Avaliação não invasiva da Cardiac Anormalidades em Experimental Auto-imune Miocardite por Ressonância Magnética Microscopia de imagem no Rato

O objetivo geral deste procedimento é identificar anormalidades funcionais cardíacas por meio da obtenção de imagens dos corações em animais vivos afetados por doença cardíaca inflamatória. Isso é realizado primeiramente induzindo a doença, por exemplo, miocardite. O segundo passo é preparar o animal para a imagem por microscopia de ressonância magnética e posicioná-lo no suporte para animais.

Em seguida, o camundongo é colocado dentro do ímã para a aquisição das imagens cardíacas. O passo final consiste em analisar os parâmetros funcionais cardíacos utilizando o software Segment. Em última análise, esta técnica é usada para calcular o volume diastólico final e a fração de ejeção em camundongos afetados por miocardite autoimune.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a histopatologia, é que ela é não invasiva e fornece uma visão tridimensional de alta resolução do coração. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de cardiologia envolvendo o diagnóstico de doenças cardíacas inflamatórias. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica enfrentam dificuldades devido à falta de familiaridade com o preparo de animais para a aquisição de imagens por microscopia de ressonância magnética.

Portanto, a demonstração visual deste método é essencial. Inicie este protocolo preparando primeiro uma solução peptídica para induzir miocardite autoimune, dissolvendo o peptídeo da cadeia pesada alfa da miosina cardíaca 334 a 352 em solução salina tamponada com fosfato até uma concentração final de dois miligramas por 1,5 mililitro. Em seguida, prepare a toxina da coqueluche adicionando um mililitro de solução salina tamponada com fosfato estéril 1x a um frasco contendo 50 microgramas de toxina da coqueluche liofilizada.

Para obter uma concentração estoque de 50 nanogramas por microlitro. Em seguida, retire 20 microlitros do estoque em um tubo estéril de 1,5 mililitro e adicione 980 microlitros de solução salina tamponada com fosfato estéril 1x para obter uma concentração de trabalho de 1 nanograma por microlitro. Prepare também o adjuvante completo de Freund ou CFA, adicionando 40 miligramas de extrato de Mycobacterium tuberculosis H37RV ou MTB a 10 mililitros de CFA para obter uma concentração final de 5 miligramas por mililitro.

Agora prepare a emulsão de CFA para preparar uma alíquota de 1,5 mililitro de emulsão: coloque 750 microlitros da solução do pept&ídio da cadeia pesada alfa da miosina cardíaca, pept&ídio 3 34 a 3 52, em um tubo de 1,5 mililitro e al&íquot;e um volume igual de CFA suplementado com extrato de MTB em outro tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, utilizando uma seringa de 3 mililitros com trava de encaixe, aspire primeiro a solução do pept&ídio, seguida pelo extrato de C-F-A-M-T-B. Fixe a seringa a uma válvula de três vias e conecte a outra sa&íacute;da da válvula a uma seringa vazia de 3 mililitros.

Ajuste o lúmen aberto do tubo de conexão. De modo que a mistura de peptídeo e adjuvante completo de Freund flua de uma seringa para a outra com resistência razoavelmente boa. Misture empurrando o conteúdo de uma seringa para a outra repetidamente por cerca de um minuto, e então coloque todo o conjunto em gelo por aproximadamente três minutos.

Repita este procedimento no mínimo 10 vezes. Determine a consistência da emulsão colocando cuidadosamente uma pequena gota em água parada em um copo de vidro de 100 mililitros. A gota não deve se dispersar na água; caso contrário, continue misturando até que a consistência desejada seja alcançada.

Transfira o conteúdo da emulsão de três seringas de três mililitros para uma seringa de um mililitro. Conecte a seringa de um mililitro substituindo uma das duas seringas de três mililitros ligadas à torneira de três vias pela seringa de um mililitro. Em seguida, acople uma agulha de 27 e meia polegadas.

Injete 150 microlitros da emulsão de peptídeo CFA em doses divididas por via subcutânea nas duas regiões inguinais de camundongos fêmeas aj de seis a oito semanas de idade. Em seguida, administre 100 microlitros de suspensão de toxina da pertússis por via intraperitoneal a cada animal no dia zero e no dia dois após a imunização. Repita o procedimento de imunização no dia sete, administrando 150 microlitros da emulsão de peptídeo CFA em doses divididas por via subcutânea em ambos os lados do esterno.

Prepare esta emulsão fresca conforme descrito. Em seguida, no dia 21, submeta os animais à imagem por RMI para preparação para a aquisição de imagens. Primeiro, coloque cada camundongo em uma câmara de indução anestésica contendo uma mistura de ar com 2% de ISO e um tapete aquecido para manter o calor.

Em seguida, transfira o animal para um suporte para animais especialmente projetado. Fixe a cabeça com uma barra de mordida para imobilizar o animal em posição prona. O focinho deve encaixar-se no cone nasal para manter a anestesia.

Ligue o aquecedor de ar com sua mangueira de saída inserida na placa vertical do scanner para manter a temperatura corporal do animal durante o experimento. Mantenha a anestesia com 1 a 2% de isoflurano com uma taxa de fluxo de dois mililitros por minuto durante toda a sessão de imagem. Confirme a anestesia realizando um aperto no dedo do pé.

Em seguida, configure um sensor pneumático de almofada e uma sonda de temperatura retal para monitorar a respiração e a temperatura corporal durante toda a sessão de imagem. Um sensor de oximetria de pulso de fibra óptica também deve ser fixado no tornozelo esquerdo, e o pé deve ser imobilizado com um laço de fio e fixado com fita adesiva para manter a posição. A aquisição de imagens será realizada por meio do sincronismo dos sinais respiratório e cardíaco, sem o uso de agentes de contraste.

Um magneto vertical de 9,4 Tesla com furo largo deve ser utilizado para obter imagens tridimensionais de microscopia por ressonância magnética de alta resolução. Após preparar o animal, posicione o camundongo no escâner com o coração no centro do campo de visão. Em seguida, execute a interface de imagem, selecione o novo tipo de estudo no menu na barra de comandos, abra a página de ajuste e selecione iniciar sonda, ajuste e escala automática.

Use os botões de ajuste remoto no final da bobina para sintonizar a bobina de RF na frequência de ressonância do próton de 400 megahertz. Em seguida, vá até a página de pré-varredura. Para executar a calibração de frequência e potência, pressione o botão rápido X, Y, Z para abrir a página de shim.

Em seguida, selecione todas as iterações e realize o shim automático. Selecione uma sequência de reconhecimento. Altere o campo de visão para 35 milímetros.

Mantenha as outras configurações padrão e execute a sequência. Se o coração não estiver no centro do campo de visão, ajuste a posição do suporte do animal, reajuste a bobina de RF e reaquisicione a imagem de orientação. Em seguida, selecione a sequência gem.

Insira os parâmetros de aquisição mostrados aqui na guia "aquisição" para obter dois planos ortogonais ao longo dos eixos curto e longo do coração. Em seguida, selecione a sequência cine para coletar as imagens cine do eixo curto com oximetria de pulso e mensurar os parâmetros anatômicos e funcionais do ventrículo esquerdo. Insira os parâmetros mostrados aqui para obter a sequência cine de gradiente eco.

Ajuste a posição e o ângulo dos cortes de imagem com base na visão do eixo longo do coração. Em seguida, execute a sequência. Após a conclusão da aquisição de imagens.

Converta as imagens adquiridas para o formato DICOM utilizando a guia IO e transfira os arquivos correspondentes para o centro de dados para processamento. Ao final do procedimento de imagem, permita que o animal se recupere da anestesia dentro de uma gaiola com tampa filtrada. Não deixe o camundongo sozinho até que ele recupere consciência suficiente para manter a posição esternal recumbente.

Aqui, utiliza-se um software de segmentação para analisar os parâmetros anatômicos e funcionais do ventrículo esquerdo. Comece carregando as imagens dinâmicas no formato DICOM no software. Em seguida, selecione MRGE como a técnica de imagem, dinâmica como o tipo de imagem e eixo curto no nível mesocavitário ventricular.

Como plano da imagem, especifique os intervalos de tempo a serem utilizados para o final da diástole e o final da sístole usando os submenus definir intervalo de tempo atual como final da diástole e definir intervalo de tempo atual como final da sístole do menu editar, respectivamente. Em seguida, use os botões de comando VE e depois endo e EPI no painel inferior direito. Para desenhar manualmente o ventrículo esquerdo, endocárdio e epicárdio, respectivamente, remova os músculos papilares pressionando o botão de comando correspondente.

Para aumentar a precisão dos cálculos, leia os parâmetros quantificados do ventrículo esquerdo, como volume diastólico, volume sistólico, volume sistólico e fração de ejeção, no painel superior direito. Em seguida, use o botão de comando mis e depois o botão de comando do paquímetro de medição para medir os parâmetros do ventrículo esquerdo, como espessura da parede e diâmetro ventricular. Por fim, certifique-se de usar a opção salvar ambas as pilhas de imagens e a segmentação para salvar as imagens, incluindo as segmentações em formato dot mat, a fim de reprocessar as imagens conforme necessário.

O ângulo no qual o coração foi seccionado para a aquisição da imagem na vista de duas câmaras pode ser visto aqui. Aqui podemos observar um aumento aproximado de 1,5 vez na espessura do ventrículo esquerdo, indicando defeitos estruturais nos corações de camundongos afetados pela miocardite autoimune em comparação com camundongos saudáveis. O débito cardíaco, medido com base no volume diastólico e na fração de ejeção do ventrículo esquerdo, foi reduzido em camundongos afetados pela miocardite autoimune em comparação com camundongos saudáveis.

Por fim, os corações dos grupos tratados acima foram avaliados quanto à inflamação por meio da coloração com hematoxilina e eosina. A avaliação histológica dos corações de camundongos com miocardite, mas não dos saudáveis, revelou infiltrados multifocais de linfócitos. Ao realizar este procedimento, é importante garantir que a temperatura corporal do animal permaneça constante, para que a frequência cardíaca e a frequência respiratória não se alterem significativamente durante os experimentos. Isso é essencial para obter resultados reprodutíveis.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter um bom entendimento da técnica de microscopia por ressonância magnética para avaliar as anormalidades funcionais de doenças cardíacas inflamatórias como a miocardite em camundongos. Mas não se esqueça de que trabalhar com campos magnéticos elevados pode ser extremamente perigoso, portanto o suporte para o animal e outros componentes devem ser não magnéticos.