seqüência de pulsos cine-based gradiente-eco, ea animals foram monitorados pela respiração e oximetria de pulso. A análise revelou um aumento na espessura da parede ventricular em murganhos EAM, com uma diminuição correspondente no diâmetro interior dos ventrículos, quando comparados com os ratos saudáveis. Os dados sugerem que as alterações morfológicas e funcionais nos corações inflamadas pode ser monitorizada de forma não invasiva por MRM em animais vivos. Em conclusão, MRM oferece uma vantagem de avaliar a progressão e a regressão de lesões do miocárdio em doenças causadas por agentes infecciosos, como resposta às terapias.

Introduction

A insuficiência cardíaca é a principal causa de mortes, e miocardite é uma das causas predominantes de insuficiência cardíaca em jovens adolescentes ^1. A maioria dos pacientes afetados com miocardite permanecem assintomáticos e que a doença é resolvida espontaneamente ^2. No entanto, 10-20% das pessoas afetadas podem desenvolver doença crônica, levando a cardiomiopatia dilatada (DCM) ^3. Vários modelos animais têm sido desenvolvidos para estudar a patogénese imune miocardite. A doença pode ser induzida em miocardite suscetíveis A / J e ratinhos Balb / c através da imunização de animais com miosina cardíaca cadeia pesada (MyHC)-α ou os seus fragmentos de péptidos imunodominantes ou por infecção com agentes patogénicos como vírus coxsackie B3 ^4-9. Este estudo envolve myhc-α miocardite induzida-334-352 em ratinhos A / J. Apesar de mostrar infiltrações do miocárdio, os animais afetados por miocardite aparecem clinicamente normal; diagnóstico é baseado na avaliação histológica dos corações para a inflamação ⁷ aª ecocardiografia ^10.

Microscopia de ressonância magnética (MRM) é um método vulgarmente utilizado para obtenção de imagens de alta resolução cardiovascular com planos tridimensionais, permitindo que a avaliação de detalhes funcionais ao nível dos vasos sanguíneos pequenos (até 10 um de diâmetro), mas este nível de resolução de energia é não alcançável com a rotina de ressonância magnética (MRI) procedimento de digitalização, no qual, a resolução é geralmente obtida até 1 milímetro ^11-14. MRM oferece uma vantagem, pois permite a aquisição de imagens de alta resolução e também para obter os parâmetros de desempenho nos momentos iniciais do processo da doença ^14. Clinicamente, MRM imagem tem sido amplamente aplicado para estudar os parâmetros funcionais do doente coração, pulmão ou cérebro ^15-17. Neste estudo, o uso de uma técnica de MRM como um meio não-invasivo para determinar anomalias cardíacas em ratinhos A / J afectados com miocardite auto-imune é mostrado. Especificamente, tele MRM imagem permite a quantificação dos parâmetros funcionais, tais como ventrículo esquerdo (VE) volume diastólico final e fração de ejeção (EF) com uma precisão razoável ^18. As definições dos respectivos parâmetros são: o volume do ventrículo esquerdo que, o volume de sangue no ventrículo esquerdo no final do ciclo diastólica e fração de ejeção, o volume sistólico / volume diastólico final. A análise dos dados é realizada utilizando o software Segmento disponível gratuitamente desenvolvido para DICOM-compliant imagens cardiovasculares processamento adquiridos por scanners de ressonância magnética ^19. Os dados revelaram um aumento na espessura da parede do VE nos animais myocarditic, correspondendo a uma diminuição do volume diastólico final do VE, do volume sistólico e fração de ejeção, em comparação com esses parâmetros funcionais em ratos saudáveis.

Protocol

ÉTICA DECLARAÇÃO:

Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovado pela Universidade de Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE.

1. Indução da miocardite auto-imune experimental

1. Preparar a solução de péptidos por dissolução myhc-α 334-352 em solução salina 1x tamponada com fosfato até uma concentração final de 2 ml mg/1.5.
2. Prepare a toxina pertussis (PT) por adição de 1 ml de solução estéril de 1x PBS a um frasco contendo 50 ug de PT liofilizadas para se obter uma concentração de estoque de 50 ng / ul. Tomar 20 ul de estoque para um tubo esterilizado de 1,5 mL e adicionar 980 ul de 1x PBS estéril para obter uma concentração de trabalho de 1 ng / ul.
3. Prepare o adjuvante de Freund completo (CFA) pela adição de 40 mg de Mycobacterium tuberculosis H37Rv (MTB) extrair 10 ml de CFA para obter uma concentração finalde 5 mg / ml.
4. Preparar a emulsão de péptido-CFA. NOTA: Para a indução de EAM, a emulsão de péptido-CFA foi administrado em 150 ul contendo 100 ug de myhc-α 334-352 por animal. Por exemplo, para imunizar ratinhos dez utilizar 1,5 ml da emulsão de péptido-CFA contendo 1 mg de myhc-α 334-352.
   1. Para preparar 1,5 ml de emulsão, alíquota de 750 ul de myhc-α 334-352 solução de péptido em um tubo de 1,5 ml, e CFA suplementado com MTB num outro tubo de 1,5 ml. Utilizando uma seringa de 3 ml luer-lok, extrair a solução de péptido em primeiro lugar, seguido pelo extracto de CFA / MTB.
   2. Fixe a seringa a uma torneira de 3 vias e ligue a outra saída da torneira a um vazio de 3 ml seringa. Ajuste a desobstrução da torneira para que a mistura de péptidos-CFA flui de uma seringa para o outro com razoavelmente boa resistência.
   3. Misture, empurrando o conteúdo de uma seringa para o outro várias vezes para ~ 1 min e, em seguida, coloque todo o conjunto no gelo para a 3 min. Repita esteProcesso de um mínimo de 10x.
   4. Determinar a consistência da emulsão, colocando cuidadosamente uma pequena gota em água parada em um copo de 100 ml de vidro. Não se espera que a gotícula de dispersar em água. Se isso acontecer, continue misturando até que a consistência desejada seja atingida.
   5. Transferir o conteúdo do emulsão a partir de seringas de 3 ml em 1 ml seringas luer-lok de substituir uma das duas seringas de 3 ml ligados à torneira com a seringa de 1 ml, e anexar uma agulha 27 ½ G para a seringa de 1 ml.
5. Injectar 150 ul da emulsão de péptido-CFA em doses divididas por via subcutânea nas duas regiões inguinal de fêmeas de seis a oito semanas de idade, ratinhos A / J (~ 75 mL cada).
6. Administrar 100 ul de suspensão de PT (100 ng) por via intraperitoneal a cada um dos animais no dia 0 e no dia 2 após a imunização.
7. Repetir o procedimento de imunização, no dia 7, com a administração de 150 uL de péptido-CFA emulsão em doses divididas por via subcutânea em ambos os lados de tele esterno (~ 75 mL cada). Preparar esta emulsão fresco tal como acima. Em seguida, no dia 21, submeter os animais a imagem MRM, consulte a etapa 3.

2. Handling Animais

1. Coloque cada rato em uma câmara de indução anestésica contendo 2% de mistura de isoflurano ao ar com uma almofada de aquecimento colocada por baixo para manter o calor, e transferir o animal para um suporte de animais especialmente projetado (Figura 1).
2. Imobilizar o animal em decúbito ventral sobre o titular do animal para seu focinho se encaixa no cone do nariz para manter a anestesia (Figura 1). Proteja a cabeça do rato com uma mordida-bar fixados aos dentes da frente do mouse.
3. Ligue o aquecedor de sopro de ar com a sua mangueira de saída inserido no furo vertical do scanner para manter a temperatura do corpo do animal durante o experimento.
4. Manter a anestesia com 0,5 a 2% de isoflurano, com uma taxa de fluxo de 2 ml / min durante toda a sessão de imagem. Confirmaranestesia utilizando o método de aperto do dedo do pé, sem movimento esperado.
5. Configure um sensor pneumático travesseiro, rato cauda / tornozelo sensor de pulso de fibra óptica, oximetria e sonda de temperatura retal para monitorar a respiração, a freqüência cardíaca ea temperatura corporal, respectivamente (Figura 1). Nota: gating cardíaca é realizada através de oximetria de pulso, que permite o monitoramento não invasivo da saturação arterial de oxigênio no sangue. O sensor de oximetria de pulso deve ser anexado ao tornozelo esquerdo, eo pé devem ser fixados com um laço da linha e gravou para manter o tornozelo no sensor. Imagiologia MRM é alcançado pela passagem da respiração e os sinais cardíacos, sem o uso de quaisquer agentes de contraste.

3. Aquisição de Imagem

1. Depois de preparar o animal (Figura 1), colocar o rato no centro do scanner MRM com o coração está posicionado no centro do campo de visão (FOV), onde a homogeneidade do campo magnético é máximo. NOTA: Uma grande calibre(89 mm) 9.4 T vertical magneto equipado com gradientes de triplo eixo de 100 g / cm e 4cm de rádio-freqüência (RF) bobina de imagem é para ser usado para obter imagens de alta resolução tridimensional (3D). Nota: Certifique-se de suprimentos não-magnéticos ao usar um scanner de ressonância magnética.
2. Execute a interface de imagem e selecione "New Study" do menu "Opções de Estudo". Digite "mtune" na barra de comandos e executá-lo para puxar para cima o "GUI Tune". Em seguida, selecione "Start Probe Tune" e clique no botão "Escala automática". A GUI Tune será alterado para mostrar o RFsignal. Use os botões sintonizar / fósforo remotos no final da bobina para ajustar a bobina de RF com a frequência de ressonância do protão (400 MHz). Na guia "Iniciar" ir à página "Prescan" para executar a frequência e capacidade de calibração, clicando nos botões correspondentes. Aperte o botão XYZ (rápida) no "guia" de "Shim Estudo 'guia para puxar para cima a página de calços.Vá para a página de correção, selecione todas as iterações, e aperte o botão de correção para realizar auto calços.
3. Selecione uma seqüência olheiro na guia "Study" da interface de imagem para localizar o coração mouse. Na guia "Acquire" mudar o FOV a 35 mm ² e manter as configurações padrão da máquina. Clique em Iniciar para executar a seqüência; ajustar a posição do suporte do animal, se o coração não está no centro do campo de visão, sintonizar a bobina RF e obter as imagens escuteiro novamente.
4. Clique no botão seqüência "GEMS" na guia "Estudo", em seguida, digite os parâmetros de aquisição na aba "Acquire" correspondentes para obter dois planos ortogonais ao longo do eixo curto e eixo longo do coração ^20,21. NOTA: os parâmetros de aquisição típicos para uma varredura gradiente-eco são: espessura do corte, a 1 mm; tempo de repetição (TR), a 200 ms; tempo de eco (TE), 2,67 ms (mínimo); ângulo de inclinação de 25 °; inplane tamanho da matriz, de 128 x 128; FOV, 22 milímetros^2; número de aquisições, 4; e um tempo de aquisição de cerca de 1 min e 30 seg.
5. Na aba "Avançado", selecione a seqüência "CINE" para recolher os eixos curto cine imagens fechado-oximetria de pulso de RM, a fim de medir os parâmetros anatômicos e funcionais do VE. Ajuste a posição eo ângulo das fatias de imagem baseada na visão de longo eixo do coração por pairando do mouse e arrastando. Digite os seguintes parâmetros de imagem na guia "Acquire" para obter o gradiente echo seqüência cine: TR, a 500 ms; TE, 5 milissegundos; FOV de 22 mm ^2; matriz de aquisição, de 256 x 256; espessura de corte, a 1 mm; número de aquisições, 8; número de quadros, 6; e um tempo de aquisição de ~ 17 min. Clique em Iniciar para iniciar a aquisição.
6. Converter as imagens adquiridas para o formato DICOM usando a guia "I / O" do software de imagens e transferir os arquivos correspondentes ao centro de dados para processamento.
7. No final do procedimento de imagiologia, todosow os ratos para se recuperar da anestesia dentro do filtro-top gaiolas. Não deixe os ratos autônoma até que recuperar a consciência suficiente para manter decúbito esternal e mantê-los para estudos posteriores, conforme necessário.

4. Análise de Dados de Ressonância Magnética Cardíaca Microscopia de imagem

1. Use um software de Segmento de analisar os parâmetros anatômicos e funcionais do VE ^19. Ao carregar as imagens no formato DICOM cine para o software usando o "Arquivo de Imagem Aberto (s)" submenu do menu "Arquivo". Na GUI selecione 'MRGE ", como a técnica de imagem,' Cine ', como o tipo de imagem e' de eixo curto médio-ventricular", como o plano de exibição de imagem.
2. Especificar os prazos a serem utilizados para o final de diástole e final da sístole, através da "Definir Prazo atual para Acabar com Diástole" e "Set Prazo atual para Acabar sístole" submenus do menu "Editar", respectivamente.
3. Primeiro, clique no botão de comando "LV" e depois o "PAI" botões de comando no painel inferior direito "ENDO" e desenhar manualmente o endocárdio do ventrículo esquerdo e epicárdio respectivamente. Retire os músculos papilares por apertar o botão de comando correspondente, a fim de aumentar a precisão dos cálculos.
4. Leia os parâmetros quantificados LV como volume diastólica, volume sistólico, do volume sistólico e fração de ejeção no painel superior direito. Clique no botão de comando "Diversos" e, em seguida, o botão de comando "Medida Caliper" para medir os parâmetros do LV, como espessura da parede e diâmetro ventricular ^22.
5. Clique no botão "Salvar Imagem Ambos Pilhas e Segmentação" submenu do menu "Arquivo" para salvar as imagens, incluindo as segmentações, no formato '. Mat' para reprocessar as imagens, se necessário.

Representative Results

Discussion

Este estudo descreve o procedimento MRM e sua utilidade como uma ferramenta não-invasiva para determinar anormalidades cardíacas em ratos afetados com miocardite auto-imune. Desde as características histológicas de EAM assemelham miocardite pós-infecciosa dos seres humanos, modelos de mouse são comumente empregados para delinear os mecanismos imunológicos de lesão miocárdica ^23-25. No entanto, os animais afetados com miocardite aparecem clinicamente normal, eo diagnóstico é feito com base na histologia, ao término de experimentos ^7. Os animais são geralmente sacrificados no dia 21 após a imunização. Avaliar o processo da doença, desta forma em vez de pontos limites único uso destes modelos, em especial em pesquisa farmacêutica, quando a monitorização da progressão da doença em resposta aos tratamentos é um requisito essencial.

Para verificar anormalidades cardíacas em animais vivos, o uso de modalidades não-invasivas, como MRM é útil. A técnica que se descreveu aqui MRMoferece uma vantagem de se obter as características estruturais e funcionais do coração, sem a necessidade de utilização de agentes de contraste. No entanto, esta técnica requer aquisição de imagens de alta resolução anatômicos em 3D em campos magnéticos fortes. No entanto, uma vez que as imagens são adquiridas, os parâmetros funcionais, tais como volumes diastólica final do VE e fração de ejeção pode ser analisado mais tarde através de software disponível comercialmente, sem a necessidade de montar ainda mais o aparelho MRM. Como mostrado na Figura 2, MRM exame de animais imunizados com myhc-α 334-352 revelou espessura da parede ventricular esquerda ser maior do que em ratinhos saudáveis ​​(Figura 2B), com uma diminuição correspondente na saídas funcionais (volume diastólico final LV e fracções de ejecção A Figura 2C). Como esperado, a partir de corações imunizados, mas não saudável, os animais tiveram infiltrados inflamatórios (Figura 2D). Assim, os resultados da técnica de MRM e histologia corroborate outro.

No entanto, para se obter resultados reprodutíveis por MRM, três fatores precisam ser abordadas. (A) Os animais devem ser colocados no modo de scanner MRM corações estão posicionados no centro do magneto expô-los para o campo magnético com o máximo de homogeneidade. (B) Proposta artefato é uma preocupação em experiências com animais vivos. Para diminuir a desfocagem da imagem devido a respiração e os movimentos cardíacos, oximetria de pulso e respirometria foram utilizados para portão MRM aquisição, ou seja, para adquirir sinais de imagem distintas em momentos específicos dentro do respiratórias e ciclos de que cardíacos necessários o uso de um sistema de monitoramento de animais . (C) Aquisição de imagens de alta resolução cardíacos 3D é um requisito essencial para permitir a análise detalhada das anomalias cardíacas. Para obter imagens em três dimensões, e para aumentar a relação sinal-para-ruído, é importante conceber bobinas de imagem mais sensíveis específicos para MRM que permitam precisas e COMpleta captura de imagens em campos magnéticos fortes em uma orientação de eixo curto dentro dos scanners animais.

Em conclusão, o desenvolvimento de uma técnica de MRM para avaliar anomalias cardíacas em animais vivos é um desafio. Isto é especialmente verdadeiro para os ratos, por causa de seus tamanhos cardíacos menores (~ 1/2, 000 a massa de um coração humano) e freqüência cardíaca mais elevada (~ 600 batidas por minuto) em comparação com os seres humanos ^26. No entanto, uma vez desenvolvido e validado, a técnica MRM pode ser usado para comparar as alterações anatômicas e funcionais do coração entre os animais saudáveis ​​e doentes. Assim, a técnica MRM poderia servir como uma valiosa ferramenta, não-invasivo para avaliar a progressão longitudinal de patologias cardíacas inflamatórios relacionados tanto a natureza aguda e crônica do processo da doença, e para monitorar respostas às terapias em animais vivos.

Materials

Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)	Neopeptide, Cambridge, MA		Store at 4 °C
CFA	Sigma Aldrich, St Louis, MO	5881	Store at 4 °C
MTB H37Rv extract	Difco Laboratories, Detroit, MI	231141	Store at 4 °C
PT	List Biologicals Laboratories, Campbell, CA	181	Store at 4 °C
1x PBS	Corning, Manassas, VA	21-040-CV	Store at 4 °C
Isoflurane	Piramal Healthcare, Mumbai, India	NDC66794-013-25
Female A/J mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME	646
Luer-lok sterile 1 ml syrringe	BD, Franklin Lakes, NJ	309628
Luer-lok sterile 3 ml syrringe	BD, Franklin Lakes, NJ	309657
Sterile needle, 18 G	BD, Franklin Lakes, NJ	305195
Sterile needle, 27 1/2 G	BD, Franklin Lakes, NJ	305109
3-way stopcock	Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH	MX5311L
Kerlix gauze bandage rolls	Covidien, Mansfield, MA	6720
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA	34155
Protouch Stockinette	Medline Industries, Mundelein, IL	30-1001
Sterile surgical scissors and forceps	INOX tool Corporation
Micro oven	GE Healthcare, 
ThermiPAQ hot and cold therapy system 	Theramics Corporation, Springfield, IL
Reptile heating lamp	Energy Savers Unlimited, Inc. Carson, CA
3M Transpore tapes	Target Corporation, MN
Up and Up Polymyxin B sulfate/Bacitracin/Neomycin sulfate antibiotic ointment	Target Corporation, MN
North Safety DeciDamp-2PVC foam ear plugs	North Safety Products, Smithfield, RI
Cotton tipped applicator, 6’’ wooden stem 	Jorgensen Laboratories, Inc. Loveland, CO
Anesthesia induction chamber 	Summit Anesthesia Solutions, Ann Harbor, MI
Summit Anesthesia Support system for regulating flow of anesthesia 	Summit Anesthesia Solutions, Ann Harbor, MI
Specially designed animal holder	Agilent Technologies, Santa Clara, CA
Bickford Omnicon F/Air anesthesia gas filter unit 	A.M. Bickford, Inc. Wales Center, NY
Pulse-oximeter module, MR compatible small animal monitoring and gating system 	Small Animal Instruments, Inc. Stony Brook, NY
Oxygen cylinder 	Matheson-Tri Gas, North-Central Zone, Lincoln, NE
Gas regulator 	Western Medica, West Lake, OH
Signal breaking module, MR compatible small animal monitoring and gating system	Small Animal Instruments, Inc. Stony Brook, NY
9.4 T (400 MHz) 89 mm vertical core bore MR scanner	Agilent Technologies, Santa Clara, CA
4 cm millipede micro-imaging RF coil	Agilent Technologies, Santa Clara, CA
SAM PC monitor	Small Animal Instruments, Inc. Stony Brook, NY
Quantitative Medical Image analysis software	http://segment.heiberg.se;  Segment v1.8 R1430,  Medviso, Oresunds region, Sweden
Matlab software	The Mathworks, Inc.  Natick, MA
Computer-Unix operating system