Coleta e Extração de DNA de saliva para Next Generation Sequencing

Resumo

A extração de DNA da saliva pode fornecer uma fonte prontamente disponível de DNA de alto peso molecular, com pouca ou nenhuma degradação/fragmentação. Este protocolo fornece parâmetros otimizados para coleta/armazenamento de saliva e extração de DNA para qualidade e quantidade suficientes para ensaios de DNA a jusante com requisitos de alta qualidade.

Resumo

A fonte preferida de DNA na pesquisa de genética humana é o sangue, ou linhagens celulares derivadas do sangue, pois essas fontes produzem grandes quantidades de DNA de alta qualidade. No entanto, a extração de DNA da saliva pode produzir DNA de alta qualidade com pouca ou nenhuma degradação/fragmentação, que é adequado para uma variedade de ensaios de DNA sem a despesa de um flebotomista e pode até ser adquirido pelo correio. No entanto, até o momento, nenhum protocolo de coleta/extração de DNA de saliva para sequenciamento de próxima geração foi apresentado na literatura. Este protocolo otimiza os parâmetros de coleta/armazenamento de saliva e extração de DNA para serem de qualidade e quantidade suficientes para ensaios de DNA com os mais altos padrões, incluindo genotipagem de microarray e sequenciamento de próxima geração.

Introdução

A obtenção de DNA de alta qualidade para estudos genéticos humanos, é essencial no processo de descoberta do gene da doença. Sangue, embora exigindo um procedimento invasivo e também a ser mais caro do que a coleta da saliva, é favorecido para a criação de linhas de células imortalizadas como uma fonte infinita de DNA, ou iPSCs para estudos funcionais e, às vezes DNA do sangue é usado quando as linhas celulares não estão disponíveis. No entanto, a obtenção de sangue requer um flebotomista treinado e sangue tem uma meia-vida mais curta do que a saliva ^1. DNA de saliva é mais barata e mais fácil de obter, uma vez que podem ser coletadas e enviadas pelo correio, sem a necessidade de um phlebotomist, aumentando, assim, potenciais piscinas sujeitas bem além da área de abrangência de hospitais e laboratórios ^2. Inclusão no estudo pode ser melhorada quando os indivíduos têm a opção de dar uma amostra de saliva em vez de sangue ^{3, 4.} Preocupações sobre a quantidade e qualidade de DNA de saliva pode ter limitado a sua generalizada nose apesar de diversos estudos recentes estudos que comprovem a adequação de toda saliva, com uma média de 4,3 x 10 ⁵ células por mililitro, para testes de DNA ao longo dos mais antigos métodos de cotonetes bucais que não obtiveram uma quantidade significativa de saliva ^{2, 3, 4, 5, 6.} Embora exista uma literatura modesta mostrando a adequação de DNA derivado saliva inteiro para aplicações de genotipagem incluindo métodos baseados em microarrays ^{8, 9, 10,} nenhum estudo examinou sequenciamento de próxima geração (NGS). O objetivo de otimização deste protocolo toda a extração de DNA de saliva era maximizar quantidade e qualidade para aplicações de genética de uma forma rentável que pode ser facilmente implementado em laboratórios com reagentes e consumíveis comuns.

Extracção de DNA a partir da saliva requer vários procedimentos: 1) a recolha e armazenamento, 2) lise celular, 3) tratamento com RNase, 4) precipitação de proteínas, 5) precipitação com etanol, 6) de re-hidratação de ADN. A solução de DNA Estabilização tampão, descrito² anteriormente, funciona adequadamente sem alteração. Nenhuma tentativa foi feita para otimizar o tratamento RNase e etapas de reidratação de DNA. Para cada etapa restante, foram identificadas diversas variáveis ​​que podem afetar o rendimento. Cada variável foi manipulado individualmente e melhoria na produtividade e qualidade foi avaliada estatisticamente. Para as variáveis ​​que foram mostrados para melhorar a produtividade e / ou qualidade do DNA, os valores ótimos foram incluídos no protocolo final.

Protocolo

NOTA: Antes de fornecer amostras de saliva todos os sujeitos deram consentimento informado em conformidade com as diretrizes para o tratamento de seres humanos do Hospital Nacional Infantil.

1. Saliva coleta e armazenamento

1. Antes da coleta de saliva, garantir que a boca do tema é livre de alimentos ou outras substâncias estranhas, tendo o assunto lavar a boca com água e evitar comer ou beber por 30 minutos antes de coletar a amostra.
2. Abrir um tubo de centrífuga de 15 ml com 2,5 ml de tampão de estabilização de DNA ² certificando-se de evitar tocar no interior da tampa ou do tubo, e o sujeito tem cuspir 2,5 ml de saliva na solução-tampão. Nota: Recolha de mais de 2,5 ml de saliva pode levar à degradação da amostra a partir de uma proporção suficiente de amostra para tampão de estabilização do ADN. Coleta de muito pouca saliva irá reduzir os rendimentos esperados do protocolo. Para avaliar volumes da coleção, use os gradientes numeradas no lado de tele tubo.
3. Recoloque a tampa e misturar por inversão até que a mistura é homogeneizada. A agitação vigorosa não é necessário. Armazenar as amostras a temperatura ambiente durante o armazenamento a curto prazo ou a 4 ° C para armazenamento a longo prazo (> 3 meses).

2. Preparativos Iniciais e lise celular

1. Antes de iniciar a extração, aqueça um banho de água a 37 ° C, e preparar um balde de gelo. Três tubos de 15 ml de centrífuga cônicos serão necessários para cada amostra extraída. Os três tubos será utilizado para conter o sedimento de células e de proteínas, a final ADNg extraída, e os sobrenadantes de isopropanol e etanol.
2. Recuperar amostras de armazenamento e amostras inverta várias vezes em seguida, vortex em velocidade média por 15 segundos.
3. Dispense 2,5 ml da amostra num tubo de centrífuga de 15 ml limpo, e adicionar 5 ml de solução de lise celular. Misturar a amostra 50 vezes por inversão, e incubar à temperatura ambiente durante 30 min.

Remoção 3 RNA

1. Adicionar 40 ul de ARNase A Solbuição de 100 mg / ml, e incubar a 37 ° C durante 15 min.
2. Retirar a amostra a partir da 37 ° C e banho de água fria no gelo por 3 min.
   1. Após a incubação com RNase A, aumentar a temperatura do banho de água a 65 ° C durante o passo de rehidratação ADN do protocolo.

4. Protein e remoção de lipídeos

1. Adicionam-se 50 ul de proteinase K a solução de 20 mg / mL, misturar várias vezes por inversão, e incubar à temperatura ambiente durante um mínimo de 30 min. Nota: Este é um possível ponto de pausa para o protocolo. Após a adição da solução de proteinase K, a amostra pode ser armazenada a 4 ° C até que a extracção pode ser concluído. O armazenamento a 4 ° C durante até 24 h não foi demonstrado ter um efeito significativo sobre os rendimentos de extracção ou a qualidade do DNA. Armazenamento de longo prazo nesta fase não foi avaliado.
2. Adicionar 1,7 ml de solução de precipitação de proteína, vortex vigorosamente durante 20 segundos a alta velocidade, e colocar em gelo durante 10 min.
3. Uma vez que as amostras foram arrefecidas em gelo durante 10 minutos, centrifuga-se durante 10 min a 3000 xg e 4 ° C. As proteínas precipitadas deve formar um sedimento apertado para continuar. Se a pastilha não é apertado ou a solução está ainda turva, as amostras podem ser arrefecida em gelo durante 5 minutos e mais de centrifugação repetida. As amostras devem ser mantidas em gelo para garantir uma bolinha apertado.

5 Isolamento e purificação de ADNg

1. Num tubo de centrífuga de 15 ml limpo, pipeta de 5 ml de isopropanol e 8 ul de solução do glicogénio puro a 20 mg / ml.
2. Verter o sobrenadante contendo o ADNg do passo 4.3 para dentro do tubo que contém a solução de isopropanol e do glicogénio, deixando para trás a proteína precipitada. Uma vez que tenha sido adicionado ao sobrenadante, misturar delicadamente a amostra 50 vezes por inversão e centrifuga-se durante 30 min a 3000 xg e 4 ° C.
3. Verter o sobrenadante lentamente para um tubo limpo de 15 ml. Após a remoção do sobrenadante, adicionar 1 ml de etanol a 70% paralavar o sedimento por balanço e lentamente movendo-se delicadamente sobre o etanol o sedimento precipitado várias vezes. Reter o etanol no tubo.
4. Após a lavagem inicial, centrifugar a amostra durante 1 min a 2000 xg e 20 ° C. Este passo de centrifugação pode ser feito em cada 4 ° C ou 20 ° C. Não houve efeito significativo da temperatura tem sido demonstrado para esta etapa.
5. Após a lavagem e centrifugação inicial da pastilha, verter lentamente a lavagem com etanol a partir do tubo e descarte, em seguida, executar uma segunda lavagem, repetindo os passos 5.3 e 5.4.
6. Após a remoção do sobrenadante a partir da segunda lavagem, o sedimento de permitir secar ao ar durante 15 min.
   1. Se a amostra não estiver completamente seca, o ar seco durante mais 15 min.

6. Reidratação de gDNA

1. Uma vez que a amostra tenha secado, adicionar 300 ul de Tris-EDTA para re-hidratar a pastilha seca ADNg.
2. Vortex da amostra durante 5 segundos em velocidade média e coloque em um65 ° C num banho de água quente durante 1 hora.
3. Retirar as amostras do banho-maria e incubar O / N à temperatura ambiente.
   NOTA: Todos os produtos e reagentes utilizados estão listados na tabela de materiais, bem como a Tabela 4.

Resultados

Para determinar parâmetros ótimos para Extração de DNA de uma série de extrações de DNA pareadas foi realizada. Uma única amostra de saliva foi dividido e cada porção ensaiada por um dos dois valores possíveis para uma determinada variável. Pelo menos oito repetições de cada teste emparelhado foram realizadas (por exemplo, uma única amostra de saliva foi dividido em alíquotas para testar a extracção com e sem inicial de incubação de 50 ° C). Otimização foi baseada em quatro métricas padrão: produção total de DN...

Discussão

O presente procedimento é um protocolo de extração de DNA otimizado, que melhorou consideravelmente o rendimento de DNA de alto peso molecular em comparação com os métodos convencionais, sem comprometer a qualidade do DNA. O passo crítico com o maior efeito sobre o rendimento mais foi o passo 5.2, que inclui uma etapa de centrifugação durante a precipitação mais etanol do que qualquer protocolo publicado aqui analisados, com exceção de um que não foi amplamente distribuído ^11. Nenhuma alteração na qualidade d...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de centrífuga de 15 ml	Fisher	12-565-268
Solução de lise celular	Qiagen	158908
Proteinase K	Sigma	P6556
Solução de precipitação de proteína	Qiagen	158912
Isopropanol	Fisher	A416-4
Glicogênio	EZ-BioResearch	S1003
70% Etanol	Fisher	04-355-305
Tris-EDTA (TE)	Fisher	BP2473-1
NaCl	Fisher	AC194090010
Tris HCl	Fisher	BP1757-100
EDTA (0.5 M) Solução	Fisher	03-500-506
Dodecil Sulfato de Sódio	Fisher	BP166-100
Misturador de vórtice analógico	Fisher	02-215-365
Centrífuga 5810R	Eppendorf	5811 000.010