Name: Avaliação não invasiva da Cardiac Anormalidades em Experimental Auto-imune Miocardite por Ressonância Magnética Microscopia de imagem no Rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Aprenda a avaliar anormalidades cardíacas em camundongos com miocardite autoimune usando ressonância magnética microscópica não invasiva. Este método permite monitorar a progressão da doença em animais vivos.

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Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (HL114669). CM recebeu uma bolsa de pesquisa de pós-doutorado concedida pela Myocarditis Foundation, NJ.

ÉTICA DECLARAÇÃO: Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovado pela Universidade de Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE. 1. Indução da miocardite auto-imune experimental <ol><li> Preparar a solução de péptidos por dissolução myhc-α 334-352 em solução salina 1x tamponada com fosfato até uma concentração final de 2 ml mg/1.5. </li><li> Prepare a toxina pertussis (PT) por adição de 1 ml de solução estéril de 1x PBS a um frasco contendo 50 ug de PT liofilizadas para se obter uma concentração de estoque de 50 ng / ul. Tomar 20 ul de estoque para um tubo esterilizado de 1,5 mL e adicionar 980 ul de 1x PBS estéril para obter uma concentração de trabalho de 1 ng / ul. </li><li> Prepare o adjuvante de Freund completo (CFA) pela adição de 40 mg de Mycobacterium tuberculosis H37Rv (MTB) extrair 10 ml de CFA para obter uma concentração finalde 5 mg / ml. </li><li> Preparar a emulsão de péptido-CFA. NOTA: Para a indução de EAM, a emulsão de péptido-CFA foi administrado em 150 ul contendo 100 ug de myhc-α 334-352 por animal. Por exemplo, para imunizar ratinhos dez utilizar 1,5 ml da emulsão de péptido-CFA contendo 1 mg de myhc-α 334-352. <ol><li> Para preparar 1,5 ml de emulsão, alíquota de 750 ul de myhc-α 334-352 solução de péptido em um tubo de 1,5 ml, e CFA suplementado com MTB num outro tubo de 1,5 ml. Utilizando uma seringa de 3 ml luer-lok, extrair a solução de péptido em primeiro lugar, seguido pelo extracto de CFA / MTB. </li><li> Fixe a seringa a uma torneira de 3 vias e ligue a outra saída da torneira a um vazio de 3 ml seringa. Ajuste a desobstrução da torneira para que a mistura de péptidos-CFA flui de uma seringa para o outro com razoavelmente boa resistência. </li><li> Misture, empurrando o conteúdo de uma seringa para o outro várias vezes para ~ 1 min e, em seguida, coloque todo o conjunto no gelo para a 3 min. Repita esteProcesso de um mínimo de 10x. </li><li> Determinar a consistência da emulsão, colocando cuidadosamente uma pequena gota em água parada em um copo de 100 ml de vidro. Não se espera que a gotícula de dispersar em água. Se isso acontecer, continue misturando até que a consistência desejada seja atingida. </li><li> Transferir o conteúdo do emulsão a partir de seringas de 3 ml em 1 ml seringas luer-lok de substituir uma das duas seringas de 3 ml ligados à torneira com a seringa de 1 ml, e anexar uma agulha 27 ½ G para a seringa de 1 ml. </li></ol></li><li> Injectar 150 ul da emulsão de péptido-CFA em doses divididas por via subcutânea nas duas regiões inguinal de fêmeas de seis a oito semanas de idade, ratinhos A / J (~ 75 mL cada). </li><li> Administrar 100 ul de suspensão de PT (100 ng) por via intraperitoneal a cada um dos animais no dia 0 e no dia 2 após a imunização. </li><li> Repetir o procedimento de imunização, no dia 7, com a administração de 150 uL de péptido-CFA emulsão em doses divididas por via subcutânea em ambos os lados de tele esterno (~ 75 mL cada). Preparar esta emulsão fresco tal como acima. Em seguida, no dia 21, submeter os animais a imagem MRM, consulte a etapa 3. </li></ol> 2. Handling Animais <ol><li> Coloque cada rato em uma câmara de indução anestésica contendo 2% de mistura de isoflurano ao ar com uma almofada de aquecimento colocada por baixo para manter o calor, e transferir o animal para um suporte de animais especialmente projetado (Figura 1). </li><li> Imobilizar o animal em decúbito ventral sobre o titular do animal para seu focinho se encaixa no cone do nariz para manter a anestesia (Figura 1). Proteja a cabeça do rato com uma mordida-bar fixados aos dentes da frente do mouse. </li><li> Ligue o aquecedor de sopro de ar com a sua mangueira de saída inserido no furo vertical do scanner para manter a temperatura do corpo do animal durante o experimento. </li><li> Manter a anestesia com 0,5 a 2% de isoflurano, com uma taxa de fluxo de 2 ml / min durante toda a sessão de imagem. Confirmaranestesia utilizando o método de aperto do dedo do pé, sem movimento esperado. </li><li> Configure um sensor pneumático travesseiro, rato cauda / tornozelo sensor de pulso de fibra óptica, oximetria e sonda de temperatura retal para monitorar a respiração, a freqüência cardíaca ea temperatura corporal, respectivamente (Figura 1). Nota: gating cardíaca é realizada através de oximetria de pulso, que permite o monitoramento não invasivo da saturação arterial de oxigênio no sangue. O sensor de oximetria de pulso deve ser anexado ao tornozelo esquerdo, eo pé devem ser fixados com um laço da linha e gravou para manter o tornozelo no sensor. Imagiologia MRM é alcançado pela passagem da respiração e os sinais cardíacos, sem o uso de quaisquer agentes de contraste. </li></ol> 3. Aquisição de Imagem <ol><li> Depois de preparar o animal (Figura 1), colocar o rato no centro do scanner MRM com o coração está posicionado no centro do campo de visão (FOV), onde a homogeneidade do campo magnético é máximo. NOTA: Uma grande calibre(89 mm) 9.4 T vertical magneto equipado com gradientes de triplo eixo de 100 g / cm e 4cm de rádio-freqüência (RF) bobina de imagem é para ser usado para obter imagens de alta resolução tridimensional (3D). Nota: Certifique-se de suprimentos não-magnéticos ao usar um scanner de ressonância magnética. </li><li> Execute a interface de imagem e selecione &quot;New Study&quot; do menu &quot;Opções de Estudo&quot;. Digite &quot;mtune&quot; na barra de comandos e executá-lo para puxar para cima o &quot;GUI Tune&quot;. Em seguida, selecione &quot;Start Probe Tune&quot; e clique no botão &quot;Escala automática&quot;. A GUI Tune será alterado para mostrar o RFsignal. Use os botões sintonizar / fósforo remotos no final da bobina para ajustar a bobina de RF com a frequência de ressonância do protão (400 MHz). Na guia &quot;Iniciar&quot; ir à página &quot;Prescan&quot; para executar a frequência e capacidade de calibração, clicando nos botões correspondentes. Aperte o botão XYZ (rápida) no &quot;guia&quot; de &quot;Shim Estudo &#39;guia para puxar para cima a página de calços.Vá para a página de correção, selecione todas as iterações, e aperte o botão de correção para realizar auto calços. </li><li> Selecione uma seqüência olheiro na guia &quot;Study&quot; da interface de imagem para localizar o coração mouse. Na guia &quot;Acquire&quot; mudar o FOV a 35 mm 2 e manter as configurações padrão da máquina. Clique em Iniciar para executar a seqüência; ajustar a posição do suporte do animal, se o coração não está no centro do campo de visão, sintonizar a bobina RF e obter as imagens escuteiro novamente. </li><li> Clique no botão seqüência &quot;GEMS&quot; na guia &quot;Estudo&quot;, em seguida, digite os parâmetros de aquisição na aba &quot;Acquire&quot; correspondentes para obter dois planos ortogonais ao longo do eixo curto e eixo longo do coração 20,21. NOTA: os parâmetros de aquisição típicos para uma varredura gradiente-eco são: espessura do corte, a 1 mm; tempo de repetição (TR), a 200 ms; tempo de eco (TE), 2,67 ms (mínimo); ângulo de inclinação de 25 °; inplane tamanho da matriz, de 128 x 128; FOV, 22 milímetros2; número de aquisições, 4; e um tempo de aquisição de cerca de 1 min e 30 seg. </li><li> Na aba &quot;Avançado&quot;, selecione a seqüência &quot;CINE&quot; para recolher os eixos curto cine imagens fechado-oximetria de pulso de RM, a fim de medir os parâmetros anatômicos e funcionais do VE. Ajuste a posição eo ângulo das fatias de imagem baseada na visão de longo eixo do coração por pairando do mouse e arrastando. Digite os seguintes parâmetros de imagem na guia &quot;Acquire&quot; para obter o gradiente echo seqüência cine: TR, a 500 ms; TE, 5 milissegundos; FOV de 22 mm 2; matriz de aquisição, de 256 x 256; espessura de corte, a 1 mm; número de aquisições, 8; número de quadros, 6; e um tempo de aquisição de ~ 17 min. Clique em Iniciar para iniciar a aquisição. </li><li> Converter as imagens adquiridas para o formato DICOM usando a guia &quot;I / O&quot; do software de imagens e transferir os arquivos correspondentes ao centro de dados para processamento. </li><li> No final do procedimento de imagiologia, todosow os ratos para se recuperar da anestesia dentro do filtro-top gaiolas. Não deixe os ratos autônoma até que recuperar a consciência suficiente para manter decúbito esternal e mantê-los para estudos posteriores, conforme necessário. </li></ol> 4. Análise de Dados de Ressonância Magnética Cardíaca Microscopia de imagem <ol><li> Use um software de Segmento de analisar os parâmetros anatômicos e funcionais do VE 19. Ao carregar as imagens no formato DICOM cine para o software usando o &quot;Arquivo de Imagem Aberto (s)&quot; submenu do menu &quot;Arquivo&quot;. Na GUI selecione &#39;MRGE &quot;, como a técnica de imagem,&#39; Cine &#39;, como o tipo de imagem e&#39; de eixo curto médio-ventricular&quot;, como o plano de exibição de imagem. </li><li> Especificar os prazos a serem utilizados para o final de diástole e final da sístole, através da &quot;Definir Prazo atual para Acabar com Diástole&quot; e &quot;Set Prazo atual para Acabar sístole&quot; submenus do menu &quot;Editar&quot;, respectivamente. </li><li>Primeiro, clique no botão de comando &quot;LV&quot; e depois o &quot;PAI&quot; botões de comando no painel inferior direito &quot;ENDO&quot; e desenhar manualmente o endocárdio do ventrículo esquerdo e epicárdio respectivamente. Retire os músculos papilares por apertar o botão de comando correspondente, a fim de aumentar a precisão dos cálculos. </li><li> Leia os parâmetros quantificados LV como volume diastólica, volume sistólico, do volume sistólico e fração de ejeção no painel superior direito. Clique no botão de comando &quot;Diversos&quot; e, em seguida, o botão de comando &quot;Medida Caliper&quot; para medir os parâmetros do LV, como espessura da parede e diâmetro ventricular 22. </li><li> Clique no botão &quot;Salvar Imagem Ambos Pilhas e Segmentação&quot; submenu do menu &quot;Arquivo&quot; para salvar as imagens, incluindo as segmentações, no formato &#39;. Mat&#39; para reprocessar as imagens, se necessário. </li></ol>

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Não foram declarados conflitos de interesses.

Este estudo descreve o procedimento MRM e sua utilidade como uma ferramenta não-invasiva para determinar anormalidades cardíacas em ratos afetados com miocardite auto-imune. Desde as características histológicas de EAM assemelham miocardite pós-infecciosa dos seres humanos, modelos de mouse são comumente empregados para delinear os mecanismos imunológicos de lesão miocárdica 23-25. No entanto, os animais afetados com miocardite aparecem clinicamente normal, eo diagnóstico é feito com base na histologia, ao té...

A insuficiência cardíaca é a principal causa de mortes, e miocardite é uma das causas predominantes de insuficiência cardíaca em jovens adolescentes 1. A maioria dos pacientes afetados com miocardite permanecem assintomáticos e que a doença é resolvida espontaneamente 2. No entanto, 10-20% das pessoas afetadas podem desenvolver doença crônica, levando a cardiomiopatia dilatada (DCM) 3. Vários modelos animais têm sido desenvolvidos para estudar a patogénese imune miocardite. A doença pode ser induzida em miocardite suscetíveis A / J e ratinhos Balb / c através da imunização de animais com miosina cardíaca cadeia pesada (MyHC)-α ou os seus fragmentos de péptidos imunodominantes ou por infecção com agentes patogénicos como vírus coxsackie B3 4-9. Este estudo envolve myhc-α miocardite induzida-334-352 em ratinhos A / J. Apesar de mostrar infiltrações do miocárdio, os animais afetados por miocardite aparecem clinicamente normal; diagnóstico é baseado na avaliação histológica dos corações para a inflamação 7 aª ecocardiografia 10. Microscopia de ressonância magnética (MRM) é um método vulgarmente utilizado para obtenção de imagens de alta resolução cardiovascular com planos tridimensionais, permitindo que a avaliação de detalhes funcionais ao nível dos vasos sanguíneos pequenos (até 10 um de diâmetro), mas este nível de resolução de energia é não alcançável com a rotina de ressonância magnética (MRI) procedimento de digitalização, no qual, a resolução é geralmente obtida até 1 milímetro 11-14. MRM oferece uma vantagem, pois permite a aquisição de imagens de alta resolução e também para obter os parâmetros de desempenho nos momentos iniciais do processo da doença 14. Clinicamente, MRM imagem tem sido amplamente aplicado para estudar os parâmetros funcionais do doente coração, pulmão ou cérebro 15-17. Neste estudo, o uso de uma técnica de MRM como um meio não-invasivo para determinar anomalias cardíacas em ratinhos A / J afectados com miocardite auto-imune é mostrado. Especificamente, tele MRM imagem permite a quantificação dos parâmetros funcionais, tais como ventrículo esquerdo (VE) volume diastólico final e fração de ejeção (EF) com uma precisão razoável 18. As definições dos respectivos parâmetros são: o volume do ventrículo esquerdo que, o volume de sangue no ventrículo esquerdo no final do ciclo diastólica e fração de ejeção, o volume sistólico / volume diastólico final. A análise dos dados é realizada utilizando o software Segmento disponível gratuitamente desenvolvido para DICOM-compliant imagens cardiovasculares processamento adquiridos por scanners de ressonância magnética 19. Os dados revelaram um aumento na espessura da parede do VE nos animais myocarditic, correspondendo a uma diminuição do volume diastólico final do VE, do volume sistólico e fração de ejeção, em comparação com esses parâmetros funcionais em ratos saudáveis.

<table><tbody><tr><td>Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)</td> <td>Neopeptídeo, Cambridge, MA</td><td></td><td>Loja em 4 &# 176; C</td></tr><tr><td>CFA</td><td>Sigma Aldrich, St Louis, MO</td><td>5881</td><td>Loja em 4 &#176; C</td></tr><tr><td>MTB H37Rv extrato</td><td>Difco Laboratories, Detroit, MI</td><td>231141</td><td>Loja em 4 &#176; C</td></tr><tr><td>PT</td><td>List Biologicals Laboratories, Campbell, CA</td><td>181</td><td>Store at 4 &#176; C</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning, Manassas, VA</td><td>21-040-CV</td><td>Loja em 4 &#176; C</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Healthcare, Mumbai, Índia</td><td>NDC66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos fêmeas A / J</td><td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME</td><td>646</td><td></td></tr><tr><td>Seringa estéril Luer-lok de 1 ml</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Seringa estéril Luer-lok de 3 ml</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Agulha estéril, 18 G</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ</td><td></td><td></td>305195</tr><tr><td>Agulha estéril, 27 1/2 G</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>torneira de 3 vias</td><td>Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH</td><td>MX5311L Rolos de</td><td></td></tr><tr><td>atadura de gaze Kerlix</td><td>Covidien, Mansfield, MA</td><td>6720</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Protouch Stockinette</td><td>Medline Industries, Mundelein, IL</td><td>30-1001</td><td></td></tr><tr><td>Tesouras cirúrgicas estéreis e pinças</td><td>INOX tool Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro forno</td><td>GE Healthcare,&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de terapia quente e fria ThermiPAQ&nbsp;</td><td>Theramics Corporation, Springfield, IL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada de aquecimento para répteis</td><td>Energy Savers Unlimited, Inc. Carson, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fitas 3M Transpore</td><td>Target Corporation, MN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Up and Up Polymyxin B sulfato / bacitracina / neomicina sulfato pomada antibiótica</td><td>Target Corporation, MN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>North Safety DeciDamp-2Tampões de ouvido de espuma de PVC</td><td>North Safety Produtos, Smithfield, Aplicador</td> com ponta de algodão RI<td></td><td></td></tr><tr><td>, 6' &rsquo; haste de madeira&nbsp;</td><td>Jorgensen Laboratories, Inc. Loveland, CO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmara de indução de anestesia&nbsp;</td><td>Summit Anesthesia Solutions, Ann Harbor, MI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de suporte de anestesia Summit para regular o fluxo de anestesia&nbsp;</td><td>Summit Anesthesia Solutions, Ann Harbor, MI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suporte de animais especialmente projetado</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bickford&nbsp; Omnicon F/Air&nbsp; unidade de filtro de gás de anestesia</td><td>A.M. Bickford, Inc. Wales Center, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Módulo oxímetro de pulso, sistema de monitoramento e gating de pequenos animais compatível com RM&nbsp;</td><td>Small Animal Instruments, Inc. Stony Brook, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cilindro de oxigênio&nbsp;</td><td>Matheson-Tri Gas, Zona Centro-Norte, Lincoln, NE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Regulador de gás&nbsp;</td><td>Western Medica, West Lake, OH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Módulo de quebra de sinal, sistema de monitoramento e gating de pequenos animais compatível com RM</td><td>Small Animal Instruments, Inc. Stony Brook, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9,4 T (400 MHz) Scanner de RM de furo vertical de núcleo de 89 mm</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bobina de RF de microimagem de milípede de 4 cm</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SAM PC monitor</td><td>Small Animal Instruments, Inc. Stony Brook, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de análise quantitativa de imagens médicas</td><td>http://segment.heiberg.se; &nbsp; Segmento v1.8 R1430,&nbsp; Medviso, região de Oresunds, Suécia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Matlab</td><td>The Mathworks, Inc.&nbsp; Natick, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema operacional</td><td></td><td></td><td></td> Computer-Unix</tr></tbody></table>

avaliação não invasiva da cardiac anormalidades em experimental auto-imune miocardite por ressonância magnética microscopia de imagem no rato

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

Miocardite é uma inflamação do miocárdio, mas apenas ~ 10% dessas manifestações clínicas mostram afetados da doença. Para estudar os eventos imunológicos das lesões do miocárdio, vários modelos de mouse de miocardite têm sido amplamente utilizados. Este estudo envolveu experimental miocardite auto-imune (EAM) induzida com miosina cardíaca cadeia pesada (MyHC)-α 334-352 em camundongos A / J; os animais afetados desenvolvem miocardite linfocítica mas sem sinais clínicos aparentes. Neste modelo, a utilidade de microscopia de ressonância magnética (MRM) como uma modalidade não invasivo para determinar as alterações estruturais e funcionais do coração em animais imunizados com myhc-α 334-352 é mostrada. EAM e ratos saudáveis ​​foram fotografadas usando um 9.4 T (400 MHz) 89 milímetros scanner de núcleo furo vertical, equipado com uma sonda de imagem de rádio-freqüência 4 centímetros centopéia e 100 g / cm gradientes eixos triplos. Imagens cardíacos foram adquiridos a partir de animais anestesiados utilizando uma seqüência de pulsos cine-based gradiente-eco, ea animals foram monitorados pela respiração e oximetria de pulso. A análise revelou um aumento na espessura da parede ventricular em murganhos EAM, com uma diminuição correspondente no diâmetro interior dos ventrículos, quando comparados com os ratos saudáveis. Os dados sugerem que as alterações morfológicas e funcionais nos corações inflamadas pode ser monitorizada de forma não invasiva por MRM em animais vivos. Em conclusão, MRM oferece uma vantagem de avaliar a progressão e a regressão de lesões do miocárdio em doenças causadas por agentes infecciosos, como resposta às terapias.

Neste relatório, a utilidade da técnica MRM como uma modalidade não-invasivo para determinar as mudanças estruturais e funcionais no coração dos animais afetados com EAM é mostrado. Miocardite foi induzida em ratinhos A / J por imunização dos animais com myhc-α 334-352 em CFA 7, e os animais foram submetidos a experiências MRM no dia 21 pós-imunização. A imagiologia foi realizada MRM em animais vivos, sob anestesia de isoflurano em 9,4 T (400 MHz para protões) utilizando um íman 89 milímetros furo vertical eq...

Este estudo demonstra o estabelecimento bem-sucedido da microscopia de ressonância magnética como uma ferramenta não invasiva para avaliar as anormalidades cardíacas em camundongos afetados por miocardite autoimune. Os dados indicam que a técnica pode ser usada para monitorar a progressão da doença em animais vivos.

Avaliação não invasiva da Cardiac Anormalidades em Experimental Auto-imune Miocardite por Ressonância Magnética Microscopia de imagem no Rato

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar anormalidades funcionais cardíacas por meio da obtenção de imagens dos corações em animais vivos afetados por doença cardíaca inflamatória. Isso é realizado primeiramente induzindo a doença, por exemplo, miocardite. O segundo passo é preparar o animal para a imagem por microscopia de ressonância magnética e posicioná-lo no suporte para animais.Em seguida, o camundongo é colocado dentro do ímã para a aquisição das imagens cardíacas. O passo final consiste em analisar os parâmetros funcionais cardíacos utilizando o software Segment. Em última análise, esta técnica é usada para calcular o volume diastólico final e a fração de ejeção em camundongos afetados por miocardite autoimune.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a histopatologia, é que ela é não invasiva e fornece uma visão tridimensional de alta resolução do coração. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de cardiologia envolvendo o diagnóstico de doenças cardíacas inflamatórias. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica enfrentam dificuldades devido à falta de familiaridade com o preparo de animais para a aquisição de imagens por microscopia de ressonância magnética.Portanto, a demonstração visual deste método é essencial. Inicie este protocolo preparando primeiro uma solução peptídica para induzir miocardite autoimune, dissolvendo o peptídeo da cadeia pesada alfa da miosina cardíaca 334 a 352 em solução salina tamponada com fosfato até uma concentração final de dois miligramas por 1,5 mililitro. Em seguida, prepare a toxina da coqueluche adicionando um mililitro de solução salina tamponada com fosfato estéril 1x a um frasco contendo 50 microgramas de toxina da coqueluche liofilizada.Para obter uma concentração estoque de 50 nanogramas por microlitro. Em seguida, retire 20 microlitros do estoque em um tubo estéril de 1,5 mililitro e adicione 980 microlitros de solução salina tamponada com fosfato estéril 1x para obter uma concentração de trabalho de 1 nanograma por microlitro. Prepare também o adjuvante completo de Freund ou CFA, adicionando 40 miligramas de extrato de Mycobacterium tuberculosis H37RV ou MTB a 10 mililitros de CFA para obter uma concentração final de 5 miligramas por mililitro.Agora prepare a emulsão de CFA para preparar uma alíquota de 1,5 mililitro de emulsão: coloque 750 microlitros da solução do pept&ídio da cadeia pesada alfa da miosina cardíaca, pept&ídio 3 34 a 3 52, em um tubo de 1,5 mililitro e al&íquot;e um volume igual de CFA suplementado com extrato de MTB em outro tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, utilizando uma seringa de 3 mililitros com trava de encaixe, aspire primeiro a solução do pept&ídio, seguida pelo extrato de C-F-A-M-T-B. Fixe a seringa a uma válvula de três vias e conecte a outra sa&íacute;da da válvula a uma seringa vazia de 3 mililitros.Ajuste o lúmen aberto do tubo de conexão. De modo que a mistura de peptídeo e adjuvante completo de Freund flua de uma seringa para a outra com resistência razoavelmente boa. Misture empurrando o conteúdo de uma seringa para a outra repetidamente por cerca de um minuto, e então coloque todo o conjunto em gelo por aproximadamente três minutos.Repita este procedimento no mínimo 10 vezes. Determine a consistência da emulsão colocando cuidadosamente uma pequena gota em água parada em um copo de vidro de 100 mililitros. A gota não deve se dispersar na água; caso contrário, continue misturando até que a consistência desejada seja alcançada.Transfira o conteúdo da emulsão de três seringas de três mililitros para uma seringa de um mililitro. Conecte a seringa de um mililitro substituindo uma das duas seringas de três mililitros ligadas à torneira de três vias pela seringa de um mililitro. Em seguida, acople uma agulha de 27 e meia polegadas.Injete 150 microlitros da emulsão de peptídeo CFA em doses divididas por via subcutânea nas duas regiões inguinais de camundongos fêmeas aj de seis a oito semanas de idade. Em seguida, administre 100 microlitros de suspensão de toxina da pertússis por via intraperitoneal a cada animal no dia zero e no dia dois após a imunização. Repita o procedimento de imunização no dia sete, administrando 150 microlitros da emulsão de peptídeo CFA em doses divididas por via subcutânea em ambos os lados do esterno.Prepare esta emulsão fresca conforme descrito. Em seguida, no dia 21, submeta os animais à imagem por RMI para preparação para a aquisição de imagens. Primeiro, coloque cada camundongo em uma câmara de indução anestésica contendo uma mistura de ar com 2% de ISO e um tapete aquecido para manter o calor.Em seguida, transfira o animal para um suporte para animais especialmente projetado. Fixe a cabeça com uma barra de mordida para imobilizar o animal em posição prona. O focinho deve encaixar-se no cone nasal para manter a anestesia.Ligue o aquecedor de ar com sua mangueira de saída inserida na placa vertical do scanner para manter a temperatura corporal do animal durante o experimento. Mantenha a anestesia com 1 a 2% de isoflurano com uma taxa de fluxo de dois mililitros por minuto durante toda a sessão de imagem. Confirme a anestesia realizando um aperto no dedo do pé.Em seguida, configure um sensor pneumático de almofada e uma sonda de temperatura retal para monitorar a respiração e a temperatura corporal durante toda a sessão de imagem. Um sensor de oximetria de pulso de fibra óptica também deve ser fixado no tornozelo esquerdo, e o pé deve ser imobilizado com um laço de fio e fixado com fita adesiva para manter a posição. A aquisição de imagens será realizada por meio do sincronismo dos sinais respiratório e cardíaco, sem o uso de agentes de contraste.Um magneto vertical de 9,4 Tesla com furo largo deve ser utilizado para obter imagens tridimensionais de microscopia por ressonância magnética de alta resolução. Após preparar o animal, posicione o camundongo no escâner com o coração no centro do campo de visão. Em seguida, execute a interface de imagem, selecione o novo tipo de estudo no menu na barra de comandos, abra a página de ajuste e selecione iniciar sonda, ajuste e escala automática.Use os botões de ajuste remoto no final da bobina para sintonizar a bobina de RF na frequência de ressonância do próton de 400 megahertz. Em seguida, vá até a página de pré-varredura. Para executar a calibração de frequência e potência, pressione o botão rápido X, Y, Z para abrir a página de shim.Em seguida, selecione todas as iterações e realize o shim automático. Selecione uma sequência de reconhecimento. Altere o campo de visão para 35 milímetros.Mantenha as outras configurações padrão e execute a sequência. Se o coração não estiver no centro do campo de visão, ajuste a posição do suporte do animal, reajuste a bobina de RF e reaquisicione a imagem de orientação. Em seguida, selecione a sequência gem.Insira os parâmetros de aquisição mostrados aqui na guia "aquisição" para obter dois planos ortogonais ao longo dos eixos curto e longo do coração. Em seguida, selecione a sequência cine para coletar as imagens cine do eixo curto com oximetria de pulso e mensurar os parâmetros anatômicos e funcionais do ventrículo esquerdo. Insira os parâmetros mostrados aqui para obter a sequência cine de gradiente eco.Ajuste a posição e o ângulo dos cortes de imagem com base na visão do eixo longo do coração. Em seguida, execute a sequência. Após a conclusão da aquisição de imagens.Converta as imagens adquiridas para o formato DICOM utilizando a guia IO e transfira os arquivos correspondentes para o centro de dados para processamento. Ao final do procedimento de imagem, permita que o animal se recupere da anestesia dentro de uma gaiola com tampa filtrada. Não deixe o camundongo sozinho até que ele recupere consciência suficiente para manter a posição esternal recumbente.Aqui, utiliza-se um software de segmentação para analisar os parâmetros anatômicos e funcionais do ventrículo esquerdo. Comece carregando as imagens dinâmicas no formato DICOM no software. Em seguida, selecione MRGE como a técnica de imagem, dinâmica como o tipo de imagem e eixo curto no nível mesocavitário ventricular.Como plano da imagem, especifique os intervalos de tempo a serem utilizados para o final da diástole e o final da sístole usando os submenus definir intervalo de tempo atual como final da diástole e definir intervalo de tempo atual como final da sístole do menu editar, respectivamente. Em seguida, use os botões de comando VE e depois endo e EPI no painel inferior direito. Para desenhar manualmente o ventrículo esquerdo, endocárdio e epicárdio, respectivamente, remova os músculos papilares pressionando o botão de comando correspondente.Para aumentar a precisão dos cálculos, leia os parâmetros quantificados do ventrículo esquerdo, como volume diastólico, volume sistólico, volume sistólico e fração de ejeção, no painel superior direito. Em seguida, use o botão de comando mis e depois o botão de comando do paquímetro de medição para medir os parâmetros do ventrículo esquerdo, como espessura da parede e diâmetro ventricular. Por fim, certifique-se de usar a opção salvar ambas as pilhas de imagens e a segmentação para salvar as imagens, incluindo as segmentações em formato dot mat, a fim de reprocessar as imagens conforme necessário.O ângulo no qual o coração foi seccionado para a aquisição da imagem na vista de duas câmaras pode ser visto aqui. Aqui podemos observar um aumento aproximado de 1,5 vez na espessura do ventrículo esquerdo, indicando defeitos estruturais nos corações de camundongos afetados pela miocardite autoimune em comparação com camundongos saudáveis. O débito cardíaco, medido com base no volume diastólico e na fração de ejeção do ventrículo esquerdo, foi reduzido em camundongos afetados pela miocardite autoimune em comparação com camundongos saudáveis.Por fim, os corações dos grupos tratados acima foram avaliados quanto à inflamação por meio da coloração com hematoxilina e eosina. A avaliação histológica dos corações de camundongos com miocardite, mas não dos saudáveis, revelou infiltrados multifocais de linfócitos. Ao realizar este procedimento, é importante garantir que a temperatura corporal do animal permaneça constante, para que a frequência cardíaca e a frequência respiratória não se alterem significativamente durante os experimentos. Isso é essencial para obter resultados reprodutíveis.Após assistir a este vídeo, você deverá ter um bom entendimento da técnica de microscopia por ressonância magnética para avaliar as anormalidades funcionais de doenças cardíacas inflamatórias como a miocardite em camundongos. Mas não se esqueça de que trabalhar com campos magnéticos elevados pode ser extremamente perigoso, portanto o suporte para o animal e outros componentes devem ser não magnéticos.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Alta freqüência de ultra-som Doppler é uma nova tecnologia para avaliar a função miocárdica regional. Este trabalho apresenta primeira evidência demonstrando aplicabilidade desta plataforma de imagem versátil para a medida repetida de tensão do miocárdio, dp / dt, e regurgitação mitral na isquemia-reperfundidos coração (IR) murina.

De alta freqüência Ecocardiografia de alta resolução: primeira evidência de não-invasivos Medida repetida de Strain miocárdico, contratilidade, e regurgitação mitral no coração Isquemia-reperfundidos murino

A ressonância magnética cardíaca maior contraste (CMR) permite...

Avaliação da função cardíaca e Morfologia do miocárdio Usando Pequenos Animais Inversion Recovery Olha-locker (SALLI) MRI em ratos

Descrevemos como realizar imagens de ressonância magnética e PET do coração do camundongo. O protocolo é adaptado para avaliar a eficácia do tratamento em modelos de infarto do miocárdio e insuficiência cardíaca.

Ressonância magnética e PET no rato modelos de Infarto do Miocárdio

Este método descreve o uso da Microtomografia Computadorizada Quântica (MicroCT) para avaliar a morfologia, função, perfusão, metabolismo e viabilidade cardíaca com contraste iodado em camundongos com isquemia miocárdica induzida experimentalmente. A técnica pode ser aplicada para imagens longitudinais in vivo não destrutivas de alto rendimento de vários modelos animais de doenças cardíacas humanas.

In Vivo quantitativa Avaliação da Estrutura do miocárdio, função, perfusão e viabilidade Usando Cardiac Micro-Tomografia Computadorizada

Exame ecocardiográfico é frequentemente usada em ratos. Aparelhos de ultra-som de alta resolução caro foram desenvolvidos para esta finalidade. Este protocolo descreve um procedimento ecocardiográfico acessível, combinado com análises morfométricas histológica para determinar a morfologia cardíaca.

Exame ecocardiográfico e histológico da morfologia cardíaca no Mouse

Este estudo descreve um protocolo abrangente de ressonância magnética cardiovascular (RMC) para quantificar os parâmetros funcionais ventriculares esquerdos do coração do camundongo. O protocolo descreve a aquisição, pós-processamento e análise das imagens da RMC, bem como a avaliação de diferentes parâmetros funcionais cardíacos.

Quantificação da função ventricular esquerda do coração do rato, tensão do miocárdio e forças hemodinâmicas por ressonância magnética cardiovascular

Relatamos um método para reconstrução mesoscópica de todo o coração do rato, combinando novos avanços na transformação e coloração de tecidos com o desenvolvimento de um microscópio de folha de luz digitalizado axialmente.

Imagem óptica mesoscópica do coração de todo o rato

Descrevemos um método simples e reprodutível que pode induzir infarto do miocárdio ou lesão de isquemia-reperfusão miocárdica em camundongos por ligadura precisa da artéria coronária descendente anterior esquerda através de micromanipulação.

Indução de Infarto do Miocárdio e Lesão de Isquemia-Reperfusão Miocárdica em Camundongos

A reconstrução tridimensional (3D) do dano cardíaco no infarto agudo do miocárdio reperfundido (repIAM) permite a quantificação fiel e a co-localização dos padrões associados que afetam a doença. Aqui, uma abordagem de imagem guiada por folha de luz automatizável é fornecida para medição contemporânea de danos cardíacos, área de risco e resposta de células imunes.

Análise 3D Simultânea de Dano Cardíaco e Resposta Imune em Infarto Agudo do Miocárdio Reperfundido Usando Microscopia de Fluorescência de Folha de Luz

Um método preciso e prático para medir parâmetros como a tensão no tecido do miocárdio é de grande valor clínico, uma vez que tem sido demonstrado, que a tensão é um marcador mais sensível e mais cedo para a disfunção contrátil do que o parâmetro freqüentemente usado EF.

Avaliação Strain Ressonância Magnética Derivado do Miocárdio Usando o controle de recursos

Aprenda a avaliar anormalidades cardíacas em camundongos com miocardite autoimune usando ressonância magnética microscópica não invasiva. Este método permite monitorar a progressão da doença em animais vivos.

Avaliação não invasiva da Cardiac Anormalidades em Experimental Auto-imune Miocardite por Ressonância Magnética Microscopia de imagem no Rato (Vídeo) | JoVE Journal

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