A extração de DNA da saliva pode fornecer uma fonte prontamente disponível de DNA de alto peso molecular, com pouca ou nenhuma degradação/fragmentação. Este protocolo fornece parâmetros otimizados para coleta/armazenamento de saliva e extração de DNA para qualidade e quantidade suficientes para ensaios de DNA a jusante com requisitos de alta qualidade.
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Artigo de método
Coleta e Extração de DNA de saliva para Next Generation Sequencing
Neste artigo
Resumo
Resumo
A fonte preferida de DNA na pesquisa de genética humana é o sangue, ou linhagens celulares derivadas do sangue, pois essas fontes produzem grandes quantidades de DNA de alta qualidade. No entanto, a extração de DNA da saliva pode produzir DNA de alta qualidade com pouca ou nenhuma degradação/fragmentação, que é adequado para uma variedade de ensaios de DNA sem a despesa de um flebotomista e pode até ser adquirido pelo correio. No entanto, até o momento, nenhum protocolo de coleta/extração de DNA de saliva para sequenciamento de próxima geração foi apresentado na literatura. Este protocolo otimiza os parâmetros de coleta/armazenamento de saliva e extração de DNA para serem de qualidade e quantidade suficientes para ensaios de DNA com os mais altos padrões, incluindo genotipagem de microarray e sequenciamento de próxima geração.
Introdução
A obtenção de DNA de alta qualidade para estudos genéticos humanos, é essencial no processo de descoberta do gene da doença. Sangue, embora exigindo um procedimento invasivo e também a ser mais caro do que a coleta da saliva, é favorecido para a criação de linhas de células imortalizadas como uma fonte infinita de DNA, ou iPSCs para estudos funcionais e, às vezes DNA do sangue é usado quando as linhas celulares não estão disponíveis. No entanto, a obtenção de sangue requer um flebotomista treinado e sangue tem uma meia-vida mais curta do que a saliva 1. DNA de saliva é mais barata e mais fácil de obter, uma vez que podem ser coletadas e enviadas pelo corre....
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Protocolo
NOTA: Antes de fornecer amostras de saliva todos os sujeitos deram consentimento informado em conformidade com as diretrizes para o tratamento de seres humanos do Hospital Nacional Infantil.
1. Saliva coleta e armazenamento
- Antes da coleta de saliva, garantir que a boca do tema é livre de alimentos ou outras substâncias estranhas, tendo o assunto lavar a boca com água e evitar comer ou beber por 30 minutos antes de coletar a amostra.
- Abrir um tubo de centrífuga de 15 ml com 2,5 ml de tampão de estabilização de DNA 2 certificando-se de evitar tocar no interior da tampa ou do tubo, e o sujeito tem cuspir 2,5 ml de saliva na soluç....
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Resultados
Para determinar parâmetros ótimos para Extração de DNA de uma série de extrações de DNA pareadas foi realizada. Uma única amostra de saliva foi dividido e cada porção ensaiada por um dos dois valores possíveis para uma determinada variável. Pelo menos oito repetições de cada teste emparelhado foram realizadas (por exemplo, uma única amostra de saliva foi dividido em alíquotas para testar a extracção com e sem inicial de incubação de 50 ° C). Otimização foi baseada em quatro métricas padrão: produção total de DN.......
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Discussão
O presente procedimento é um protocolo de extração de DNA otimizado, que melhorou consideravelmente o rendimento de DNA de alto peso molecular em comparação com os métodos convencionais, sem comprometer a qualidade do DNA. O passo crítico com o maior efeito sobre o rendimento mais foi o passo 5.2, que inclui uma etapa de centrifugação durante a precipitação mais etanol do que qualquer protocolo publicado aqui analisados, com exceção de um que não foi amplamente distribuído 11. Nenhuma alteração na qualidade d.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por um National Institutes of Health R01 (DC009453 apoio ao CWB).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de centrífuga de 15 ml | Fisher | 12-565-268 | |
| Solução de lise celular | Qiagen | 158908 | |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | |
| Solução de precipitação de proteína | Qiagen | 158912 | |
| Isopropanol | Fisher | A416-4 | |
| Glicogênio | EZ-BioResearch | S1003 | |
| 70% Etanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 | |
| NaCl | Fisher | AC194090010 | |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 | |
| EDTA (0.5 M) Solução | Fisher | 03-500-506 | |
| Dodecil Sulfato de Sódio | Fisher | BP166-100 | |
| Misturador de vórtice analógico | Fisher | 02-215-365 | |
| Centrífuga 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |
Referências
- Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies. Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).
- Min, J. L., et al.
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Reimpressões e permissões
