Avaliação não invasiva da Cardiac Anormalidades em Experimental Auto-imune Miocardite por Ressonância Magnética Microscopia de imagem no Rato

O objetivo geral deste procedimento é verificar anormalidades funcionais cardíacas por meio de imagens dos corações em animais vivos afetados com doença cardíaca inflamatória. Isso é feito induzindo primeiro a doença, por exemplo, miocardite. O segundo passo é preparar o animal para a imagem de microscopia de ressonância magnética e colocá-lo no suporte do animal.

Em seguida, o mouse é colocado dentro do ímã para adquirir as imagens cardíacas. A etapa final é analisar os parâmetros funcionais cardíacos usando o software do segmento. Em última análise, esta técnica é usada para calcular o volume diastólico final e a fração de ejeção em camundongos afetados por miocardite autoimune.

A principal vantagem dessa técnica sobre o método existente, como a histopatologia, é que ela não é invasiva e fornece uma visão tridimensional de alta resolução do coração. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da cardiologia envolvendo o diagnóstico de doença cardíaca inflamatória. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades devido à falta de familiaridade com a preparação de animais para a aquisição de microimagens por ressonância magnética.

Portanto, a demonstração visual desse método é crítica. Comece este protocolo preparando primeiro uma solução peptídica para induzir miocardite autoimune, dissolver o peptídeo alfa de cadeia pesada da miosina cardíaca 3 34 a 3 52 em solução salina tamponada com fosfato até uma concentração final de dois miligramas por 1,5 mililitros. Em seguida, prepare a toxina da coqueluche adicionando um mililitro de solução salina estéril tamponada com um x fosfato a um frasco contendo 50 microgramas de toxina da coqueluche liofilizada.

Obter uma concentração de estoque de 50 nanogramas por microlitro. Em seguida, coloque 20 microlitros do caldo em um tubo estéril de 1,5 mililitro e adicione 980 microlitros de solução salina estéril tamponada com fosfato para obter uma concentração de trabalho de um nanograma por microlitro. Prepare também adjuvante completo ou CFA adicionando 40 miligramas de tuberculose micobacteriana, H 37 RV ou extrato de MTB a 10 mililitros de CFA para obter uma concentração final de cinco miligramas por mililitro.

Agora prepare a emulsão peptídica CFA para preparar 1,5 mililitros de alíquota de emulsão, 750 microlitros de solução de peptídeo alfa de cadeia pesada de miosina cardíaca 3 34 a 3 52 em um tubo de 1,5 mililitro e alíquota de um volume igual de CFA suplementado com extrato de MTB em outro tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, usando uma seringa de bloqueio de isca de três mililitros, retire a solução peptídica primeiro, seguida pelo extrato de CFAMT. Conecte a seringa a uma torneira de parada de três vias e conecte a outra saída da torneira de parada a uma seringa vazia de três mililitros.

Ajuste o mar patenteado da torneira de parada. Assim, a mistura de peptídeo CFA flui de uma seringa para a outra com resistência razoavelmente boa. Misture empurrando o conteúdo de uma seringa para a outra repetidamente por cerca de um minuto e, em seguida, coloque todo o conjunto no gelo por aproximadamente três minutos.

Repita este procedimento no mínimo 10 vezes. Determine a consistência da emulsão colocando cuidadosamente uma pequena gota em água sem gás em um alto-falante de vidro de 100 mililitros. A gota não deve se dispersar na água se continuar misturando até que a consistência desejada seja alcançada.

Transfira o conteúdo da emulsão de seringas de três mililitros para um mililitro. Atraia as seringas de bloqueio substituindo uma das duas seringas de três mililitros presas à torneira de parada pela seringa de um mililitro. Em seguida, coloque uma agulha de calibre 27 e meio.

Injetar 150 microlitros da emulsão do peptídeo CFA em doses fracionadas por via subcutânea nas duas regiões inguinais de fêmeas de seis a oito semanas de idade. Os camundongos então administram 100 microlitros de suspensão de toxina pertussis intraperitoneal a cada animal no dia zero e no segundo dia após a imunização. Repita o procedimento de imunização no sétimo dia, administrando 150 microlitros de emulsão de peptídeo CFA em doses divididas por via subcutânea em ambos os lados do esterno.

Prepare esta emulsão fresca conforme descrito. Então, no dia 21, submeta os animais a imagens MRM Para se preparar para a imagem. Primeiro, coloque cada camundongo em uma câmara de indução anestésica contendo uma mistura de ar de flúor 2% ISO com uma almofada de aquecimento para manter o calor.

Em seguida, transfira o animal para um suporte de animal especialmente projetado. Prenda a cabeça com uma barra de mordida para imobilizar o animal em decúbito ventral. O focinho deve caber no cone do nariz Para manter a anestesia.

Ligue o aquecedor de ar com sua mangueira de saída inserida no javali vertical do scanner para manter a temperatura corporal do animal durante o experimento. Mantenha a anestesia de um a 2% de flúor com uma taxa de fluxo de dois mililitros por minuto durante toda a sessão de imagem. Confirme a anestesia realizando uma pinça no dedo do pé.

Em seguida, configure um sensor pneumático de travesseiro e uma sonda de temperatura retal para monitorar a respiração e a temperatura corporal durante toda a sessão de imagem. Um sensor de oximetria de pulso de fibra óptica também deve ser conectado ao tornozelo esquerdo e o pé deve ser preso com um laço de linha e colado para manter a posição. A imagem será obtida por meio da respiração e dos sinais cardíacos sem o uso de nenhum agente de contraste.

Um ímã de furo vertical de 9,4 Tesla de diâmetro largo deve ser usado para obter imagens de microscopia de ressonância magnética tridimensional de alta resolução. Depois de preparar o animal, coloque o mouse no scanner com o coração posicionado no centro do campo de visão. Em seguida, execute a interface de imagem e selecione o novo tipo de estudo mune na barra de comandos e abra a página de ajuste e, em seguida, selecione iniciar sonda, ajuste e dimensionamento automático.

Use os botões de sintonia remota na extremidade da bobina para sintonizar a bobina de RF para a frequência de ressonância de prótons de 400 megahertz. Em seguida, vá para a página de pré-verificação. Para executar a calibração de frequência e potência, pressione o botão rápido x, Y, Z para abrir a página de calços.

Em seguida, selecione todas as iterações e execute o calço automático. Selecione uma sequência de batedores. Altere o campo de visão para 35 milímetros.

Mantenha outras configurações padrão e execute a sequência. Se o coração não estiver no centro do campo de visão, ajuste a posição do suporte do animal, sintonize novamente a bobina de RF e readquira o batedor. Em seguida, selecione a sequência de gemas.

Insira os parâmetros de aquisição vistos aqui na guia de aquisição para obter dois planos ortogonais ao longo do eixo curto e longo do coração. Em seguida, selecione a sequência cine para coletar as imagens cine de eixo curto do medidor de oximetria de pulso e medir os parâmetros anatômicos e funcionais do ventrículo esquerdo. Insira os parâmetros vistos aqui para obter a sequência de cine gradiente eco.

Ajuste a posição e o ângulo das fatias de imagem com base na visão do eixo longo do coração. Em seguida, execute a sequência. Assim que a imagem estiver completa.

Converta as imagens adquiridas para o formato DICOM usando a guia IO e transfira os arquivos correspondentes para o data center para processamento. No final do procedimento de imagem, permita que o animal se recupere da anestesia dentro de uma gaiola superior com filtro. Não deixe o rato sem vigilância até que ele recupere a consciência suficiente para manter o esterno reclinado.

Aqui, o software de segmento é usado para analisar os parâmetros anatômicos e funcionais do ventrículo esquerdo. Comece carregando o formato DICOM, imagens de cinema no software. Em seguida, selecione MRGE como técnica de imagem, cine como tipo de imagem e eixo médio ventrículo médio.

Como plano de visualização da imagem, especifique os períodos de tempo a serem usados para o final da diástole e o fim da sístole usando os submenus definir o período de tempo atual para o final da diástole e definir o período de tempo atual para o final da sístole do menu de edição, respectivamente. Em seguida, use o LV e, em seguida, os botões de comando endo e EPI no painel inferior direito. Para desenhar manualmente o ventrículo esquerdo, endocárdio e epicárdio, respectivamente, remova os músculos papilares pressionando o botão de comando correspondente.

Para aumentar a precisão dos cálculos, leia os parâmetros quantificados do ventrículo esquerdo, como volume diastólico, volume sistólico, volume sistólico e fração de ejeção no painel superior direito. Em seguida, use o botão de comando mis e, em seguida, o botão de comando do paquímetro de medição para medir os parâmetros do ventrículo esquerdo, como espessura da parede e diâmetro ventricular. Por fim, certifique-se de usar a opção salvar pilhas de imagens e segmentação para salvar as imagens, incluindo as segmentações no formato dot mat, para reprocessar as imagens conforme necessário.

O ângulo em que o coração foi cortado para a aquisição da imagem de duas câmaras pode ser visto aqui. Aqui podemos ver um aumento aproximado de 1,5 vezes na espessura do ventrículo esquerdo, indicando defeitos estruturais nos corações da miocardite autoimune experimental afetada em comparação com camundongos saudáveis. O débito cardíaco medido com base no ventrículo esquerdo e no volume diastólico e na fração de ejeção diminuiu em camundongos afetados por miocardite autoimune em comparação com camundongos saudáveis.

Finalmente, os corações dos grupos de tratamento acima foram avaliados quanto à inflamação por hemat, toin e avaliação histológica de eosina de corações de miocardite, mas não camundongos saudáveis mostraram infiltrados de linfócitos multifocais. Ao tentar este procedimento, é importante garantir que a temperatura corporal do animal permaneça constante para que a frequência cardíaca e respiratória não mudem significativamente durante os experimentos. Isso é fundamental para obter resultados reprodutíveis.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento da técnica microscópica de ressonância magnética para avaliar as anormalidades funcionais de doenças cardíacas inflamatórias, como miocardite e camundongos. Mas não se esqueça de que trabalhar com campos magnéticos altos pode ser extremamente perigoso, portanto, o suporte do animal e outros componentes devem ser não magnéticos.